COLORATION DES MICROBES VIVANTS

4° Outillage nécessaire pour les colorations. — Il faudra des provisions de couleurs diverses en poudre, des solutions

d’acide nitrique ou sulfurique, liquide iodo-ioduré, etc., un bec Bunsen ou une lampe à alcool, une aiguille à dissection, des lames et des lamelles.

B) — Coloration des microbes vivants

Cette méthode de coloration ne s’applique naturellement qu’à l’examen des cultures et quelquefois des exsudats, mais nullement à celui des coupes. Elle sert à observer la forme réelle du microbe qui n’est pas rétracté par la dessiccation, ses mouvements1, ses dimensions.

On se sert pour colorer le microbe sans le tuer de solutions aqueuses très diluées ; la dilution doit être telle que la goutte

1 Nombre d’espèces microbiennes sont mobiles. Cette mobilité est un caractère assez important pour la diagnose. Elle est très variable : très rapide ou très lente. La translation des microbes s’exécute suivant des modes très divers : progression régulière d’avant en arrière, autour d’un axe longitudinal, par oscillations. Les spirilles se meu-

en papier, des verres de montre ou des coupelles en porcelaine, 'des verres à pied, des pinces Cornet (fig. 132), des flacons divers simples ou à compte-gouttes contenant différents liquides : alcool, solutions

Pissette.

écrasée entre la lame et la lamelle paraisse incolore. On met une goutte d'une pareille solution au centre d’une lame, et on dépose sur elle une goutte de la culture à examiner. Si la culture est liquide, on la puise directement ; si elle est solide, on en délaie une parcelle dans une solution de sel marina ; on peut aussi ajouter un peu de solution saline à la culture liquide. La goutte de culture déposée sur la goutte de solution colorante, on les écrase avec une lamelle qu’on scelle à la paraffine, si l’examen doit être un peu prolongé. La préparation est prête à être examinée. Le fond paraît incolore, les microbes se détachent suffisamment colorés avec tous leurs mouvements, leur forme réelle. Si l’étude des mouvements est le véritable but de l’opération, on se servira avec avantage de la chambre humide de Ranvier (p. 145). Les mouvements cessent dès que l’oxygène de la goutte est absorbé, on prolongera leur durée en emprisonnant une bulle d’air entre la lame et la lamelle, ou en introduisant dans la goutte des fragments d’algues vertes d’après le procédé d’ENGELMANN.

On peut opérer un peu différemment. On place côte à côte sur la lame la goutte de culture et une goutte très fine de solution colorante concentrée. On fait rejoindre les deux gouttes par leur bord en appliquant la lamelle : les microbes ont alors des degrés inégaux de coloration, suivant qu’on les examine en un point plus ou moins rapproché de la tache colorante.

Macé recommande l’usage du vert de méthyle qui ne colore pas uniformément ; J. Courmont la fuchsine ouïe violet de gentiane.

Petit à petit les microbes réduisent et détruisent les couleurs. On en a tiré une méthode pour apprécier la richesse microbienne du lait.

vent comme des anguilles. Les microcoques exécutent des mouvements de giration sur eux-mêmes.

Cette mobilité est due aux cils vibratiles (p. 254).

Les microbes les plus rapides sont le V. cholérique , le B. d'Eberth, le B. subtilis 118 cm. à l’heure, Lehmann). La mobilité varie naturellement avec l’àge de la culture (diminuant avec le vieillissement) avec la température ambiante (diminuant avec l’abaissement de t°), etc. Les antiseptiques, les sérums agglutinants la font diminuer ou disparaître.

MÉTHODE GÉNÉRALE DE COLORATION

Les microbes ainsi colorés finissent par mourir. E. Roux et Sergent ont ainsi créé un Pneumocoque atténué pouvant servir de vaccin.

G) — Coloration des microbes après fixation (hors des coupes)

En laissant de côté, pour le moment, la coloration des microbes dans les coupes histologiques, nous devons étudier les méthodes de coloration des microbes présents dans les cultures, ou les produits pathologiques quelconques. On appelle frottis le mode de préparation qui consiste à écraser un tissu entre deux lames ; les débris sont colorés et examinés ; les microbes, certaines formes cellulaires, apparaissent ainsi suffisamment. Le frottis ne peut remplacer les coupes, mais constitue un procédé rapide pour la coloration des microbes dans un tissu.

La base de la coloration des microbes, dans ces conditions, est la fixation; les microbes sont tués et fixés dans leur forme sur la lame qui subira les différents bains de la coloration. Depuis longtemps (1838) Ehremberg avait employé la dessiccation pour fixer les infusoires ; Ehrlich avait également chauffé une goutte de sang pour étudier les globules. Koch appliqua ce procédé à la bactériologie, en 1879.

1° Méthode générale. — Elle comprend un certain nombre de temps :

A. Étalement. — Il faut d’abord étaler la matière contenant les microbes entre deux lames.

On prend deux lames bien sèches, et on dépose à d’extrémité de l’une d’elles la goutte de culture ou la parcelle de tissu, de pus, de lait, etc., destinée à être examinée. Les cultures sur milieu solide sont au préalable délayées, dans une goutte d’eau distillée et stérilisée, sur la lame elle-même ; les liquides pathologiques peuvent être centrifugés. On recherchera de préférence les parties solides du pus, des exsudats. On recouvre la première lame avec une seconde, et on fait glisser alternativement l’une contre l’autre les deux lames. Lorsque la goutte liquide paraît

uniformément étalée, lorsque le frottis est suffisamment écrasé, on .sépare brusquement les deux lames par glissement, chacune d'elles peut être utilisée.

On peut aussi étaler les produits sur la lame avec l’extrémité de la pipette qui sert au prélèvement, avec le bord d'une lame rodée ou d’un petit morceau de bristol.

Il est quelquefois intéressant de constater le groupement naturel des microbes d’une culture solide. Koch a employé la préparation par impression (Klatschprâparat) pour étudier les colonies du B. tuberculeux. On applique légèrement une lamelle sur la face supérieure d une colonie qui s’accole au verre (voir p. 483).

B. Dessiccation. — Pour opérer la dessiccation il suffit de laisser la lame à l’air libre, sous une cloche pour éviter les poussières; mais la dessiccation est longue. On peut l’activer par l’agitation dans l’atmosphère chaude ; au-dessus de la flamme d’un bec Bunsen ou en déposant la lame à l'étuve à 37°.

On utilisera aussi la platine chauffante (fig. 133).

MÉTHODE GÉNÉRALE DE COLORATION

C. Fixation. — On doit fixer solidement la préparation à la lame pour que les manipulations ultérieures ne l’entraînent pas. On obtient cette fixation en coagulant les matières albuminoïdes : il se produit une véritable rétraction qui fait adhérer au verre. C'est le temps le plus délicat des préparatifs de la coloration. On obtient une fixation excellente en mettant la lamelle dans une étuve à + 115°; on préfère, pour aller plus vite, la passer simplement au-dessus de la flamme d’une lampe à alcool ou d’un bec Bunsen, en la tenant entre les doigts. On promène lentement la lame en la faisant passer trois fois sur la flamme, le côté de la préparation en l’air, « comme si on coupait du pain » (Koch). Ces trois passages suffisent à porter la lame à -f- 120°. La fixation est très difficile si le bouillon de culture contenait de la glycérine (cultures du Bacille de Koch ou Bacille de la morve).

On peut encore fixer rapidement avec quelques gouttes d’alcool absolu que l’on enflamme sur la lame ou on peut attendre l’évaporation spontanée de l’alcool absolu, de l'alcool-éther (âà) dans lesquels les lames ont été maintenues quelques minutes.

D. Goloratjom. — Deux procédés sont employés. Le premier consiste à faire tomber quelques gouttes de la solution colorante sur la lame.

a. Les bains colorants simples se composent d’une solution d’une couleur d’aniline quelconque :

Solution alcoolique : I

Eau 10

on laisse en contact pendant deux à dix minutes suivant le colorant.

Pour obtenir une coloration plus intense, on prolonge le contact pendant vingt-quatre heures à froid, ou pendant dix mi- . nutes à chaud, jusqu'à production de vapeurs. Ce chauffage (Koch, Loeffler) se fait dans une étuve à -f- 50°, ou au-dessus d’une flamme, il faut renouveler la matière colorante pendant l’opération pour éviter la dessiccation à la surface de la lame.

p). Un autre procédé consiste à employer un mordant (procédé

imité de la teinture) qui, se combinant à la fois avec la matière colorante et l’élément cellulaire, les unit plus intimement. Citons parmi les principaux mordants :

Acides

acétique, oxalique.

Phénol à 5 p. 100 (Ziehl). Créosote.

Tanin à 25 p. 100.

Iode en solution iodo-iodurée.

Bichlorure de mercure.

Potasse à 0,01 p. 100 (Koch, Lôffler).

Alcalins ] Ammoniaque.

[ Aniline (Ehrlich, 1882).

L’huile d’aniline est blanche lorsqu’elle est bien pure, mais brunit très facilement. On fait un mélange d’une partie d’huile pour vingt d’eau, on agite fortement, on laisse reposer cinq minutes, et on filtre sur papier mouillé jusqu’à clarification. On appelle eau d’aniline le produit de la filtration ; il peut se conserver assez longtemps. L’eau d’aniline est de moins en moins utilisée.

On emploie'couramment (et presque uniquement) les liquides à mordants pour toutes les colorations. On devra préparer les suivants :

1° Liquide phéniqué de Ziehl (1882) :

Fuchsine ou rubine 1 gramme.

Phénol neigeux 5 —

Alcool à 90°. . . 10 —

Triturer d’abord la fuchsine et l’alcool ; ajouter le phénol ; agiter jusqu’à dissolution. Ajouter :

Eau 90 cent, cubes.

Attendre vingt-quatre heures. Filtrer. Avec les solutions mères (1 p. 10) préparées à l’avance on peut obtenir rapidement les solutions phéniquées en mélangeant 10 centimètres cubes de la solution mère et 90 centimètres cubes d’eau phéniquée à 5 p. 100.

Ce liquide colore tous les microbes à froid en quelques

MÉTHODE GÉNÉRALE DE COLORATION

secondes, sauf le Bacille tuberculeux qui exige une plus longue exposition (voir p. 259). 11 ne doit être employé que pour la coloration des cultures, car le phénol détermine des grumeaux dans les préparations de sang, de pus, d’exsudats.

2° Bleu phéniqué de Kühne :

Bleu de méthylène 1 gramme.

Phénol neigeux 1 —

Alcool absolu 10 cent, cubes.

Eau 100 —

Liquide à placer à côté de celui de Ziehl.

3° Bleu alcalin de Lof fier (1884) :

Solution alcoolique de bleu de mé-

thylène 30 cent, cubes.

Potasse 0CC,01

Eau 100 cent, cubes.

4° Violet aniline d'Ehrlich, Weigerl :

Solution alcoolique saturée de violet de gentiane ou de violet de

méthyle 5 cent, cubes.

Eau d’aniline 100 —

à mélanger au moment de l’employer.

5° Thionine phéniquée (Nicolle) (voir p . 270) :

Solution saturée de thionine dans

alcool à 50° 10 cent, cubes.

Eau phéniquée à 1 p. 100 100 —

C’est, peut-être, le plus usité des colorants ordinaires.

6° Bleu de Roux. — Préparer séparément chacune des deux solutions :

Violet dahlia 1 gr.

Alcool absolu 10 —

Eau distihée. . Q. S. p. 100 —

Vert de méthyle. ... 2 gr.

Alcool absolu 20 —

Eau distillée. . Q. S. p. 200 —

Au bout de vingt-quatre heures, les mélanger. Filtrer. Conserver en flacon bien bouché.

Toutes ces solutions doivent être filtrées au moment de s’en servir. On verse sur un petit entonnoir garni d’un filtre, et on fait tomber directement sur la lame.

y) . Dans les vieilles cultures, surtout en bouillon, existent des ' matières précipitées qui se colorent comme les microbes et nuisent à la netteté de la préparation.

Pour remédier à cet inconvénient Thoinot et Masselin recommandent de' colorer à la fuchsine phéniguée de Ziehl pendant cinq à quinze minutes, rincer et sécher. Plonger ensuite la | préparation dans de Y huile d’aniline jusqu’à décoloration en apparence totale, puis passer dans Yessence de bergamotte ou de girofle et enfin dans le xylol.

Guiraud et Gautié (1901) recouvrent la lame d’une solution aqueuse saturée de bleu daniline et chauffent jusqu’à dégagement de vapeurs, à deux ou trois reprises. On lave à grande eau. La lame paraît complètement incolore. L’opération ne dure pas cinq minutes. Seuls les microbes sont colorés.

E. Décoloration, doubles colorations. — a) Le plus souvent la coloration est terminée, et on passe de suite au lavage. Mais, lorsqu’on veut auparavant décolorer la préparation en totalité ou en partie (voir Colorations spéciales ), on se sert des substances suivantes :

Glycérine

Essence de girofle.

Huile d’aniline.

Acide acétique, 0,5 à 1 p. 100.

— chlorhydrique, 10 gouttes par 500 cent, cubes d’eau.

— nitrique, 25 p. 75 (Ehrlich).

— sulfurique, 25 p. 75 ou 100.

Carbonate de potasse (Koch).

Alcool-acétone (5 p. d’alcool absolu, 1 p. d’acétone) (Nicolle). Eau de lithine (Kühne) .

P) Les doubles colorations sont employées comme réactions histochimiques (Gram, Ziehl), pour apprécier certaines particu-

Eau

Alcool

MÉTHODE GÉNÉRALE DE COLORATION

larités de structure (capsulé) ou de développement (spores) on les utilise surtout pour distinguer, dans les produits pathologiques, les bactéries des éléments des tissus (leucocytes, hématies, granulations protoplasmiques ou nucléaires libérées par la fixation). Le rouge ressort bien sur le vert et le bleu, le violet sur la vésuvine, l’éosine, la chrysoïdine (fauve). A côté de ces colorations successives se placent les colorations substitutives . Dans ce cas, le second bain est à la fois décolorant et recolorant pour certains éléments (voir plus loin). Les colorations électives n’emploient qu’une seule matière colorante qui colore différemment les éléments. Le violet de méthyle colore en violet les noyaux et les microbes, et en rouge la substance amyloïde ; le vert de méthyle colore en vert noyaux et microbes, et en violet la substance amyloïde. En colorant avec du bleu de méthyle un lambeau de mésentère d’une souris morte de péritonite suppurée à Staphijlocoques , on voit les microbes en bleu, et certaines cellules conjonctives ( Mastzellen d’EHRLiCH) présentant un noyau incolore et des granulations (basophiles) violettes. Le bleu de méthylène colore en violet les cellules adipeuses. BABÈs.a vu certains microbes colorés en bleu avec des points rouges par le bleu de méthylène.

On peut, enfin, mais surtout avec les coupes, obtenir des triples et quadruples colorations.

Ce 5e temps variëra seul dans les méthodes de colorations spéciales.

F. Lavage. — On lave à l’eau, en faisant couler sur la face colorée l’eau delà pissette. Si la coloration reste trop intense, on peut laver rapidement à l’alcool.

G. Dessiccation, examen, conservation. — Il faut d’abord reconnaître le côté de la lame qui est recouvert par la préparation ; on gratte dans un angle avec une fine aiguille à dissociation. La lame est desséchée soit entre des doubles de papier mousseline soit, après avoir rassemblé l’excès d’eau sur un des bords de lame en soufflant à sa surface, par agitation à l’air libre, au-dessus de la flamme d’un bec BuAsen, sur la platine chauffante ou à l’étuve (37°) . Les deux faces de la lame

doivent être parfaitement sèches avant l'examen. La préparation colorée, lavée, séchée peut être examinée. Il suffit de déposer une petite goutte d’huile de cèdre en un point quelconque de la partie colorée et de porter sur la platine du microscope. Si la préparation doit être conservée, on enlève l’huile de cèdre par le xylol et on essuie avec un linge fin.

2° Colorations spéciales. — Certains microbes jouissent d’affinités spéciales pour certaines solutions colorantes.

A. Méthode de Gram1. — a. Méthode primitive. — Cette méthode imaginée par Gram, en 1884, est basée sur la propriété qu’a l’iode de former avec le violet un nouveau composé qui a une affinité particulière pour certains microbes, et colore beaucoup moins les tissus que le violet aniliné. Elle sert de caractère très important pour la diagnose des espèces.