heures
Colibacille
Vibrion cholérique . . .
M. agilis citreus
Staphylococcus aureus . .
Proteus vulgaris. . . .
en
jours.
B. anthracis
en
jours.
M. prodigiosus
B. lactis aerogenes. . . .
B. pyocyanique
B. vert de l’eau
B. mesentericus vulg. .
B. diphtérique
Actinomyces bovis . . .
M. ureæ
B. subtilis .......
Fig. 78.
Méthode de Cambrer. Dispositif de Lesieur.
ISOLEMENT DES AÉROBIES
On voit que la plus ou moins grande rapidité de passage peut être utilisée pour isoler telle espèce, surtout le B. d’Eberth , le B. coli, le V. cholérique.
P. Carnot et Garnier ont utilisé le même principe pour leurs cultures en tubes de sable. La figure 79 montre le dispositif. Un petit tube de verre en U, avec une branche fine (B), reçoit du liquide de culture (/) sur une hauteur de 0m,10 environ. On projette lentement dans celui-ci du sable de quartz très fin, purifié par un séjour de quarante-huit heures dans l’acide chlorhydrique, bhen lavé pendant plusieurs jours et calciné au four.
La couche de sable (s) charge la grosse branche (A) sur une hauteur de 0m,10. On stérilise à l’autoclave. Un bourron de coton de verre (C) empêche le sable de gagner la petite branche. Il faut verser le sable lentement dans le liquide pour éviter les bulles d’air. On ensemence le bouillon de la petite branche et on attend que le bouillon qui surmonte le sable se trouble.
Le Vibrion cholérique, le B. d’Eberth, le B. de la psittacose, les Colibacilles passent rapidement.
4° Isolement sur les milieux solides.
— C’est la méthode de Koch1; c’est la plus couramment employée. Le principe est simple. Si on ensemence de la gélatine ou de la gélatine-gélose à l’état liquide, de façon que les microbes soient uniformément répartis dans le milieu, et qu’on fasse solidifier celui-ci en couche mince, chaque microbe donnera une colonie pure, végétant à la surface, complètement isolée des autres. On peut alors en prendre une parcelle et avoir une culture pure en tube de
1 Koch, Zur Untersuchung von pathogenen Organismen, Mitteil aus dem kaiserl. Gesundh., 1881.
Fig. 79.
Cultures en tube de sable (Carnot et Garnier).
CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES
gélatine ou en ballon de bouillon. Les temps de l’opération seront donc toujours les suivants : 1° liquéfaction au bainmarie de la gélatine, de la gélatine-gélose, de la gélose ; 2° ensemencement avec une très petite quantité de produit à analyser ; 3° agitation pour répartir uniformément les germes ; 4° étalage du milieu en couche mince et refroidissement ;
Fig. 80.
Colonies sur gélatine en boîte de Pétri.
C, colonies superficielles et c, colonies profondes de B. d’Ebertli; S, colonies de Staphylocoque pyogène (légère liquéfaction) ; B, moisissures.
5° prise aussi hâtive que possible de chaque colonie qui sera réensemencée.
Il est cependant des cas où on procède autremént ; on ensemence, par de nombreuses stries, un milieu déjà solidifié, sans recharger l’aiguille de platine ou la pipette. L’aiguille fait des stries de moins en moins contaminées et les dernières donnent des cultures pures ; nous dirons deux mots de ce procédé.
Enfin nous renvoyons aux chapitres de Y Analyse de Veau , de Vair, de la terre pour la description des appareils spéciaux.
ISOLEMENT DES AÉROBIES
A. Cultures sur plaques de Koch. — La méthode primitive de Koch, étalant la gélatine sur des plaques , n’est presque plus employée , en raison de l'outillage compliqué et embarrassant quelle nécessite et de son peu de sécurité comme asepsie.
B. Cultures sur plaques en boîtes de Pétri. — Nous avons décrit les boîtes de Pétri (p. 25, fig. 17). Ce sont des cristallisoirs minuscules, à couvercles-, stérilisés, conservés dans leur enveloppe de papier stérilisé, et recevant directement la gélatine liquide ensemencée. Les bords du petit cristallisoir, retenant la gélatine, rendent inutiles les appareils. compliqués. destinés à maintenir l’horizontalité. Le procédé par boîtes de Pétri a définitivement détrôné le procédé de Koch. La préparation des tubes de gélatine est la même [que dans le procédé de Koch, mais chacun d’eux est versé dans une boîte de Pétri, légèrement entrouverte. Une étiquette est collée sur chaque boîte. L'es boîtes de Pétri peuvent être mises dans une chambre humide pour éviter la dessiccation de la gélatine ; il suffit de placer dans l’étuve un cristallisoir rempli d’eau. L’examen des colonies, leur prise se font d’après les principes généraux (fig. 80).
On emploie de plus en plus, même en Allemagne, les dilutions dans la gélose. La gélose fusible à une température élevée, 70-80 degrés, se maintient en surfusion jusqu’au voisinage de 40 degrés.
C. Cultures sur plaques en tubes de Roux. — Le tube de Roux est encore plus parfait que la boîte de Pétri, car il supprime toutes les chances de contamination du transvasement et permet donc la conservation à l’état de pureté des microbes à évolution lente. C’est un tube de verre long de 25 à 30 centimètres et large de 2 à 3 centimètres, sauf à la partie supérieure beaucoup plus étroite. 11 est chargé d’une petite quantité de gélatine ou de gélatine-gélose, fermé à la ouate et stérilisé à l’autoclave (plusieurs séances sans pression). Au moment de l’utiliser, on fond la gélatine, on l’ensemence, on agite vivement, et on
I couche le tube sur le côté. La gélatine s’étend en plaques sans pouvoir pénétrer dans la partie étroite. 11 est bon de coiffer le
CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES
tube d’un capuchon de caoutchouc. On pourra naturellement faire des dilutions dans plusieurs tubes successifs.
Le procédé de Roux réduit l’opération à un seul temps, puisque c’est le tube même qui était versé sur la plaque ou en boîte de Pétri qui est couché et contient la plaque de gélatine.
Si on veut examiner à la loupe une colonie par sa surface libre, on coupe longitudinalement le tube de verre parallèlement à la plaque de gélatine ; un des demi-cylindres contient la culture étalée.
La prise des colonies se fait comme dans un tube ordinaire.
L’inconvénient du tube de Roux réside dans la trop grande épaisseur de la gélatine au milieu de la plaque ; nombre de microbes sont inclus profondément.
On peut remplacer le tube par le flacon représenté fig. 19; - J la gélatine s’étale en couche mince et égale.
D. Cultures sur plaques enroulée^ (méthode d’Esmarch). — J C'est le 'procédé de choix. La gélatine est enroulée le long des j parois du tube. La couche de gélatine a ainsi une minceur très grande et uniforme.
Nous avons déjà parlé (p. 26) des tubes nécessaires à ce pro- ! cédé, et (p. 100, fig. 56) de la façon de les charger de gélatine.
11 faut avoir de larges tubes à essai de la dimension des tubes à I pommes de terre, mais sans étranglement. Ils sont stérilisés I avec une très petite quantité de gélatine formant au fond un I culot de 1 centimètre de hauteur au plus. On les liquéfie, on les I ensemence, on fait une série de dilutions absolument comme I dans les procédés précédents. La gélatine, une fois ensemencée I et agitée, est enroulée. C’est là le point spécial de technique. I On bouche à la ouate et on coiffe d’un large capuchon de caou- i tchouc. On couche alors le tube horizontalement en tenant | chaque extrémité avec une main, et, lorsque la gélatine n'est | plus qu’à un centimètre ou deux du tampon, on imprime au ] tube un rapide mouvement de rotation sur son axe, de façon I à enrouler la gélatine sur tout le pourtour des parois. Lorsqu’on !
ISOLEMENT DES AEROBIES
froide 1 faut tube sous l’eau au contact des
voit que tous les points sont bien mouillés par la gélatine 1, on continue le mouvement de rotation sous un filet d’eau tombant d’un robinet sur le tube et s’étalant sur lui. porter alternativement toute la longueur du froide, et spécialement le fond du tube qui, doigts, se refroidit plus difficilement. Le capuchon de caoutchouc est indispensable pour empêcher le tampon de ouate d'être mouillé.
Jamais la gélatine ne doit toucher le tampon.
En quelques minutes la gélatine est solidifiée. Si l’enroulement est bien fait, la gélatine est répandue en couche si mince et si uniforme qu’elle est invisible. Le tube est étiqueté et porté à l’étuve.
On pourrait rouler, par la méthode d’Esmarch, les tubes de Roux précédemment décrits ; on serait plus sûr que la gélatine ne viendrait pas souiller la ouate.
L’examen des colonies (fig. 80), leur prise avec l’aiguille de platine ne présentent aucune difficulté avec la méthode d’Esmarch. On peut marquer d’un point à l'encre, sur la surface externe du tube les colonies qu’on veut continuer à examiner; il n’en existe jamais deux superposées en épaisseur.
L’inconvénient des cultures liquéfiantes subsiste naturellement comme dans toutes
les cultures sur gélatine.
Fig. 81.
Tube d’Esmarch avec 3 colonies de Colibacille [a, a’ a”) etplusieurs petites colonies de microbes divers.
E. Cultures d'isolement par stries sur gélose. — On ne peut faire servir l'isolement par cultures sur gélatine à tous les besoins de la bactériologie. Le B. de la morve , le Pneumocoque et bien d’autres microbes, ne végètent pas aux températures inférieures à -f- 23° où la gélatine reste solide. D'autre part,
1 On peut s’aider de l’aiguille de platine pour bien mouiller de gélatine toute la superficie du tube.
CULTURE ET ISOLEMENT DES AÉROBIES
on ne peut ensemencer de la gélose à l’état liquide sous peine de tuer ou d’atténuer les germes de la semence, en raison de la haute température (-f- 70°) à laquelle se liquéfie ce milieu. On ne peut donc enrouler ou étaler la gélose ensemencée. On se sert alors de la méthode suivante. On coule de la gélose dans une boîte de Pétri et on laisse refroidir. On fait ensuite, sur la surface de la gélose, avec l’anse de platine chargée de la semence, et promenée très légèrement, une série de stries disposées, par exemple, en quadrillage. L’anse de platine se dépouille des germes au fur et à mesure qu’on l’essuie ainsi sur la gélose, et les dernières stries donneront des colonies suffisamment isolées.
On peut faire la même opération en faisant des stries successives sur plusieurs tubes de gélose à surface oblique. Les derniers tubes offriront des colonies séparées.
On peut opérer identiquement avec des tubes de sérum, ainsi que nous allons le voir.
Veillon épuise successivement la semence dans l’eau de condensation de 3 ou 4 tubes de sérum ou de gélose, puis il incline les tubes pour que l'eau ensemence la surface solide. La dilution favorise l’isolement des colonies.
5° Isolement par l’emploi de milieux spéciaux — L’idéal, en bactériologie, serait de posséder un milieu spécial â chaque espèce microbienne, permettant la végétation de ce microbe, à l’exclusion des autres. L’isolement serait alors facile. Si nous ne possédons pas de méthode générale aussi commode, nous savons cependant isoler certains microbes en nous servant de leur prédilection pour tel ou tel milieu ; pour certains même la composition d’un milieu spécial est chose indispensable.
Le B. subtilis , le Vibrion cholérique poussent en voile à la surface du bouillon : une parcelle de ce voile, réensemencée, aura des chances de donner une culture pure. Le Vibrion cholérique pousse même en six à dix heures dans une simple solution salée de peptone (p. 85), c’est-à-dire avant le développement de la grande majorité des microbes des selles. Koch a utilisé cette
ISOLEMENT DES AÉROBIES
propriété pour faire rapidement le diagnostic du choléra et isoler son vibrion.
L’addition de phénol (p. 100) à la gélatine empêche la pullulation des microbes léquifiants des eaux, et permet la culture du B. coli et du B. d’Eberth qu’elles peuvent contenir (Chantemesse et Widal) en tubes d’Esmarch.
La carotte est le milieu que préfère le champignon du Muguet (Roux et Linossier, Yellat). La pomme de terre convient au Bacille de la morve, l’apparition tardive de ses colonies pigmentées permet de le distinguer des autres germes du jetage dont les colonies se développent plus rapidement. Le Streptocoque pousse très vite sur les milieux au touraillon (G. Roux, Ghatin).
Le Bacille de la tuberculose , au sortir des ganglions du cobaye, doit être isolé sur sérum gélifié, et ne pousse sur gélose glycérinée qu’après un acclimatement à ce milieu.
Le même bacille, végète parfois directement si on l’ensemence sur sang gélose (voir p. 107).
Est-il besoin de rappeler la préférence de Y Aspergillus niger pour le liquide de Raulin (p. 75), et sa sensibilité aux moindres modifications de ce liquide, même à celles aussi insignifiantes que l’exposition dans un vase d’argent?
