LE MICROSCOPE

Le condensateur Abbe envoie sur la préparation un cône de lumière tellement intense, que toutes les parties peu ou pas colorées, les tissus spécialement, disparaissent presque complètement. Seules les parties très colorées, les microbes, absorbent suffisamment les rayons pour être visibles : elles se détachent alors du fond avec la plus grande netteté. En plus, outre les rayons centraux, il existe des rayons obliques par rapport à l’axe du microscope, lesquels augmentent encore la netteté des contours. Une coupe, un frottis qui ne présentait aucun microbe à l’éclairage ordinaire (diaphragme et miroir concave) peut, avec le condensateur Abbe, montrer une grande quantité de microbes colorés. Cet instrument est donc indispensable au bactériologiste. C’est Koch qui l’a employé le premier, pour examiner les microbes colorés, en même temps qu’il supprimait le diaphragme.

Les préparations non colorées ne sont visibles à l’éclairage Abbe qu’à la condition de rétrécir considérablement le champ du microscope au moyen du diaphragme iris ; c’est ainsi qu’on arrive à apercevoir le tissu d’une coupe primitivement invisible.

Hueppe conseille, pour augmenter encore la netteté, de glisser entre le condensateur et la lame de la préparation, une goutte d’huile à immersion : le milieu est alors de même réfringence depuis le condensateur jusqu’à l’objectif.

4° Diaphragme iris. — Le diaphragme iris (fi g. 128) est formé de lames mobiles les unes sur les autres fixées dans un tambour qui permet de réduire ou d’agrandir l’ouverture centrale en faisant mouvoir un bouton. On n’a pas besoin de rien déranger dans l’appareil pour modifier l’ouverture. Le diaphragme iris permet donc de rétrécir progressivement le champ microscopique.

C’est un instrument commode pour examiner les préparations peu ou pas colorées, par exemple les microbes vivants. On rétrécit d’autant plus l’ouverture que la préparation est moins

Fig. 127.

Schéma du condensateur Abbe.

colorée. Nous venons de voir qu’il est employé quelquefois avec le condensateur Abbe.

Le diaphragme est également indispensable pour l'examen avec un objectif très puissant des préparations colorées.

5° Micromètre. — Les microbes ont des dimensions qu'on exprime par le nombre de p ou millièmes de millimètre. On se

Fig. 128.

Diaphragme iris.

sert d’un oculaire quadrillé pour faire ces mensurations. On pourrait s’en passer, en connaissant très exactement le grossissement obtenu et en mesurant avec une règle les dessins obtenus à la chambre claire.

6° Lames et lamelles. — On emploiera des lames et des lamelles de bonne qualité et assez minces.

Les lames sont en général des dimensions 76/26 millimètres ; les lamelles 18/18 sont les plus employées. On aura cependant quelques lamelles 22/32.

La propreté des lames et lamelles est indispensable. Lorsqu’elles sont souillées de baume ou d’huile, on les recueille dans

l’ultra-microscope

un cristallisoir rempli d’alcool à brûler. Le nettoyage s’opère en les faisant bouillir une dizaine de minutes dans une capsule de porcelaine remplie d’une solution de carbonate de soude à 5 p. 100. On lave et on passe dans l’acide sulfurique ou dans la solution :

Acide sulfurique 100

Bichromate de potasse . . 20

Eau 1 000

Fig. 129.

V ultra-microscope.

Condensateur, lame, lamelle, objectif.

On les conserve dans l’alcool à 95° ou dans de l’alcool à 70ü additionné de quelques gouttes d’ammoniaque.

§2. — L'ultra-microscope

L’ultra-microscope sert à observer les bactéries vivantes non colorées, les substances colloïdes, etc. Ce résultat est obtenu par un effet de contraste entre les bactéries intensivement éclairés par diffraction et le fond obscur.

L’app&reil concentre la totalité des rayons lumineux arrivant du miroir au point P (fig. 129).

Le condensateur est placé comme le condensateur Abbe.

On emploiera des lames de 1 mm. d’épaisseur au maximum.

On mettra une goutte d’huile de cèdre entre le condensateur et la lame de préparation.

11 faut un éclairage très intense : lampe à arc, lampe Nernst.

Le diaphragme iris sera complètement ouvert.

On utilisera l'objectif à immersion, apochromatique, à condition qu’il soit diaphragmé d'une façon particulière.

| 3. — Examen des microbes sans coloration

Avant la découverte des méthodes de coloration, on avait vu des microbes, même dans les coupes des tissus. On regardait directement les cultures délayées dans de l’eau, ou on traitait les coupes par les acides et les alcalins. Les coupes d’un tissu durci à l’alcool étaient plongées dans une solution forte d’acide acétique, puis dans une solution de potasse ou de soude à 2 p. 1 00 ; elles devenaient ainsi absolument transparentes, sauf dans les points contenant des amas microbiens. C’est ainsi que Beckmann avait vu des bactéries dans les vaisseaux du rein, bien avant d’en connaître la nature. Hetberg s’était servi de la potasse dans ses études sur la pyémie. Enfin, Baumgarten, par le môme procédé, avait vu, avant Koch, le bacille tuberculeux. Mais on comprend le peu de progrès réalisables par des méthodes aussi primitives, aujourd’hui complètement abandonnées. Le microbe, même en culture abondante, est à peine visible en raison de son peu de. réfringence ; il est absolument impossible de savoir si la culture est pure, etc. ..

L’examen des microbes sans coloration n’est plus usité. aujourd’hui que pour étudier leur développement , en cultures sous le microscope (p. 143 et 186), pour apprécier leur mobilité ou pour constater leur agglutination. Lors même qu’on vèut connaître la forme exacte et les mauvements des microbes,, c’est-

PRINCIPES GÉNÉRAUX DE COLORATION

à-dire les propriétés des microbes vivants, on se sert des méthodes de coloration (voir p. 239).

| 4. — Examen des microbes avec coloration

La coloration des microbes est la base de leur examen microscopique.

A) — Généralités

1° Avantages de cette méthode. — Ils sont nombreux. La coloration permet de découvrir des microbes là où ils étaient invisibles. Elle est indispensable pour étudier la forme des microbes, leurs mouvements, les particularités de leur structure telles que cils, spores, forme des extrémités, etc. Elle est précieuse pour la classification, en faisant connaître les propriétés chimiques de certains microbes : méthode de Gram, de Ziehl, etc. Seule, la coloration permet de voir les microbes dans les coupes et d’étudier leur distribution, leurs rapports avec les cellules. Enfin, la coloration rend possible la conservation pendant plusieurs mois ou davantage des types de préparations de cultures, des coupes qu'on peut montrer, dessiner, photographier.

2° Historique (Weigert. Koch, Ehrlich) . Principes généraux. — On sait que la découverte des réactions chimiques des tissus, la possibilité de différencier certaines de leurs parties au moyen de réactifs, date de l'introduction du carmin en histologie par Hartig, en 1854, et Gerlach, en 1858. Mais, en 1871 seulement, Weigert appliqua le carmin ammoniacal à la coloration de certains cocci. En 1872, Eberth et Wagner réussissaient à colorer des cocci à l’aide de l’hématoxyline, mais échouaient pour les bacilles. La véritable découverte de la coloration pratique des microbes date de 1875, et elle appartient à Weigert L Le premier, Weigert emploie les couleurs d’aniline

1 Weigert, Z ur Technik der mikroskopischen Bactérien , Untersuchungen Virchow’s Arch., t. LXXXIY.

(le violet de méthyle) et montre que les cocci sont colorés par les réactifs du noyau ; le premier, en outre, il réussit à décolorer les tissus autour des microbes. Il plongeait les coupes dans une solution d’hématoxyline qui colorait en bleu noyaux et cocci ; il décolorait les noyaux à l’aide d’une solution étendue de potasse et d’acide acétique ; ces coupes furent les premières où seuls les microbes restaient colorés . L’hématoxyline ne réussissant pas à colorer les bacilles, Weigert leur appliqua les couleurs d’aniline ; c’est en 1877 que furent ainsi obtenus les premiers bacilles colorés. Cette même année 1877 voit naître les travaux de Koch 1 qui fait entrer définitivement dans la pratique l’usage des couleurs d’aniline en montrant l’intensité, la sûreté, la rapidité de cette méthode de coloration. En 1878, Koch obtient des coupes entièrement décolorées, sauf les microbes, en les lavant dans une solution de carbonate de potasse ; il était sur la voie de la découverte du bacille tuberculeux. En 1881, Weigert montre les premières coupes avec double coloration ; les microbes étant colorés par le bleu de méthylène, et les noyaux en rouge par le picro-carmin. En 1882, Koch colore une espèce déterminée (le B. tuberculeux ) par un procédé non applicable aux noyaux et aux autres microbes. Les couleurs d’aniline étaient définitivement entrées dans la pratique. Mais quelles couleurs employer ?

Ici se placent les travaux d’EHRLicH 2 et de ses élèves Schwarze et Westphal (1880). Weigert, Eberth et Wagner avaient fait admettre qu'il y avait une relation entre les réactions chimiques et la forme du microbe ; le carmin, l’hématoxyline, la safranine (un des meilleurs réactifs des noyaux) coloraient les cocci et non les bacilles. Obermeyer (1873) croyait que les spirilles se coloraient moins bien que les autres formes microbiennes. C’était une erreur ; il n’y a aucune relation entre la forme et la réaction chimique, cette dernière est spéciale pour une espèce

1 Koch, Untersuchungen über Bactérien, Cohn’s Beitrâge zur Biol, der Pflanzen, III.

2 Ehrlich, Technik der Bactérien Untersuchung, Zeits. f. kl. Medicin, I et II.

PRINCIPES GÉNÉRAUX DE COLORATION

donnée et dépend de la couleur employée ; c’est ce qui va ressortir de l’exposé des expériences d’EHRLiCH et de son école.

Ehrlich a diviséles couleurs d’aniline (lesquelles sont des sels) en basiques, acides ou neutres. Les couleurs basiques sont celles dont la base est colorante, tandis que l’acide ne l’est pas ; ainsi, dans l’acétate de rosaniline, c’est la rosaniline qui est colorante. Dans les couleurs acides , au contraire, l’acide est colorant, la base ne l’est pas : ainsi, dans le picrate d’ammoniaque, c’est l’acide picrique qui a les propriétés colorantes. Les couleurs neutres sont celles qui sont composées d’un acide et d’une base doués tous les deux du pouvoir colorant ; exemple : le picrate de rosaniline. Voici un tableau des principales couleurs d’aniline.