ORIGINE DES PRODUITS SOLUBLES

Pneumobacillus liquefaciens bovis, et dans la sérosité du poumon de bœuf atteint de péripneumonie. La voie était ouverte ; la classe des substances solubles albumosiques, ayant des propriétés pathogènes, des toxalbumines, était créée. Or, à l'heure actuelle, presque toutes les toxines sont considérées comme des corps albuminoïdes ; les ptomaïnes existent, mais ont une importance bien moindre en pathologie.

On découvre coup sur coup : la diastase pyogène du Staphylocoque pyogène (de Christmas) , les propriétés diastasiques des substances vaccinantes du sang charbonneux (Roux et Chamberland), des toxiques diphtérique (Roux et Yersin) et tétanique (Ivnud Faber), des produits solubles du Bacillus heminecrobiophilus (Arloing), d’une partie des toxines du Staphyloocque pyogène (J. Courmont et Rodet), etc.

Ce sont donc les toxalbumines qui jouent le rôle capital en pathologie infectieuse. Ce sont des corps amorphes, solubles dans l’alcool faible, insolubles dans l’alcool absolu, l’éther, le chloroforme, la benzine, le sulfure de carbone, etc. Ils sont très solubles dans l’eau. La plupart, à l’état de solution dans l’eau, s’altèrent à -{- 65°. Leur composition est très mal connue. Ils sont quaternaires avec soufre et phosphore. Beaucoup se comportént comme de véritables albumines ; beaucoup ont des propriétés zymotiques. Ces différents corps ont, en somme, entre eux des analogies plus apparentes que réelles, et semblent s’éloigner des véritables matières albuminoïdes par leur faible teneur en azote. Ces substances sont peut-être des intermédiaires entre les albumines vraies et les alcaloïdes (Hugounenq, A. Gautier). Les toxalbumines agissent à des doses infinitésimales.

Les toxalbumines microbiennes ont leurs analogues dans les toxines végétales (abrine, ricine) et dans les toxines animales (venins, sérum d’anguille).

Ajoutons que Charrin, Gley, Guillemonat, font jouer un rôle important au x produits solubles volatils.

5° Origine des produits solubles microbiens. — On est

encore bien peu fixé sur l’origine des toxalbumines micro-

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biennes. Sont-elles sécrétées de toutes pièces parle microbe, ou ne sont-elles que des transformations des substances albuminoïdes existant normalement dans les bouillons de culture ? Pour résoudre la question il faudrait obtenir des toxalbumines en cultivant les microbes dans des milieux ne contenant pas de substances protéiques. C’est ce qu’on fait certains auteurs (Arnaud et Charrin, Guinochet, Ouchinsky, Lepierre, etc.), cultivant le B. 'pyocyanique, le Vibrion cholérique et le Bacille diphtérique dans des milieux dépourvus de substances albuminoïdes (voir leur composition, page 76). Ouchinsky a retiré de ses liquides des toxalbulmines ayant les mêmes propriétés que celles qui proviennent des cultures en bouillon. Les microbes pourraient donc fabriquer de toutes pièces, par synthèse, des substances albuminoïdes en empruntant l’azote à des corps minéraux. Malheureusement, les conclusions d’OucHiNSKY n’ont pu être confirmées (Hugounenq, Doyon). Il se pourrait, d’ailleurs, que les toxalbumines ne soient pas des corps albuminoïdes, mais adhérent simplement à ces derniers. Brieger et Baer, dans leur étude des toxines diphtérique et tétanique, concluent que la substance active n’a pas les réactions de l’albumine ou de la peptone et représente « un groupement atomique inconnu en chimie ».

| 2. — Préparation des produits solubles

Pour préparer et isoler les produits solubles d’une culture, il faut opérer en plusieurs temps.

1° Virulence de la semence. — Il faut d’abord possédera l’état de pureté un échantillon, aussi virulent que possible, du microbe dont on veut essayer les produits. Certains microbes se conservent longtemps avec leur virulence (B. tuberculeux ) ; il suffira de les employer tels quels. Le plus souvent il faudra renforcer la virulence de la semence, et ce premier temps sera quelquefois très laborieux.

On renforce, en général, la virulence d’un microbe, en le faisant passer un grand nombre de fois par l’organisme d’un

PRÉPARATION DES PRODUITS SOLUBLES

animal très récepteur. On arrive ainsi à posséder des cultures d’une grande activité ; or, les produits solubles en seront toxiques en proportion.

On exalte la virulence du Staphylocoque pyogène en le faisant passer par le lapin ; on injecte la culture dans le sang et, à la mort de l'animal, on puise la semence dans Je sang du cœur ; on injecte un nouveau lapin avec la culture très jeune, ou directement avec le sang, et ainsi de suite ; les lapins meurent de plus en plus vite, et les microbes qui en proviennent sont de plus en plus virulents. C'est par cette méthode (d’abord sur des souris, puis sur des lapins) que Marmorek a pu obtenir un Streptocoque tuant le lapin à

-100 OOP 000 ou même quelquefois 1 000 ôoo ooo de centimètre cube.

On renforce le bacille de la diphtérie en le faisant passer par le cobaye. Roux, Metchnikoff et Taurelli-Salimbeni ont exalté la virulence du Vibrion cholérique, au point de posséder des cultures tuant le cobaye à 1 /60e de centimètre cube. Pour cela, ils alternent un grand nombre de fois des cultures sur gélose, et des cultures en solution de peptone, dans un sac de collodion placé dans le péritoine du cobaye (voir p. 137).

On n’a pas toujours besoin de faire passer un microbe par l'animal pour lui restituer sa virulence. S. ARLOiNGetTaucHOT ont pu renforcer la virulence du Streptocoque pyogène en changeant la composition du bouillon. Arloing conseille aussi de faire une sélection parmi les individus microbiens d’une culture. On fait végéter dans des conditions légèrement dysgénésiques, on réensemence dès le premier trouble, et ainsi de suite pendant plusieurs passages. Ce sont les individus les plus vivaces qui ont résisté.

Meyer et Ruppel ont obtenu des Streptocoques immédiatement très virulents (tuant la souris à ^ ou même • ^ de centi-

mètre cube) en les ensemençant directement de la lésion humaine dans du sang humain défibriné.

La semence virulente obtenue, il faut la conserver à cet état, ce qui est souvent très difficile. Le Vibrion cholérique , le Pneumocoque perdent très rapidement leur virulence. On cultivera

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les microbes dans des milieux appropriés. C’est ainsi que Marmorek conserve la virulence de son Streptocoque en le cultivant dans un mélange de sérum et de bouillon (voir p. 86). il faut surtout réensemencer fréquemment les cultures, le vieillissement étant une des causes les plus sûres de l’atténuation.

Lorsqu’un microbe est très atténué, on peut l'inoculer en l’associant à un autre microbe et obtenir ainsi la mort de l’animal.

Il n’est pas prouvé, qu’il soit nécessaire, pour avoir des produits solubles très vaccinants, d’employer une semence aussi virulente. Cette habitude de l'exaltation préalable sera peut-être à réformer, pour la préparation des sérums immunisants.

2° Culture définitive. — Lorsqu’on possède une semence bien virulente, il faut choisir les conditions dans lesquelles on fera la culture destinée à être expérimentée pour l'extraction des produits solubles.

Le milieu liquide sera approprié au microbe. On retrouvera, p. 64, et à la deuxième partie, les bouillons les plus convenables pour obtenir les toxines les plus communément employées (toxine tétanique) .

11 sera bon d’avoir des bouillons assez riches en%sels minéraux. On évitera autant que possible, les sucres dont la fermentation engendre des acides.

La culture sera faite en général à -f 37°.

Elle végétera, naturellement, dans le vide pour les microbes anaérobies. Hueppe et S'choll croyaient même que le V. cholérique (facultatif) fabriquait plus de toxines dans le vide qu’à l’air. J. Courmont et Doyon ont vu le contraire. On aura souvent avantage à faire passer un courant d’air à la surface du bouillon de culture étalé en couche mince, comme cela se pratiquait autrefois pour la préparation de la toxine diphtérique.

L 'âge auquel la culture doit être employée, est très variable suivant les microbes. On filtre une culture bien aérée de diphtérie, en bouillon ordinaire, vers le vingt et unième jour; en bouillon Martin, le cinquième jour; une culture de tétanos vers

PREPARATION DES PRODUITS SOLUBLES

le dix-huitième ou vingtième jour (ou plus tôt) ; une culture de Vibrion cholérique vers le quatrième jour (Roux et ses collaborateurs) .

En principe, on essaie, en tâtonnant, des cultures filtrées à différents âges, et on adopte l’âge qui donne la toxine la plus active.

3° Séparation physique des substances solubles. Stérilisation de la culture. — Plusieurs moyens ont été préconisés et sont employés pour obtenir un liquide débarrassé de tout germe vivant.

A. Décantation. — Ce serait le procédé de choix s’il n’exposait à avoir une toxine renfermant encore des microbes vivants ; il éviterait l’action toujours nocive des filtres, de la chaleur, etc. Certains microbes, tels que le Streptocoque pyogène , le B. tuberculeux, ne troublent pas le bouillon, végétant, le premier en flocons au fond du ballon, le second en voile à la surface ; on pourrait donc, à la rigueur, décanter avec soin le bouillon limpide. Pour les microbes qui troublent le bouillon, il faut laisser reposer de vieilles cultures dans de hautes éprouvettes.

Tous ces procédés sont défectueux, et surtout n’offrent aucune sécurité pour l’asepsie de la toxine. C’est cependant par décantation suivie d’une filtration sur coton, que S. Arloing a pu isoler certaines substances solubles sécrétées par le Bacillus anthracïs.

B. Filtration. — C’est le procédé le plus usuel. Nous avons donné tous les détails des procédés de filtration au chapitre n, pages 47 et suivantes. Nous rappelons simplement que les filtres en porcelaine retiennent une très grande quantité de produits solubles et peuvent même modifier ceux qui passent. Les membranes de collodion présentent les mêmes inconvénients tandis que la viscose se montre beaucoup plus perméable aux toxines.

Certaines cultures sont tellement épaisses ou glaireuses que le filtre est vite encrassé ; on fera bien de les fitrer au préalable sur papier. On éprouvera aussi de grandes difficultés à filtrer les bouillons additionnés de sérum, de glycérine. Pour les liquides peu toxiques, on pourra évaporer dans le vide afin de réduire le volume du substratum .

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C. Dialyse. — Ce procédé a été employé par P. Carnot et L. Fournier (1900) pour étudier les produits solubles du Pneumocoque. Le principe consiste à cultiver le microbe en milieu liquide contenu dans un vase dont les parois dialysables laissent sortir les toxines et entrer de nouvelles substances nutritives. On peut ainsi maintenir longtemps la végétabilité de la culture et extraire journellement des toxines dont les modifications sont intéressantes à étudier.

Un flacon (A) (fig. 157) est bouché par un flacon en caoutchouc percé de deux orifices inégaux. L’un livre passage à un tube de verre (B), percé de trous et tapissé de collodion, absolument comme on fabrique les sacs de collodion. L’autre maintient un petit tube en verre (C). Tous deux sont bouchés à la ouate. Le liquide nutritif (D) remplit aux deux tiers le flacon (A) et le tube (B). Le tout est stérilisé à l’autoclave.

On ensemence l’intérieur du tube (B), on prélève les toxines et on ajoute les matériaux nutritifs par le tube (C).

Voir le dialyseur usuel, p. 332 et fig. 159.

D. Chauffage. — Un autre procédé consiste à stériliser la culture par la chaleur. On ne peut mettre ce procédé en parallèle avec le précédent . Tandis qu’avec la filtration on n’obtient que les substances solubles sécrétées par le microbe de son vivant et ayant diffusé dans le bouillon (et même une partie seulement de ces substances), on a, par le chauffage : la totalité des produits solubles soit diffusibles ( substances extra-protoplasmiques), soit retenus dans le protoplasma pendant la vie du microbe et que ce dernier abandonne- en mourant ( substances intra-protoplasmiques ). En outre, le chauffage peut modifier profondément les produits solubles, soit directement, soit en faisant sécréter des substances différentes par le microbe pendant sa

Fig. 157.

Dialyseur de Carnot et Fournier.

PRÉPARATION DES PRODUITS SOLUBLES 327

période d’agonie. Le chauffage doit donc être employé dans certains cas, et la filtration dans d’autres. Certains microbes (B. anthracis, B. tuberculeux ) retiennent leurs sécrétions dans leur protoplasma ; la filtration ne livrerait pas la toxine. On peut, après le chauffage, filtrer sur papier pour se débarrasser des cadavres microbiens. La température et la durée du chauffage varieront naturellement suivant les microbes et

Fig. 158.

Bain-marie avec régulateur métallique de Roux.

seront toujours réduits au minimum nécessaire. J. Courmont et Rodet tuent le Staphylocoque pyogène par un chauffage de vingt-quatre heures à -J- 55°. J. Courmont et Doyon tuent le Vibrion cholérique en l’exposant pendant quarante-huit heures à -(- 53°. Il faut l’ébullition prolongée pour les microbes à spores. On obtiendra en général un liquide beaucoup plus toxique par le chauffage que par la filtration ( Staphylocoque pyogène) ; cependant, les cultures chauffées du V. cholérique ne sont pas plus actives que les cultures filtrées (Roux, J. Courmont et Doy.on) .

Citons comme exemple la préparation de la tuberculine brute. On sait que le bacille tuberculeux se cultive à la surface du bouillon glycériné (p. 476). On stérilise à l’autoclave à 110°, on concentre au bain-marie, dans une capsule de porcelaine, en

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agitant fréquemment avec une baguette de verre. Lorsque le liquide est réduit au 1 /10e dans son volume, on filtre sur papier. La tuberculine est donc bien comme l’avait dit Koch d’un façon assez obscure : un extrait glycérine de cultures -pures de bacilles de la tuberculose : mais c’est un extrait des produits solubles intra- et exlra-protoplasmiques des microbes.

Le chauffage d’une culture peut se faire à l’autoclave lorsqu'on a besoin d’une température supérieure à •+ 100°. Sinon, on exposera simplement la culture dans une étuve réglée à la température voulue, ou on chauffera au bain-marie. Nous recommandons le bain-marie, schématisé, figure 158, construit par Wiesnegg sur les indications de Nocard ; il est muni d’un régulateur métallique de Roux (voir p. 127) qui est contenu dans un manchon métallique traversant l’eau. Ce bain-marie servira encore pour les évaporations, etc., etc.

E. Trituration mécanique des microbes. — La tuberculine préparée par le procédé indiqué par Koch, n’ayant pas donné les résultats attendus dans le traitement de la tuberculose de l’homme, plusieurs auteurs (Brieger et Proskauer, Klebs, Hunter, Kühne, Roemer) ont cherché à la purifier, à en extraire le principe curateur. Koch a voulu extraire les substances retenues par le protoplasma microbien, après les manipulations précédentes, -et sa nouvelle tuberculine serait bactéricide, ne provoquerait pas de réactions fébriles, guérirait le cobaye tuberculeux, etc. (v. p. 502).

La tuberculine A (alcaline) s’obtient en laissant pendant trois jours les bacilles, à la température de la chambre, au contact d’une solution de soude caustique à 10 p. 100. On filtre sur papier et on neutralise. Les bacilles sont morts, mais il en reste un certain nombre dans le liquide. Cette tuberculine a les mêmes propriétés que la tuberculine brute ; elle a, en plus, l’inconvénient de produire des abcès dus aux cadavres bacillaires.

Les autres tuberculines sont obtenues en triturant les bacilles pour en extraire mécaniquement les substances intraprotoplasmiques. Cet écrasement des bacilles tuberculeux est très difficile. On fait sécher des cultures dans le vide , et on les

PRÉPARATION DES PRODUITS SOLUBLES

triture, sans rien y ajouter, dans un mortier d’agate, avec un pilon de même substance, longuement, jusqu’à ce que le microscope montre la destruction des corps bacillaires.

On émulsionne le résidu dans l’eau distillée, et on centrifuge pendant trente ou quarante-cinq minutes (4000 tours par minute) . Le liquide obtenu est la tuberculine O, qui contient les substances solubles dans la glycérine, et se rapproche beaucoup de la tuberculine brute ou de la tuberculine A ; elle ne produit i pas d’abcès, mais n’est pas immunisante.

Le précipité boueux, qui est resté adhérent aux parois du vase, après la première centrifugation, est repris, séché à nout veau, retrituré, recentrifugé plusieurs fois de suite. On épuise ainsi presque tout le précipité ; la masse entière de la culture des bacilles tuberculeux est successivement transformée en liquides, qui ont les mêmes propriétés (sauf le premier : tuberculine O) . Ces liquides, mélangés, constituent la tuberculine R y (résiduelle) qui constitue, pour Koch, le liquide curateur de la | tuberculose. Elle est bactéricide, ne produit ni abcès ni réaction fébrile à doses faibles, elle immunise le cobaye et le guérit s’il est déjà tuberculeux. Elle contient les substances insolubles dans I la glycérine ; elle n’a donc aucun rapport de nature avec les autres tuberculin es (voir p.500).

Pour que la tuberculine R produise tous ses effets, il faut : i 1° posséder une culture très virulente (il y a de grandes différences dans la virulence des cultures même récentes) ; 2° une culture très jeune ; 3° une culture ayant végété à l’abri de la lumière ; 4° dessécher dans le vide; 5° employer de I suite la poussière obtenue ; 6° triturer longuement dans un mortier d’agate ; 7° centrifuger avec un appareil puissant.

F. Antiseptiques. — On a essayé de tuer les microbes au moyen d’antiseptiques, mais la présence de ceux-ci dans la toxine est une mauvaise condition d’expérimentation. On a aussi tué les microbes par l’action prolongée du chloroforme.

G. Précipitation. — Les toxines adhèrent à certains précipités. On peut ainsi les extraire du liquide ambiant.

On ajoute, par exemple, au liquide toxique quelques gouttes

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d’une solution concentrée de phosphate de soude, puis quelques gouttes d’une solution de chlorure de calcium ; le précipité de phosphate de chaux est rassemblé par centrifugation. Ce sont surtout les substances diastasiques qui adhèrent ainsi aux précipités. Cette adhérence est tellement forte que plusieurs lavages successifs ne suffisent pas, le plus souvent, à priver le précipité des propriétés toxiques acquises.

Par ce procédé, les microbes ne sont pas détruits.

4° Isolement chimique des substances solubles. — On

emploie, en général, les produits solubles à l’état de dilution et de mélange dans le bouillon de culture, simplement privé de germes vivants, comme il vient d’être dit.

Pour l’étude chimique de ces produits, il faut aller au delà i.

A. Extraction des toxines alcaloidiques (dont les ptomaïnes font partie.

a. Extraction par l'alcool. — On peut séparer les alcaloïdes par la précipitation des substances albuminoïdes au moyen de l 'alcool.

Le liquide filtré est légèrement acidulé à l’acide tartrique et additionné immédiatement de 13 à 20 volumes, au moins , d’alcool à 95°. On laisse vingt-quatre heures à l’obscurité. On filtre ; les substances albumosiques ont précipité et restent sur le filtre. On distille, sous pression réduite, à-f- 43°. Tout l’alcool étant évaporé, on acidulé franchement par l’acide tartrique, et on laisse digérer quelques heures à -j- 43°. On filtre et on lave le résidu à l'alcool fort. On évapore au bain-marie, à -f- 45°, jusqu’à consistance sirupeuse. Le sirop est mélangé à 8 ou 10 fois son volume d’alcool absolu, pour précipiter les sels minéraux. On laisse vingt-quatre heures, on filtre et on chasse l’alcool en disposant la capsule sur l’eau tiède.

1 Consulter à ce sujet le remarquable article de Hugounenq, in Traité de pathologie générale de Bouchard, t. II, p. 243, chap. x, de l’article Infection de Charrin. Nous lui empruntons beaucoup. Consulter aussi le chapitre xvm du Précis cle Chimie physiologique , de Hugounenq. Doin, 1897.

PRÉPARATION DES PRODUITS SOLUBLES

Le résidu acide est épuisé à deux ou trois reprises par de l’éther et du pétrole bouillant vers -f- 40° qu’on décante à travers un filtre déjà imprégné de dissolvant. L’éther est abandonné à l’évaporation spontanée.

Le résidu, toujours acide, est repris d’abord par la benzine, puis par le chloroforme.

On alcalinise alors le résidu par un léger excès d’ammoniaque et on l’épuise par l’éther de pétrole, la benzine, le chloroforme, l’alcool amylique.

On évapore la liqueur mère et on traite le sirop par l’alcool fort ; on filtre, et on dissout le résidu dans l’eau. On peut encore extraire de nouvelles substances (Hugouneng et Eraud, 1891). '

On purifie par redissolution et cristallisation.

En général, on se sert d'une méthode moins longue et moins coûteuse pour savoir si les alcaloïdes d'une culture ont des propriété^ toxiques. On précipite par 5 ou 6 volumes d’alcool à 95°, maintenus vingt-quatre heures en présence, on filtre pour retenir le précipité, on évapore ce qui a passé, et on reprend le résidu par l’eau.

b. Extraction par V éther . — On alcalinise par la potasse, et on épuise par l’éther. On décante et on évapore. L’alcaloïde est purifié en le transformant en sel qu’on fait cristalliser plusieurs fois. Le produit, dissout dans l’eau alcaline, cède à l’éther la base libre, pure.

Mais, tous les alcaloïdes ne sont pas solubles dans l’éther et la purification est difficile,

c. Extraction par le chlorure mercurique. — Le liquide est porté à l’ébullition, filtré et précipité par le chlorure mercurique. On filtre. Le précipité et la liqueur, traités séparément par l'hydrogène sulfuré, fournissent un précipité de sulfure mercurique qu’on sépare par le filtre. On réduit les deux liqueurs par évaporation. On lave à l’alcool absolu. L'alcool de lavage est réuni aux eaux mères qu’on évapore. On précipite alors par le chlorure d’or et le chlorure de platine.

L’ébullition qui est la base de ce procédé, du à Brieger, est une condition très défectueuse.

PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

d. Extraction des alcaloïdes volatils. — Gautier a donné un procédé pour isoler les alcaloïdes volatils1 2 3.

B. Extraction des toxines albuminoïdes. — On n’obtiendra jamais que des produits impurs si on â cultivé le microbe en milieu contenant des matières albuminoïdes ou des peptones : ce qui est d'ailleurs le cas ordinaire.

On traite le liquide filtré (toxine) par 20 volumes d 'alcool à 95°. Au bout de vingt-quatre heures, on décante la majeure partie de l'alcool, on jette sur un filtre et on lave à l’alcool. On

reprend le précipité par l'eau et on dialyse 2 pendant quinze heures. On ajoute au liquide aqueux un grand excès d’alcool absolu, on laisse déposer, on filtre, on lave à l’alcool et on dessèche dans le vide. Opérer rapidement et à l’abri de la lumière. Si on distille l’alcool, on retrouve une certaine quantité de substance non précipitée.

Brieger et Bauer 3 isolent la toxine diphtérique en traitant une

1 Bulletin de V Académie de Médecine, janvier 1886.

2 Les toxines albumosiques ne dialy sent pas .

Un dialyseur se compose de deux récipients et d'une membrane de papier, parchemin. Le récipient le plus vaste est un cristallisoir contenant de l’eau distillée : l’autre a une forme variable, mais est ouvert aux deux bouts ; son extrémité inférieure est fermée par un tambour en papier parchemin fortement lié par un fil. Ce dernier reçoit la substance à dialyse r et est plongé dans le cristallisoir de façon que le papier affleure l’eau distillée qui doit être changée de temps en temps. Il faut s’assurer au préalable que le parchemin n’a pas de trous ; pour cela on l'étend sur du pa,pier filtre et on passe plusieurs fois une éponge mouillée ; le papier filtre doit rester sec. Nous recommandons le dispositif représenté figure 159. Deux tubulures latérales [b, b,) du cristallisoir (B) permettent d’établir un courant d’eau. Le récipient central (A) repose sur des supports.

3 Brieger et Bauer, Deutsche medizinische Wochenschrift, 3 déc. 1896-

Fig. 159.

Dialyseur.

CONSERVATION DES PRODUITS SOLUBLES

Ballon contenant les toxines après filtration.

culture en bouillon peptoné filtré par une solution de chlorure de zinc à 1 p. 100; ils décomposent le précipité insoluble par l’action successive du bicarbonate, du phosphate et du sulfate d’ammoniaque .• Lq substance amorphe obtenue est soluble ; elle tue le cobaye avec les symptômes classiques, et peut immuniser.

Elle ne donne pas les réactions de l’albumine ou de la peptone.

Certains produits solubles diastasiques adhèrent aux

précipités. C’est ainsi que Roux et Yersin ont vu la toxine diphtérique être entraînée par les précipités d’albumine et de phosphate de chaux.

| 3. — Conservation