COLORATION DES CAPSULES

du B. tuberculeux ; on comprend pourquoi la question des spores de ce dernier est encore pendante.

G. Coloration des capsules (fig. 138). — Séjour de quatre à six secondes dans le violet de gentiane phéniqué (p. 249).

Passage rapide dans l’alcool-acétone au tiers.

Ou bien, séjour de deux minutes (ou moins : 20 à 30 secondes pour Boni) dans le Ziehl.

Fig. 138.

Préparation d’un crachat de pneumonique, montrant un grand nombre de Pneumocoques encapsulés.

Gr. = l 000 D.

Laver à l’eau, décolorer rapidement dans l’eau acidulée (une goutte d’acide acétique pour un verre de montre plein d’eau).

Colorer ensuite pendant quatre à cinq minutes, dans le liquide de Lôffler,

Ou encore, colorer avec une goutté de :

Acide acétique

0 , , ( violet de gentiane

Sol. alcoolique | ou kryst^ violet

Eau distillée

1 gramme.

| 5 cent, cubes.

pendant une demi-minute à une minute. Laver. Sécher. Monter au baume.

Ou encore Méthode à l’encre de Chine (voir p. 252).

D) — Coloration des microbes dans les coupes

Le frottis, le grattage sont suffisants pour savoir si un tissu renferme des microbes. La coloration dans la coupe histologique est indispensable pour étudier la distribution des microbes, leur quantité, etc.

Weigert a, le premier, en 187 J, coloré les microbes d’une coupe.

1° Préparation de la coupe. — De bonnes coupes très minces sont absolument indispensables.

On recueillera les pièces aussitôt que possible après la mort, immédiatement après pour les pièces expérimentales.

A. — La fixation s’obtient en plongeant immédiatement des cubes de 1 centimètre d’arête de l’organe dans un bain fixateur.

On emploiera le sublimé acétique (sublimé a saturation dans l’eau avec 5 p. 100 d’acide acétique cristallisable) pour les organes volumineux comme le poumon par exemple ; au bout de six heures, on pratiquera quelques incisions; le séjour complet est de douze heures.

Le liquide de Flemming :

Acide chromique à 1 p. 100 15 grammes.

Acide osmique à 2 p. 100 4 —

Acide acétique glacial 1 —

est préférable, mais pénètre moins.

On emploie aussi un mélange :

Sublimé à saturation 500 grammes.

Acide chromique à 1 p. 100 500 —

Acide osmique 1 —

Acide acétique glacial 100 —

B. — Le durcissement s’obtient ensuite par des séjours successifs de vingt-quatre heures dans des alcools à 60°, 80°, 96°,

COLORATION DES MICROBES DANS LES COUPES

et 100°. Un séjour trop prolongé dans l’alcool entraverait la coloration. On évitera le liquide de Millier.

C. — L’inclusion doit se faire de préférence dans la paraffine, et non dans la celloïdine. Au sortir de l’alcool absolu, la pièce est plongée pendant vingt-quatre heures dans le xylol à la température du laboratoire. On la transporte alors dans un mélange à parties égales de paraffine et de xylol, placé dans une étuve à -f- 34°, où elle fait un nouveau séjour de vingt-quatre heures. Enfin, on la met, pendant au moins vingt-quatre heures, dans la paraffine fusible à + 54° maintenue liquide dans une étuve réglée à -f-55°. Le fragment sort assez mou ; on le laisse durcir à l’air pendant quelques instants, on le dépose dans un cadre métallique où on verse de la paraffine qui se solidifie. C’est ce morceau de paraffine contenant le fragment à couper qui est fixé au microtome.

Si les fragments sont très minces, on peut supprimer le deuxième temps et diminuer des deux tiers la durée des deux autres. On doit même y tendre le plus, possible.

D. — La section s’obtiendra au moyen des microtomes les plus perfectionnés; on recherche plutôt la minceur que l’étendue.

On pourra avoir besoin des coupes en séries (numération des bacilles d’un tubercule par exemple). Dans les deux cas nous conseillons le microtome Minot (fig. 139).

: Les coupes devraient être reçues dans V alcool absolu , et non

dans de l’eau, toutes les fois qu’on veut colorer les microbes avant le fond ; mais, avec l’inclusion à la paraffine, on est obligé de les recevoir dans l’eau tiède pour leur permettre de s’étaler ; le xylol dissout la paraffine mais la coupe a beaucoup de peine à s’étaler. Pour débarrasser la coupe de la paraffine, l’immersion dans l’éther est à recommander. Ensuite : alcool

Fig. 139.

Microtome Minot.

absolu pendant quelques minutes. Ensuite : eau distillée, dans laquelle on la prend avec la lame porte-objet.

E. — Si la coupe est très friable, il est préférable de la coller de suite sur la lame par un badigeonnage préalable de celle-ci avec un mélange à parties égales de blanc d’œuf et d’essence de girofle [fixation). On déshydrate alors par l’alcool et on traite la lame comme un frottis.

2° Coloration de la coupe. — D'une façon générale, la coloration des coupes s’obtient parles mêmes méthodes que pour les frottis sur lamelles, mais il faut une action plus prolongée des bains colorants ou décolorants. En outre, les coupes supportent mal la chaleur.

A. Méthode générale. — Si on cherche à découvrir dans une coupe des microbes dont on ne connaît pas d’avance les propriétés, on doit se servir d’une méthode pouvant colorer tous les microbes indistinctement. Lorsqu’on sait d’avance quel microbe on recherche, on ne se servira de la méthode générale que pour les microbes ne prenant pas le Gram et ne se colorant pas par VEhrlich.

Il suffit de laisser séjourner la coupe pendant dix minutes dans une solution hydro-alcoolique quelconque et de décolorer par l’alcool à 90°. On peut, secondairement, colorer le fond avec une solution aqueuse de teinte opposée, à la première.

a. Il est cependant certaines couleurs qui sont à conseiller en premier lieu. Kühne préconise le bleu de méthylène comme la matière qui colore le mieux l’ensemble des bactéries. Il conseille la technique suivante :

1° Séjour d’une demi-heure dans :

Alcool absolu 10 grammes.

Bleu de méthylène l«r,5

Solution phéniquée 5 p. 100 100 grammes.

2° Rincer à l’eau ; puis 3° dans :

Acide chlorhydrique 10 gouttes.

Eau bouillie 60 grammes.

jusqu’au bleu tendre ;

COLORATION DES MICROBES DANS LES COUPES

4° Rincer dans :

Sol. aq. concentrée de carbonate de li-

thine 6 à 8 gouttes.

Eau. 10 grammes.

o° Rincer quelques secondes dans l’eau;

6° Déshydrater légèrement dans l’alcool absolu ;

7° Déshydrater complètement par un séjour de quelques minutes dans :

Huile d’aniline pure 10 grammes.

Bleu de méthylène Une pointe de couteau-

dont on met quelques gouttes dans de l’aniline pure :

8° Rincer dans de l’aniline pure ;

9° Séjour de deux minutes dans une essence bien fluide (thymène, térébène, etc.) ,

10° Deux séjours successifs dans le xylol pour débarrasser de l’huile d'aniline ;

Puis si on veut une double coloration :

11° Séjour de deux à dix minutes dans le bain :

Huile d'aniline 10 grammes.

Safranine Une pointe de couteau.

12° Rincer dans l’huile d’aniline pure ; les coupes doivent conserver une teinte rosée ;

13° Deux minutes dans une essence bien fluide ;

14° Deux séjours successifs dans le xylol pour débarrasser de l’huile d’aniline :

15° Monter au baume.

p. Une autre méthode consiste à colorer le fond en premier lieu.

Séjour pendant vingt-quatre heures dans le carmin boracique à l'alcool de Grenacher :

Carmin N° 40 3

Borax 4

Eau 100

Alcool à 90° 100

ou dans le carmin lithiné de Or th :

Sol. aqueuse saturée de carbonate de lithine . . 97,5 Carmin N° 40 2,5

On lave rapidement dans la solution :

Alcool . 400

Acide 1

puis à l’eau, et on colore ensuite les microbes par un des procédés ordinaires.

y. Nicolle 1 recommande la thionine comme seul colorant à employer pour les microbes qui ne prennent ni le Gram ni VEhrlich. La thionine (violet de Lauth) est une couleur soufrée appartenant an même groupe que les bleus de méthylène et de toluidine. Elle ne surcolore pas. Elle constitue « le réactif colorant le plus énergique et le plus sûr », grâce à son affinité pour les microbes et sa faible solubilité dans l'alcool absolu.

La coupe est débarrassée de la paraffine à l’aide de xylol, puis traitée par l’alcool absolu.

Séjour d’une demi-minute, à une minute dans la solution :

Sol. saturée de thionine dans alcool à 50° 10 cent, cubes.

Eau phéniquée à 1 p. 100 ..... 100 —

Lavage à l’eau ;

Déshydratation par alcool absolu ;

Eclaircissemènt au xylol ;

Montage au baume.

On emploierait l’éosine pour mie seconde coloration.

La figure 140 représente une coupe.de foié de cobaye contenant des bacilles charbonneux traitée par la thionine et l’éosine.

B. Coloration par la méthode de Gram. — On colorera par le Gram les coupes contenant des microbes qui restent colorés par cette méthode. On emploiera la méthode modifiée par Nicolle. Voici la technique pour obtenir une triple coloration (thionine, carmin, Gram ) :

Débarrasser de la paraffine à l’aide du xylol ;

Enlever le xylol par l’alcool absolu ;

1 Nicolle, Pratique des colorations microbiennes. Annales Pasteur,

COLORATION DES MICROBES DANS LES COUPES

Laisser un quart d'heure dans le carmin de Orth alcoolisé par addition de d’alcool à 95° ;

Laver à l’eau ;

Laisser quatre à six secondes dans le violet phéniqué ;

Fig. 140.

Coupe de foie de cobaye contenant des Bacilles charbonneux.

Les bacilles sont violets.

Mettre quatre à six secondes dans la solution forte de Lugol en la renouvelant deux fois ;

- Décolorer par l’alcool-acétone ;

Passer rapidement dans l’alcool picriqué ;

Déshydrater par l’alcool absolu ;

Éclaircir par le xylol ;

Monter au baume.

S’il y avait dans la coupe un mélange de microbes dont les

uns prennent le Gram et les autres se décolorent, on colorerait dans une solution hydro-alcoolique de fuchsine après la décoloration par F alcool-acétone.

Weigert avait modifié la méthode de Gram en décolorant par :

Huile d'aniline . 2

Xylol 1

Avec son procédé la triple coloration est impossible, l’acide picrique étant très soluble dans l’huile d’aniline. Celle-ci est d’ailleurs altérable et les préparations brunissent à la longue.

C. Coloration des bacilles acido-résistants. — On recommande en général le procédé de B. Frænkel (p. 263). On doit lui préférer la méthode d’ÏÏERMANN ou celle de Kühne (p. 262). Hermann conseille l’éosine pour teinter le fond ; le chrysoïdine est préférable.

La meilleure méthode est peut-être celle de Kühne (p. 262).

Colorer d’abord les noyaux par un séjour de deux minutes dans l’hématoxyline ou mieux l’hématéine ;

Laver à l’eau ;

Séjour de quinze minutes dans le liquide de Ziehl ;

Faire passer quelques secondes dans l’aniline chlorhydrique à 2 p. 100 :

Décolorer à l’alcool ;

Éclaircir au xylol ;

Monter au baume.

3° Montage de la préparation. — Les coupes exigent une déshydratation très soignée avant d’être montées dans le baume au xylol. L ’ alcool est le meilleur déshydratant, mais il décolore souvent trop ; Yhuile d’aniline (Weigert) ne peut être employée dans tous les cas. Kühne recommande de colorer très légèrement l’huile d’aniline avec la matière qui a servi à colorer la coupe, pour éviter une trop grande décoloration. On peut encore employer la dessiccation (Kühne). Pour dessécher une coupe, on dépose la lame (face en bas) sur une autre lame qu’on chauffera à 30° sur une lampe à alcool, jnsqu’à ce que la