CHAPITRE Y

CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES

Les microbes sont aérobies ou anaérobies. Nous définirons ces termes au chapitre vi (p. 162). L’immense majorité des microbes est aérobie ; ce chapitre, exclusivement consacré à la culture et à l’isolement de ceux-ci, constitue donc une étude de la technique la plus courante.

| 1. — Culture des aérobies

Nous supposons d’abord qu’on possède une culture pure, et qu’on veut la propager. Lorsqu’on tient à conserver une culture vivante et virulente , il faut assez fréquemment la reporter en milieu nutritif neuf. C’est ce qu’on appelle le r&ensemencement ou encore le repiquage , s’il s’agit de cultures solides.

Le microbe, en effet, arrive rapidement à user le milieu nutritif dans lequel il végète, par un double mécanisme : il utilise des substances nutritives qui finissent par manquer, et il déverse autour de lui des produits solubles qui modifient la composition du milieu au point de le rendre inhabitable. A ce moment, le microbe souffre, devient moins vivace, perd sa virulence, et finit par mourir. Il faut donc, sans attendre cette période de vieillesse, régénérer la culture en en transportant une parcelle dans un milieu nutritif neuf. Le temps au bout duquel une culture doit être régénérée est excessivement variable suivant le microbe, le milieu employé, la température ambiante, etc. Dune façon générale, une culture en milieu liquide doit être réensemencée tous les six ou huit jours environ ; une culture en milieu solide, tous les quinze jours ou

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tous les mois ; mais, nous le répétons, il n’y a pas de règle. Il vaut toujours mieux pêcher par excès de zèle, et régénérer ses cultures le plus souvent possible. Certains microbes sont très difficiles à conserver vivants et virulents, tels le Pneumocoque , le Gonocoque, etc., d’autres sont très vivaces : Bacille de la tuberculose, etc. Les microbes qui se reproduisent par sporulation (Bactéridie charbonneuse), sont naturellement plus résistants que les autres.

1° Cultures ordinaires en milieux liquides. — Nous supposons qu’on veut ensemencer un ballon chargé de bouillon stérilisé avec une goutte de culture liquide ou une parcelle de culture solide. Nous savons déjà (voir ch. iii, p. 81) comment on obtient des ballons chargés de bouillon stérile ; ceux-ci devront toujours avoir été préalablement éprouvés à -f 38°, et être restés clairs après vingt-quatre heures d’exposition ; nous avons décrit la pipette de Pasteur et l’aiguille de platine (p. 20 et 21, fig. 8 et 9); avec une lampe à alcool ou un bec Bunsen, l’outillage sera complet.

Il faut d’abord stériliser la pipette ou l’aiguille de platine. La pipette, déjà stérilisée au four Pasteur, est flambée, d’abord du côté du coton qui doit être mis à la bouche, puis tout le long de la partie effilée ; on casse alors la pointe avec une pince flambée, et on stérilise à nouveau la surface de section.

Quelques expérimentateurs (J. Colrmont) recommandent de courber à angle droit la partie effilée. Il faut conserver une longueur de tube effilé au moins égale à la profondeur du récipient dans lequel on doit puiser la semence. Cette courbure a pour but d’empêcher la bouche et la barbe de l’expérimentateur d’être situées, pendant les opérations, dans l’axe de l’orifice ouvert des récipients ; elle n’est pas indispensable. Il faudra tenir la pipette en l’air jusqu’à complet refroidissement avant de s’en servir, sous peine de stériliser au passage la semence puisée.

L’aiguille de platine sera portée au rouge d’un bout à l’autre ; on attendra également qu’elle soit refroidie pour l’employer; les aiguilles faites avec un fil un peu épais restent chaudes assez longtemps.

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L’aiguille de platine oula pipette, stérilisées et refroidies, seront conservées entre deux doigts de la main droite ou saisies avec les lèvres par l’extrémité qui ne plongera pas dans les liquides, ou encore déposées sur deux porte-couteaux en verre flambés.

11 faut alors déboucher le récipient contenant la semence. On le saisit avec la main gauche et on l’incline aussi horizontalement que possible; la main droite le débouche. S’il faut enlever un tampon de ouate avec une pince, il est préférable de porter la pipette ou l'aiguille aux lèvres et d’avoir toute la main droite libre : si le ballon est bouché avec un capuchon de papier, on saisit simplement l’extrémité supérieure de celui-ci avec deux doigts libres de la main droite qui a conservé la pipette. On fait alors passer ouate ou capuchon entre deux doigts de la main gauche qui les tiendront pendant toute l’opération, en même temps que le récipient (fig. 68). Les capuchons de papier pourront être maintenus verticaux, l’ouverture en bas, comme le montre la figure 68.

On flambe alors le goulot du récipient, en le passant deux ou trois fois dans la flamme, et on le maintient aussi immobile que possible, dans la position horizontale, pour empêcher l’introduction des germes de l’atmosphère.

La main droite fait passer rapidement une dernière fois l’extrémité effilée de la pipette ou l’aiguille dans la flamme et la plonge dans la culture.

S’il s’agit de culture solide, on gratte légèrement la surface avec l’aiguille de platine ; s’il s’agit de culture liquide, la capillarité suffit à faire monter quelques gouttes dans la pipette. L'aspiration par la bouche est utilisée lorsqu’on veut prélever une quantité plus notable de culture (examen microscopique, plusieurs ensemencements successifs, etc.).

On retire alors aiguille ou pipette, en ayant soin de ne pas heurter les parois du goulot, et on referme le récipient après avoir flambé le goulot ; on flambera aussi mais légèrement le tampon de ouate. Le capuchon en papier, maintenu bien vertical depuis l’ouverture, n’a pas besoin d’être flambé. Lorsqu’on a prélevé une quantité assez notable de bouillon de culture avec la pipette, il faut éviter que des gouttes de semence ne

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s’échappent en coulant avant le réensemencement ; il suffit pour cela de boucher l’orifice supérieur de la pipette soit avec l’extrémité de l'index droit, soit avec celle de la langue, si la pipette est maintenue avec les lèvres.

La main gauche redresse alors le récipient qui contenait la culture, le repose sur la table et prend de même le ballon de bouillon qui doit être ensemencé. La série des opérations est la même jusqu’au moment où la pipette ou l’aiguille plongent

Fig. 68.

Ensemencement de ballon en ballon.

dans le ballon. 11 suffit alors de laisser tomber une goutte de la pipette dans le bouillon ou d’agiter l’aiguille chargée de semence : il est quelquefois nécessaire de souffler avec la bouche dans la pipette. On retire la pipette ou l’aiguille, on flambe le goulot et on rebouche. L’aiguille ou la pipette sont aussitôt portées dans la flamme, pour détruire les germes non employés de la semence.

On collera immédiatement une étiquette sur le ballon ensemencé ; celle-ci devra indiquer d’une façon précise le nom du microbe ensemencé, la date de l’ensemencement, le nombre des générations précédentes et toutes les indications particulières nécessaires, il faut savoir que les étiquettes se décollent facilement sous l'influence de la chaleur de l’étuve ; on peut écrire directement sur le verre.

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Le ballon ensemencé est alors porté à l’étuve à température convenable. Lorsqu’on désire simplement propager des cultures, il est préférable de ne pas les laisser trop longtemps à l’étuve ou la végétation marche trop vite; dès que le trouble est manifeste, on transporte le ballon dans une armoire bien fermée du laboratoire1 II.

Toutes les notions précédentes se rapportent à l'ensemencement dans un milieu liquide quelconque d’une culture dont la prise vient d’être faite immédiatement. Si l’ensemencement est tardif , c'est-à-dire si la semence, puisée dans un culture ou dans un produit pathologique (pus, sérosité, sang, etc.) recueilli aseptiquement, a été enfermée dans une pipette, et celle-ci scellée ensuite à la lampe, il faut un tour de main spécial pour ensemencer un ballon avec succès bien qu’avec asepsie. La surface extérieure de la pipette a été contaminée par les germes de l’atmosphère, des doigts, des objets, etc. Si on stérilise cette surface à la chaleur, on risque de détruire la semence incluse ; si on stérilise avec un antiseptique, on ajoute forcément des traces de ce dernier au bouillon qui peut alors devenir impropre à la culture ; d’autre part, la stérilisation n’est rien moins que sûre. 11 faut laver d’abord l’ex-

trémité de la pipette au sublimé 1-^, rincer ensuite avec soin à l’eau stérilisée, casser le bout de la pointe effilée avec une pince flambée, et griller seulement l’extrémité de celle-ci au bec Bunsen. On entrera le moins possible la pipette dans le ballon. Il faudra habituellement souffler pour faire sortir les produits pathologiques visqueux ou coagulés.

Une autre manœuvre est plus sure, mais plus compliquée et

I La lumière est très nuisible aux microbes. S. Arloing a démontré (1885) que les rayons solaires, indépendamment de leur température, sont désastreux pour la végétabilité et la virulence des microbes. En trois quarts d’heure à six heures d’exposition (suivant la pureté de l’atmosphère), une culture mycélienne de Bacillus anthracis est stérilisée. Les spores elles-mêmes peuvent être tuées. Voir Gaillard (thèse Lyon, 1887. Action de la lumière sur différents microorganismes). Si la lumière n’a pas tué une culture, elle peut, en tout cas, l’avoir considérablement modifiée.

II faut donc toujours conserver les cultures à l’abri de la lumière.

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ne s’applique qu’aux cas où le liquide de semence assez abondant remplit une partie de la portion large de la pipette.

On ouvre et on flambe une nouvelle pipette vide (B) qu’on tient à la bouche ; on enlève le tampon de ouate de la pipette chargée de semence (A), et on le jette. Gn flambe alors a\vec grand soin l’orifice de la pipette chargée, tenue presque horizontalement avec la main gauche ; puis saisissant la pipette vide avec la main droite, on la flambe rapidement une dernière fois, et on la plonge dans le liquide de semence (fig. 69). On opère alors comme il a été dit plus haut.

2° Cultures liquides en sacs de collodion.

— Les cultures en sacs de collodion, imaginées à l’Institut Pasteur, ont pour but de faire végéter le microbe dans le péritoine ou sous la peau d'un animal vivant. Le microbe se trouve à l’intérieur d’un sac de collodion absolument clos ; ce dernier est introduit, aussi aseptiquement que possible, dans le péritoine d’un animal, et la plaie est refermée. L’animal supporte bien ce corps étranger. Les échanges se font à travers la membrane de collodion sans que le microbe puisse sortir ni les leucocytes entrer. 11 y a filtration pour les corps solides, et dialyse pour les liquides. Le microbe végète donc, en réalité, dans la sérosité péritonéale à l’abri des phagocytes ; il fabrique ses produits solubles qui sortent/du sac et se répandent dans l’organisme.

C’est en somme, une culture in vivo , avec une barrière empêchant le microbe soit de se répandre dans l’organisme, soit d’être attaqué par les cellules de celui-ci.

Cette méthode a son origine dans les travaux de Vaillard,

Fig. 69.

Puisage dans une pipette.

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qui entourait les spores tétaniques de papier à filtrer, avant de les inoculer, pour les mettre à l’abri des phagocytes et leur permettre d’engendrer ainsi le tétanos, sans le secours d’associations microbiennes. Les sacs de collodion ont été employés, tantôt pour relever la virulence d’un microbe ( Vibr . du choléra, Metchnikoff, Roux et Taurelli-Salimbeni), tantôt pour obtenir des cultures ( Péripneumonie du bœuf, Nocard et Roux, 1898), tantôt pour modifier les propriétés d’un microbe, l’acclimater à un milieu (B. tuberculeux, Nocard), tantôt pour modifier l’organisme animal récepteur.

On admet, en général, que la membrane de collodion se comporte comme un filtre parfait, c’est-à-dire qu’elle permet l’entrée des substances solubles de l’organisme dans le sac et la sortie du sac des toxines microbiennes. Rodet et Guechoff ont vu qu’il n’en était rien. Toutes les substances solubles ne pénètrent pas également dans les sacs, et les toxines contenues (la toxine diphtérique entre autres) en sortent parfois assez lentement pour ne pas produire leurs effets. L’animal peut, par exemple, être vacciné au lieu d’étre intoxiqué. En somme : le sac de collodion est relativement peu perméable ; des expériences négatives réalisées avec lui n’ont aucune signification. Gela n’empêche pas les résultats positifs d’être très appréciables. Il ne faut demander à cette excellente méthode que ce qu’elle peut donner.

On se contentait, au début, de faire des sacs en moulant du collodion autour d’un agitateur en verre. On obtenait ainsi, avec un peu d’habitude, de petits boyaux de collodion, fermés à une extrémité, ouverts à l’autre. Ils étaient alors stérilisés. L’ensemencement une fois pratiqué, on obturait l’ouverture en liant et en ajoutant un peu de collodion. Ces sacs étaient friables, s’aplatissaient, étaient difficiles à manier; en outre, une fois enkystés dans le péritoine, ils étaient presque impossibles à enlever, sans se crever ; aussi a-t-on modifié la fabrication du sac en le moulant autour d’un support en verre qui reste à demeure.

J. Courmont recommande la technique suivante. On a une provision de tubes en verre perforés, de la dimension reproduite

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figure 70, A : ils serviront de tuteurs aux sacs de collodion. On prend un tube à essai ordinaire de diamètre un peu supérieur à celui du tuteur (A), et on le nettoie avec soin. On le plonge successivement et à plusieurs reprises dans le collodion riciné. On place le tube verticalement et on laisse s’écouler

ABC Fig. 70.

Sacs de collodion.

A, Tuteur en verre. — B, Le même avec son sac de collodion. — C, Le même, rempli et fermé, prêt à être introduit dans le péritoine.

l’excès de liquide. On laisse sécher en ayant soin que le tube ne touche aucun objet. On décolle alors, avec l’ongle, le sac obtenu, et on l’adapte au tuteur (A). On le fixe au goulot par plusieurs tours de fil fin (fig. 70, B) qu’on recouvre d’une légère couche de collodion. L’appareil est bouché à la ouate et stérilisé à l’autoclave. Quand on veut l utiliser, on le remplit de liquide ensemencé avec une pipette et on ferme le goulot à la lampe (fig. 70, C). C’est ainsi que le sac est introduit, aussi asepti-

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quement que possible, dans le péritoine d’un animal quelconque. 11 est admirablement toléré . Il s’enkyste , au bout d’un certain temps, dans des fausses membranes qui rendent son extraction parfois assez délicate.

Gorsline propose (1903) de se servir d’un tube à essai percé

d’un trou dans le fond qu’on obture au collodion. On se sert de ce tube comme mandrin pour fabriquer le sac. On remplit ensuite le tube d’eau et on souffle ; l'eau passe par le trou, remonte et décolle le sac.

Le collodion rieiné doit être préféré au collodion élastique ordinaire. L’aspect du sac est plus blanchâtre, moins transparent, mais l’élasticité est plus grande; il se déchire plus rarement, surtout pendant la stérilisation à l’autoclave.

La difficulté d’extraire aseptiquement le sac du péritoine, après son enkystement, l'intérêt qu’il y aurait à puiser journellement le liquide du sac sans l’extraire, ont conduit Djounkowsky à imaginer des dispositifs restant en communication avec l’extérieur. Voici le plus intéressant (fig. 71).

Un tube de verre est fermé à une extrémité par une • pellicule de collodion (a), tandis que son goulot donne passage à deux tubes plus petits (d) et (e), serrés par un ajutage [g). Le tube (<?) sert au remplissage et soutient l’appareil par les deux fils (/, f) fixés dans la plaie. Le tube (d) est une pipette plongeante, se continuant par un tube de caoutchouc (6) et un tube de verre ( c ). Ce dernier tube (c) sort de l’abdomen par la plaie et permet de

Fig. 71.

Dispositif de Djounkowsky.

CULTURE DES AÉROBIES 141

relever ou d’ajouter du liquide dans le sac, sans faire de nouvelle laparotomie.

3° Cultures sur milieux solides. — Nous supposons qu’on veuille cultiver sur un milieu solide une parcelle de culture solide ou une goutte de culture liquide. L’aiguille de platine sera seule employée. On se servira des tubes chargés de gélatine, de gélose, de sérum gélifié, pomme de terre, etc., préparés et éprouvés à l’étuve comme il a été dit plus haut (ch. m). On s’assurera que la surface des milieux ne soit pas trop desséchée, qu’elle ne se fende pas sous l’action de la piqûre. Nous avons dit comment on régénérait un tube trop sec (p. 97).

On commence par enlever le capuchon de caoutchouc, et on le dépose dans un récipient rempli d’une solution de sublimé à 1/1000; on s’assure ensuite, en les retirant à moitié, que les tampons de ouate n’adhèrent pas aux parois du tube. Les tubes de gélatine peuvent être couchés horizontalement sur une table ; les tubes de gélose, sérum, pomme de terre, contenant souvent de l’eau à-leur partie déclive, devront être maintenus verticalement.

Pour- puiser la semence avec une aiguille de platine dans une culture liquide, on opère exactement comme il a été dit plus haut. Il suffit de tremper l’aiguille dans le liquide. La prise d’une parcelle de culture solide n’en diffère pas essentiellement. On se servira de l’aiguille droite ou à anse, suivant les cas. L’aiguille chargée est prise par son manche entre les deux premiers doigts de la main droite pendant que les deux derniers débouchent le tube à ensemencer maintenu par la main gauche. La pince tenant le tampon de ouate passe dans deux doigts de la main gauche, et la main droite devient libre pour manier l’aiguille de platine. Le tube est incliné aussi horizontalement que possible, flambé à son orifice, et l’aiguille introduite va déposer la semence.

On appelle culture par stries le procédé qui consiste à tracer longitudinalement sur la surface du milieu un sillon ou une série de sillons parallèles ; le microbe se développera en colonies superficielles le long des sillons. La culture par stries est la

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seule employée sur les milieux opaques ou peu transparents : pomme de terre, sérum, œuf, gélose. Elle se fait sur les tubes obliques (voir p. 92, 100, 103).

Sur la gélatine, on pratique concurremment l'ensemencement par piqûre , pour observer, par transparence, les caractères des

colonies développées dans le sillon profond au sein de la gélatine. On emploie alors des tubes solidifiés dans la position verticale ( tubes droits ) ; le tube de gélatine peut être complètement renversé par l'ensemencement (fig. 72), pour éviter les germes de l’air. Cette position n’est pas possible pour les autres milieux solides dont l’eau de condensation balayerait la surface.

Les tubes sont ensuite flambés à l’orifice, rebouchés avec leur tampon et leur capuchon de caoutchouc et placés à température convenable.

Si l’on porte directement une parcelle de culture solide sur un milieu solide avec l’aiguille de platine, il arrive souvent qu’on fait une traînée apparente qui gêne l’observation du développement. Cela est très net par exemple avec les cultures du bacille de la tuberculose. Il vaut mieux, dans ces cas, faire une dilution dans un ballon de bouillon, et ensemencer une goutte de ce mélange.

Lorsqu’on voudra ensemencer sur milieux solides des liquides recueillis aseptiquement sur un animal vivant ou autopsié, on fera exactement comme il a été dit pour les cultures liquides (p. 136). On promènera la pipette (à extrémité très effilée) ou l’aiguille de platine ayant plongé dans la pipette primitive à la surface du milieu solide.

Tous ces principes techniques seront naturellement modifiés

Fig. 72.

Ensemencement de la gélatine par piqûre.

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dans les détails suivant les cas particuliers ; mais les grandes indications subsisteront : transporter aseptiquement la semence d’une culture ou d’un produit pathologique dans un milieu neuf.

4° Cultures sous le microscope. — Le procédé des cultures sous le microscope a permis à Koch d’observer le cycle complet de la Bactéridie charbonneuse et de découvrir sa sporulation. Il est indispensable pour étudier le développement d’un microorganisme. Le problème est le suivant : faire végéter un microbe sous le microscope, en couche liquide assez mince pour qu’on puisse observer d’une façon continue les modifications qui se produisent. Koch employait primitivement le procédé de la goutte suspendue : on se sert aujourd'hui d’une chambre humide [culture en cellules ).

Nous disons une fois pour toutes que les petits appareils que nous allons décriré devront être soigneusement stérilisés, puisqu’ils constitueront en somme des récipients à culture*. Nous ne traitons ici que des aérobies, il faudra donc toujours conserver dans la cellule une quantité d'air suffisante pour la végétation microbienne : il conviendra enfin de chauffer la cellule à la température eugénésique exigée par certains microbes.

Les lamelles couvre-objets seront lavées dans l’acide chlorhydrique, dans l’alcool, puis dans l’eau distillée, séchées, et déposées dans de petits cristallisoirs en verre de Bohême qu’on enveloppe de papier et qu’on stérilise à -f- 150° comme des boîtes de Pétri (voir p. 36). Les lamelles ne seront extraites qu’au moment d’être utilisées.

Les lames et autres pièces seront traitées de même, et stérilisées à la chaleur sèche à -j- 150°. On préparera toujours plusieurs lames en cas de contamination accidentelle.

Le milieu nutritif ne sera pas trop ancien.

Il ne faut pas ensemencer trop abondamment ; trois ou quatre microbes seulement doivent, au début, occuper le champ du microscope. Pour cela, on aura soin d’ensemencer la cellule avec une dilution de la culture-mère. On en met une goutte dans un ballon de bouillon qu’on agite pour bien mélanger ; une

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goutte de ce ballon est portée dans un second et une goutte du second dans un troisième ; c’est avec cette troisième dilution qu’on ensemence la cellule.

Culture en goutte suspendue.

A, B, lame* creuse. — C, lame, lamelle et goutte suspendue.

A. Goutte suspendue. — Le procédé de la goutte suspendue (Koch) exige une lame creuse. C’est une lame semblable aux ; lames ordinaires pour préparations microscopiques, mais présentant à son centre une dépression circulaire de 15 millimètres

de diamètre environ (fig. VJ 73, A, B). On dépose une goutte de la culture à observer, ou une goutte de bouillon récemment ense- I mencé, sur une lamelle j qu’on renverse sur la partie j excavée préalablement en- j tourée de vaseline ; la 1 goutte reste suspendue dans | l’atmosphère de la cavité de la lame (fig. 73, C). Les bords fi de la lamelle sont lutés extérieurement avec de la vaseline H pour empêcher l’air de pénétrer dans la cellule. La goutte ne il doit pas naturellement s’étendre jusqu’aux bords de la cellule, j car elle disparaîtrait par capillarité entre la lame et la lamelle.

La lame ainsi préparée est fixée sur la platine du microscope j qui est mis au point pour l’examen à un fort grossissement. |

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B. Chambre humide dé Boettcher. — La chambre humide de Boettcher (fig. 74, A et B) est une lame à laquelle est fixé un anneau de verre de 25 millimètres de diamètre, au moyen d’une substance adhésive résistant à -f- 150° (solution de gélatine dans l’acide acétique avec bichromate de potasse finement pulvérisé au moment de s’en servir : Hansen). Une lamelle est superposée, adhérant au moyen de la vaseline. Hansen a employé ce dispositif pour étudier le développement de colonies de levures végétant sur une plaque de gélatine étendue sur la lamelle. On met un peu d’eau distillée au fond de la cellule.

Fig. 75.

Chambre humide de Ranvier.

La goutte suspendue a le grand défaut d’avoir une épaisseur trop considérable et inégale ; les microbes peuvent se déplacer pendant l’examen. La petite plaque de gélatine ne peut remplacer les milieux liquides ; il faut donc employer des dispositifs plus perfectionnés. On pourrait à la rigueur écraser simplement la goutte de culture entre une lame ordinaire et une lamelle, ou ajouter un fragment de lamelle qui adhérerait à la face inférieure de la goutte suspendue ; mais ce sont là des procédés bien imparfaits.

C. Chambre humide de Ranvier. — La chambre humide de Ranvier est une lame de verre creusée à son centre d'une rainure profonde circulaire circonscrivant un disque rond dont la surface plane est inférieure d’un dixième de millimètre à celle de la lame (fig. 75, A, B). La goutte de culture est placée sur cette petite plate-forme ; les bords sont enduits de vaseline.

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On applique une lamelle en appuyant un peu, et la goutte est écrasée entre les surfaces planes parallèles, allant par ses bords jusqu’à la chambre à air constituée par la rainure (fig.75, C).

D. Chambre humide de de Bary et Geissler. — La chambre humide de de Bary et Geissler a permis à Brefeld de suivre le cycle entier du développement du Bacillus subtilis. Cet appareil est cher et fragile. Il consiste en un tube de verre de 20 centimètres de longueur, dilaté de sa partie médiane en une cellule ronde, aplatie, de 2 millimètres de hauteur, dont les parois

Fig. 76.

Chambre humide de de Bary et Geissler.

ont l’épaisseur d’une lamelle (fig. 76). Les deux extrémités sont bouchées à la ouate et le tout est stérilisé à + 150°. On ensemence un ballon de bouillon avec la dilution voulue de ; semence et on aspire en plongeant dans le liquide un des bouts du tube privé de son tampon. Quand la cellule est pleine, on laisse tomber au dehors le liquide aspiré, on remet le tampon de ouate, et on obture les deux bouts avec de la cire à cacheter.

La paroi interne de la cellule est ainsi tapissée d’une pellicule de bouillon ensemencé, suffisamment mince pour que les microbes restent immobiles. Les deux extrémités du tube sont ' ensuite fixées sur une lame qui est portée sur la platine du microscope.

E. Chambres humides improvisées. — Il faut pouvoir improviser des chambres humides.

Buchner cultivait le Bacillus anthracis entre une lame et une lamelle maintenues à une distance suffisante l’une de l’autre par des morceaux de lamelles brisées ; il lutait avec de la vaseline.

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Salomonsen découpe un orifice carré dans un morceau de carton épais, le fait stériliser dans l’autoclave et l’interpose entre la lame et la lamelle. Imbibé ensuite d’eau stérilisée, ce carton sert encore à maintenir l'humidité.

Fig. 77.

Chambre chaude de Vignal.

F. Platines chauffantes, chambres chaudes. — Il importe de hâter le développement des microbes en plaçant la chambre humide à une température eugénésique. On peut porter la chambre dans l’étuve à + 38° entre les examens microscopiques. Mais il est difficile de remettre ensuite la préparation exactement au même point qu’auparavant sous le microscope. On peut cependant y arriver au moyen de l’artifice suivant dû à Hoffmann. On trace de chaque côté de l’orifice de la platine du microscope une

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croix, droite d’un côté -f-, oblique de l’autre x ; lorsque le point, intéressant est bien au centre du champ du microscope, on fait à l’encre, sur la lame, deux croix exactement superposées aux deux premières ; elles serviront de points de repère très exacts.

Il vaut mieux employer la platine chauffante qui permet d’examiner, sans la transporter, une culture végétant à température fixe, et de dessiner à la chambre claire les différentes phases de développement d’un même point.

La platine chauffante de Ranvier reliée à une étuve suffit. La platine chauffante de Reichert , reliée à une toute petite étuve de d’Arsonval est le dispositif le plus favorable.

La chambre chaude de Vignal (fig. 77) est elle-même une petite étuve d’Arsonval dont la forme seule est modifiée. La préparation est introduite dans la cavité de l’étuve par la porte (B). On peut se servir du condensateur Abbe, ce qui est impossible avec la platine de Ranvier.

On peut utiliser une chambre chaude, à vaseline, chauffée et réglée à l’électricité, construite par Maury, de Lyon.

On verra, page 186, quels sont les dispositifs employés pour cultiver les anaérobies sous le microscope.

On peut avoir intérêt à compter les microbes d’un volume donné de culture. La meilleure méthode est celle de Klein. On colore un volume connu avec une solution alcoolique de violet de gentiane ; on prend une goutte d’eau qu’on étale sur une lamelle de surface connue et on compte 50 champs, de microscope. On fait le calcul proportionnel.

5° Conservation des cultures. — Pour conserver le plus longtemps possible une culture vivante, il faut la préserver de l’oxygène de l’air. Le meilleur procédé consiste à étrangler une pipette, à la remplir de culture et à sceller les deux extrémités. Le tube ainsi fermé est conservé à froid et à l’obscurité. On agit naturellement de même pour les anaérobies.

Pour conserver des colonies devant servir aux démonstrations on les cultive dans un flacon de Roux (fig. 19) ou dans le dispositif figuré page 26 (fig. 20), sur gélose, on les tue au formol

ISOLEMENT DES AÉROBIES 149

ou avec du sublimé à 0,1 à 1 p. 100 ; on lute l’orifice et on conserve à l'obscurité.

§2. — Isolement des aérobies

Nous étudierons plus tard les méthodes spéciales à l’isolement des aérobies de l’eau, de l’air, de la terre, etc. (ch. xiv, xv et xvi). Nous ne voulons traiter ici que des grands principes généraux qui doivent guider l’expérimentateur dans l’isolement des aérobies, c’est-à-dire dans la façon d’obtenir une culture pure d’un microbe aérobie qui est mélangé avec d’autres espèces bactériennes. Cet isolement s’obtient à l’aide de deux méthodes principales : par culture directe ou par culture des produits pathologiques d’un animal inoculé avec le mélange microbien. Dans le premier cas, la séparation est toute mécanique ; dans le second, la séparation se fait par sélection ; l’organisme animal ne se laisse envahir que par l’espèce qui lui est pathogène, et la livre à l’état de pureté. La méthode par culture directe a naturellement besoin d’artifices pour arriver à l’isolement des aérobies : dilution, étalement de la gélatine sur plaques, addition d’antiseptiques, chauffage, exposition à des températures dysgénésiques, emploi de milieux spécialement favorables à telle espèce, prise de la semence après un court espace de temps, etc. Nous allons étudier successivement ces différents procédés.

1° Isolement par l'action de températures variables. — La

température peut être employée^ soit très élevée, soit très basse.

A. Isolement par des températures élevées. — Ces températures seront mortelles ou simplement dysgénésiques pour les autres germes.

a. Température tuant les autres germes. — - On chauffe la semence à une température suffisante pour tuer tous les germes autres que celui qu’on desire cultiver. Cette méthode ne s’adresse naturellement qu’aux microbes très résistants, se reproduisant par sporulation ; on sait que la plupart des spores

150 CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES

résistent à des températures supérieures à -f 100°. Une des spores les plus résistants est celle du Bacille de la pomme de terre ( Bacillus mesentericus ) qui n'est pas toujours tuée par un chauffage à -f- 130°; aussi voit-on fréquemment les fragments de pomme de terre, quoique stérilisés, se recouvrir d’une pellicule plissée qui n’est autre qu’une culture de Bacillus mesentericus. La stérilisation ayant tué tous les autres germes, avait isolé ce microbe à l’état de pureté.

On savait depuis longtemps que plusieurs liquides organiques, bien que soumis à l’ébullition et maintenus à l’abri des germes de l’air, arrivent à être souillés par des végétations microbiennes. C’est Cohn qui montra le premier, en 1876, par une expérience faite sur l’infusion de foin, que ces cultures sont composées de microbes à spores très résistantes et spécialement de Bacillus subtilis. Brefeld a d’ailleurs vu directement sous le microscope les spores germer après ébullition. C’est en échouant dans la stérilisation des infusions de foin par la simple ébullition que Tyndall a dû imaginer la stérilisation par chauffage discontinu pour se débarrasser des germes provenant des spores du B. subtilis (voir p. 44).

Pasteur a directement appliqué le principe du chauffage à l’isolement des anaérobies et particulièrement du Vibrion septique (voir ch. vi, p. 187), En 1879, Miquel a isolé le Bacillus ureœ en chauffant, à + 80° et -f 90° pendant deux heures, de l’urine putréfiée ou de l’eau d’égout.

Ce procédé d’isolement ne peut être utilisé lorsqu’il existe un mélange de plusieurs microbes à spores résistantes. Il est employé pour l’isolement de la Bactéridie charbonneuse des produits prélevés sur les cadavres putréfiés.

b. Températures dysgénésiques pour les autres germes. — On se sert bien plus souvent de la chaleur, pour isoler les aérobies, en cultivant le mélange microbien à une température dysgénésique pour la plupart des espèces. Tous les microbes, en effet, ne poussent pas dans les mêmes limites de température. La végétation cesse en général vers -{- 40°, mais certains d’entre eux se cultivent encore bien au-dessus de cette température : B. de la tuberculose aviaire , B. coli, B. d’Eberth ; etc.

ISOLEMENT DES AÉROBIES

11 suffira alors d’ensemencer un ballon de bouillon avec le mélange contenant un de ces microbes, et de le placer dans une étuve à + 42°, 43°, 45°; le bouillon se troublera et fournira seulement les espèces poussant à cette température.

La méthode peut servir pour isoler des eaux le B. coli ou le B. d'Eberth. Ces deux microbes poussent à + 44°, 5. On ensemence du bouillon, et on le dépose dans une étuve réglée spécialement à cette température. S’il ne se produit aucun trouble au bout de quarante-huit heures, on peut affirmer que l’eau ne contenait ni B. coli ni B . d'Eberth ; si les ballons se sont troublés, on a presque sûrement affaire à l’un de ces deux microbes. L’analyse, terminée dans le premier cas en quarantehuit heures, est bien simplifiée dans le second (Rodet).

B. Isolement par des températures basses. — Lorsqu’un microbe pousse à de basses températures, on peut l’isoler en faisant plusieurs passages de culture à une température où il végète seul.

2° Isolement par inoculation. — Lorsqu’on veut isoler une espèce- pathogène d’un produit souillé par d’autres microbes, et qu’on connaît une espèce animale sensible à ce microbe, il suffit d’inoculer le tout à l’animal et de recueillir les produits pathologiques loin du point d’introduction. Il faut, bien entendu, pour que ce procédé réussisse, rechercher un microbe qui ne reste pas cantonné dans la plaie d'inoculation. C’est ainsi que nous verrons au chapitre des Anaérobies (chap. vi) que l’inoculation au cobaye permet de recueillir du Vibrion septique pur dans la sérosité péritonéale, tandis que le B. de Nicolaïer (tétanos) reste localisé au point inoculé.

Le procédé d’isolement par inoculation est le meilleur de tous, lorsqu’il peut être employé. Davaine, Pasteur s’en sont servis pour obtenir le microbe d’une septicémie du lapin ; Koch a de même découvert une septicémie de la souris. Mais l’exemple le plus fameux est celui de la culture du Bacille tuberculeux. On sait, depuis Koch (1882), qu’il suffit d’inoculer un cobaye avec des produits tuberculeux quelconques pour

152 CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES

avoir, dans les ganglions et la rate de cet animal, une semence absolument pure de bacilles tuberculeux. L’inoculation au cobaye est toujours le premier temps de la préparation d’une culture pure du Bacille de Koch. On peut ainsi isoler le Staphylocoque pyogène, le Streptocoque pyogène, le Bacillus anthracis, etc., en inoculant le lapin et en cultivant son sang. J. Courmont a isolé un Bacille de la tuberculose bovine, différent du Bacille de Koch en inoculant au cobaye et au lapin des produits tuberculeux du bœuf; le bacille était à l’état de pureté dans le sang des animaux. Il en a été de même pour un autre Streptobacille tuberculeux, également d’origine bovine, découvert par J. Courmont et Nicolas (1897). On pourrait multiplier ces exemples.

3° Isolement par cultures liquides. — L’isolement des microbes par les cultures liquides est incontestablement entouré de difficultés. Il ne doit pas cependant être abandonné. 11 faut se souvenir que nombre de microbes poussent bien mieux en bouillon que sur milieux solides, et que la gélatine, qui est le milieu solide le plus maniable, doit être maintenue à + 22° seulement. L’isolement de beaucoup d’espèces et la numération exacte des microbes contenus dans un produit pathologique, une eau, etc., n’est donc pas possible avec la gélatine. Les cultures liquides conservent en somme leur importance.

Nous venons de voir que les cultures liquides chauffées (cultures du B. subtilis) ou mises à des températures dysgénésiques pour la plupart des microbes (cultures de B. coli ou de B. d’Eberth ) pouvaient être pures en raison de l’action de la chaleur. Noùs ne voulons parler maintenant que de l’isolement des aérobies par le simple fractionnement de la semence en cultures liquides. Ce fractionnement peut se [faire par dilution ou par division du liquide en gouttes extrêmement petites.

Nous citerons, en outre, pour mémoire, la méthode, des plus primitives, employée par Klebs, en 1876. Les espèces qui végètent côte à côte dans un bouillon ensemencé avce un mélange microbien ne sont pas fatalement disséminés en proportions égales dans tous les points du liquide. Les bactéries

ISOLEMENT DES AÉROBIES

immobiles tombent au fond du ballon, les mobiles se retrouvent dans toutes les couches, les aérobies stricts poussent en pellicule à la surface, les autres préfèrent les couches inférieures moins riches en oxygène ; enfin, certains microbes végéteront avec une telle rapidité qu’ils étoufferont pour ainsi dire toutes les autres espèces. Parti de ces données classiques, Klebs était arrivé à avoir des cultures pures en prélevant de très petites quantités de semence impure pour la reporter dans un nouveau ballon, et ainsi de suite. On n’est jamais sur d’arriver au but par cette méthode, en tout cas très longue.

A. Méthode de la dilution. — Elle consiste à diluer une goutte de semence dans une telle quantité de liquide stérilisé qu’une goutte du mélange ne puisse contenir qu’un seul microbe. Cette goutte ensemencée en bouillon donne une culture pure.

Cette méthode, déjà employée, en 1873, par Yan Tieghem et Le Monnier pour l’isolement des champignons (Mucorinées), a été introduite en bactériologie par Noegeli, en 1878, et perfectionnée depuis par Brefeld, Miquel, etc.

La technique de l’isolement par les cultures liquides sera développée tout au long au chapitre de Y Analyse de l'eau (ch. xiv).

La méthode de la dilution est encore employée pour l’ensemencement des cultures solides (voir Cultures sur plaques, p. 57).

B. Méthode du fractionnement en gouttelettes. — Elle est due à Chauveau et S. Arloing et sera décrite au chapitre de Y Analyse de Veau (p. 407). Le principe de la méthode réside dans l’emploi d’une pipette suffisamment fine pour fractionner le centimètre cube en 130 à 180 gouttes. Chaque goutte ensemence un ballon. Une dilution préalable peut-être le premier temps de l’opération et permet l’emploi de pipettes moins fines, ce qui facilite l’ensemencement.

C. Méthode des cultures filtrantes. — Nous avons déjà dit (p. 13) que les microbes ne sont pas toujours retenus par les bougies filtrantes. Cambier (1901) a cherché à utiliser ce passage

CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES

de certains microbes à travers les filtres pour isoler le B. d 'Eberth des autres microbes des eaux ou des selles Une culture impure contenant du B. d,’ Eberth placée dans une bougie, plongeant elle même dans du bouillon nutritif, ensemencerait ce dernier, autour de la bougie, uniquement de B. d’Eberth , ce dernier passant à travers les pores de la bougie, grâce à sa grande mobilité. On verra (p. 434) que cette propriété n’est pas spéciale au B. d’Eberth.

La méthode a été étudiée systématiquement par Lesieur. Le dispositif employé (fig. 78) se compose d’un tube d’Esmarch (A) contenant du bouillon ( l ) dans lequel plonge une bougie Chamberland (B), petit modèle, marque F. On ensemence dans la bougie et on surveille le bouillon extérieur : dès qu’il se trouble, on fait les examens nécessaires pour constater la pureté de la culture.

Voici un tableau montrant la rapidité avec laquelle plusieurs microbes traversent ces bougies.

En bouillon ordinaire.

En

milieu

de Gambier.

Bacille d’Eberth . . . .

en

18 heures.

en