IV. — COUPES A LA PARAFFINE

Pour exécuter ces coupes, il est indispensable de posséder un microtome automatique. Les microtomes à main ne conviennent pas du tout pour ce genre de li:avail, car ils ne fournissent que des coupes fortement enroulées, très difficiles à manipuler. Quant aux instruments à bon marché, du type microlome d'étudiant, le mieux est de les passer sous silence. Pour faire de bonnes coupes à la paraffine et au collodion, il faut un microlome sérieux et bien construit, lien est de cet instrument comme du microscope :

1. Anitschkov, Ueber die Methoden zur Aufklebung von Gefrierschoitten auf die Objekttrager. Ztschr. f. loiss. Mikr., XXVII, p. 71, 1910.

c'est une dépense qu'on fait une fois pour toutes, aussi faut-il acheter un objet de première qualité. Pour 200 à 250 francs, on peut avoir un excellent microlome genre Minot, avec lequel on exécute du travail parfait.

Nous avons appris à considérer la méthode à la paraffine comme le procédé hislologique fondamental, aussi nous étendrons-nous particulièrement sur la manière d'obtenir des coupes avec les blocs de pai'affine ^

Rasoirs. — Nous avons donné p. 320, fig. 134, le type des rasoirs pour coupes à la paraffine. Ce rasoir doit avoir un dos très épais et une lame formant un angle assez ouvert, de manière à diminuer autant que possible les vibrations.

Micro tomes. — Les microtomes qui se prêtent le mieux aux coupes à la paraffine sont ceux dans lesquels le rasoir est immobile et solidement fixé au bâti de l'appareil, par ses deux extrémités. L'objet est mobile et rencontre le rasoir avec une certaine vitesse qui, combinée à la masse du chariot et du volant, produit une force vive suffisante pour produire très facilement la section du bloc. Ce type de microtome est

exactement l'inverse Fig. 163. — Microtome de Minot, modèle de Leitz.

de celui qui est réalisé

par les microtomes dits à celloïdine. Les meilleurs modèles de microtome à paraffine sont le xMinot, le Radais et le rocking; tous trois sont automatiques. C'est au Minot que nous donnons la préférence; il constitue, pour nous, le type du microtome destiné au travail courant de micrographie.

Le microtome du type Minot est faljriqué par un grand nombre de maisons. La figure 163 représente le type adopté par Leitz : cet instru-

1. Bien entendu les blocs mixtes au collodion et à la paraffine doivent être coupés d'après ce procédé et fournissent d'excellents rubans, exactement comme les blocs à la paraffine pure.

ment unit la précision à la simplicité et à la solidité, c'est celui dont nous nous servons actuellement et qui nous donne toute satisfaction. Le principe du microtome de Minot consiste à faire mouvoir et avancer l'objet, |)ar le jeu combint' de deux coulisses perpendiculaires. Le volant, bien équilibré, agit, par l'intermédiaire d'un axe horizontal, sur une bielle qui produit le mouvement de va-et-vient d'un chariot glissant dans une coulisse verticale, taillée dans un fort pilier. Ce mouvement de bas en iiaut actionne le mécanisme qui, par l'intermédiaire d'une roue dentée, fait avancer le chariot porte-objet dans la coulisse horizontale. Voici comment se produit cet avancement : le chariot vertical porte un levier (jui vient buter sur un excentrique. Suivant la position de cet excenti-ique, un autre levier, portant un crochet à son extrémité, entraîne un plus ou moins grand nombre de dents de la grande roue dentée. Celle-ci actionne la vis micrométrique qui fait avancer le chariot horizontal. Tel est le principe du microtome de Minot : les modèles des divers constructeurs varient très peu. On peut les classer en doux groupes : d'une part, le modèle Zimmermann possède deux leviers commandant la vis micrométri([ue, ce qui permet d'avoir 10 épaisseurs de coupes diflerentes; d'autre part, les autres modèles ne possèdent qu'un seul levier, ce (jui limite le nombre des épaisseurs possibles à 6. Mais la maison Leitz a très élégamment tourné la difficulté en adojjtant l'excentrique, ce qui porte à 18 le nombre des é])aisseurs de coupes qu'on peut obtenir. Ces épaisseurs varient, pour le Zimmermann, de un demi-i;. à 20 [X et pour le Lêitz de 1 [j. à 25 [x.

Le microtome Radais ', fabriqué par Stiassnie, est un instrument parfait, dont le seul défaut est son prix élevé. Il coûte en elfet 500 francs, alors qu'un bon Minot ne vaut que 200 à 250 francs. Dans le Radais, le porte-objet n'a qu'un seul mouvement vertical; le mouvement micrométrique horizontal est reporté sur le cluiriot du rasoir. On peut couper indifféremment le collodion ou la parafline, en modillant l'inclinaison du rasoir. Nous verrons (jue le Minot possède le même avantage.

Le microtome rocking, du type Cambridge, est fabriqué par un grand nombre de constructeurs. C'est avant tout un instrument léger, utilisant les rasoirs ordinaires et ne pouvant couper que de petites pièces. En effet, il n'y a pas ici de coulisses comme dans le Minot : le bras porteobjet oscille autour d'un axe (jui tourne dans une gorge demi-cylindrique. Cet axe est maintenu en ])lace par un ressort à boudin; on comprend donc que, si la résistance de l'objet dépasse celle du ressort, le bras est repoussé en arrière et les coupes ne se font plus, f^n outre, |)ar suite de la nature du mouvement du bras porte-objet, la pièce décrit une trajectoire, d'où il résulte que les coupes sont des calottes sphériques à très faible courbure, au lieu d'être planes comme avec le Minot ou le Radais. Malgré ces inconvénients, le rocking est un excellent instrument, très sérieux et bien moins cher que le Minot ou le Radais. Il est iiulispensable qu'il soit muni d'un porte-objet à trois axes indépendants, permettant une orientation parfaite de l'objet.

A la rigueur, on peut faire des coupes à la parafline avec les microtomes à celloidine des types Jung ou Thonia, mais les résultats ne sont pas aussi bons et il est notamment difliril(> d'obtenir des coupes en

1. M. Radais, Microtonie à cliariot verlicat sans glissière. Arch. de zool. expcr. et yen. (4), I, notes et revue, p. 65-75, 1903.

rubans. Ceci est dû à ce que le rasoir est mobile et à ce qu'il peut vibrer trop facilement, puisqu'il n'est fixé que par une extrémité.

Emploi du microtome de Minot. — Cel emi)loi nécessile les opùrations suivantes : pi'éparalioii de l'objet, orientation du rasoir, confection des coupes'.

1. Préparation de l'objet. — Le bloc de paraffine, obtenu après l'inclusion, est taillé à la forme convenable et fixé sur le plateau porte-objet. Lorsqu'on s'est servi des barres de Leuckart ou des boîtes en papier, on obtient des blocs prisiuatiques, dont on doit retrancher l'excédent de paraffine. 11 suffit que l'objet soit entouré de tous cotés par un mur très mince d'environ 1 à 2 mm. d'épaisseur. Le bloc ne sera pas trop haut, 10 à 15 mm. suffisent largement pour les pièces de dimension moyenne. Lorsqu'on a inclus dans un verre de montre ou dans une capsule, on taille la masse de paraffine en forme de prisme rectangulaire. La paraffine doit être débitée par petits copeaux, avec une lame bien tranchante. Il ne faut jamais essayer de couper un bloc en deux ou d'enlever une portion épaisse, car on risque de voir la masse se fendre irrégulièrement et de détériorer l'objet. Les rognures de paraffine sont soigneusement mises à part pour être refondues, filtrées au besoin et poiu' servir à confectionner de nouveaux blocs.

Pour fixer le bloc sur le porte-objet, on commence par recouvrir ce dernier dune couche de paraffine, soit en le trempant dans cette substance fondue, soit au moyen d'un fer à luter (fig. 181). Au moment de fixer le bloc, on fait fondre cette couche de paraffine avec le fer et on ap])lique rapidement le bloc. Pour assurer une adhésion parfaite, il faut encore, avec le fer chaud, faire fondre la paraffine autour des quatre côtés et, au besoin, en ajouter un peu, de manière à former un bourrelet. Le tout est refroidi sous un robinet d'eau.

On procède alors à la taille définitive du bloc. En effet, peu importe que les faces latérales aient une direction quelconque, mais il est essentiel que les faces supérieure et inférieure soient parallèles, au moins dans le plan de section. S'il en est autrement,

1. Il va sans dire que le microtome doit être solidement tixé à la table avec des vis ou avec deux presses à vis. Pourtant, avec les modèles lourds comme celui de Leitz, il suffit de poser l'instrument sur une main de papier jo=eph pour lui assurer une stabilité suffisante.

on obtient nn ruban courbe, difficile à étaler et à coller correctement; les ])réparations ainsi obtenues ont généralement un aspect très disgracieux. On taille le bloc avec un scalpel ou un vieux rasoir.

Fig. 164.

Appareil pour tailler les blocs de parafnne.

Il existe des appareils (|ui facilitent beaucoup cette opération et permettent de donner aux blocs de paraffine une forme géométrique. Un des plus pratiques est représenté par la figure 164. C'est celui de Zimmermann de Leipzig. Le porte-objet est fixé dans une coulisse, terminée par un tambour divisé : on peut couper les quatre faces exactement à angle droit, en amenant successivement en face de Tiiidex les extrémités

de deux diamètres perpendiculaires.

La vis S sert à avancer et à reculer l'objet. Le couteau est guidé par les deux tiges verticales.

La face supérieure doit être rendue bien plane, en grattant la paraffine avec le scalpel, jusqu'à ce que la surface de Tobjet soit visible.

Lorsque le bloc est collé et taillé, on fixe le porte-objet sur le chariot et, au moyen de trois axes indépendants, ou de la genouillère, suivant le modèle, on oriente exactement l'objet, pour le couper perpendiculairement à son axe et parallèlement à la face qui a été repérée au moment de l'inclusion.

2. Orientation du rasoir. — Le rasoir est fixe et placé perpendiculairement au bloc à couper, mais le tranchant peut être plus ou moins incliné vers ce bloc. Cette inclinaison doit être suffisante })Our que l'objet, dans son mouvement de va-et-vient vertical, ne puisse toucher le dos élargi du couteau. Une inclinaison insuffisante se reconnaît aussi au son métallique émis jiar le rasoir, lorsque l'objet repasse devant lui, avant d'avoir été avancé par la vis micrométrique. Au moment où se fait la coupe, on entend un bruit sourd, qui résulte de l'écrasement de l'objet par le rasoir. Si on arrête alors le mouvement de la vis micrométrique et si on fait faire à l'objet une course verticale, on constate qu'il se produit une deuxième coupe, bien que l'objet n'ait pas été avancé. En effet, le bloc, comprimé lors de la première coupe, reprend sa longueur par élasticité. Par suite de cette compression, les coupes sont })lissées et d'épaisseur inégale.

Une inclinaison trop forte est tout aussi préjudiciable. A chaque cou})e, la lame vibre et émet un son sec et élevé. Non seulement les coupes ont tendance à s'enrouler, mais elles sont ondulées, c'est-à-dire que, par suite des vibrations de la lame, elles présentent des portions alternativement épaisses et minces. En outre, elles peuvent être fragmentées longitudinalement et, de temps à autre, des coupes manquent. Si Tluclinaison est par trop accentuée, le rasoir n'agit plus comme un coin, mais comme un racloir, et arrache des portions de tissus.

L'inclinaison se règle au moyen des vis de pression qui servent à fixer le rasoir. Ces vis sont généralement au nombre de quatre, disposées par paires de chaque côté du porte-rasoir. On peut adopter, comme règle pratique, que la facette qui fait face à l'objet doit être parallèle au plan dans lequel Tobjet se meut.

3. Confection des rubans de coupes. — Le rasoir étant convenablement incliné et le porte- objet fixé à la pince d'orientation, on libère l'arrêt du microtome et, saisissant le volant, on amène avec précaution l'objet au-dessus du rasoir, de manière à le placer bien parallèlement au tranchant. Il est très important que, pendant celle opération, l'objet ne touche pas le tranchant; il faut bien se garder d'en enlever une tranche épaisse, sous prétexte d'entamer le bloc. On risquerait de décoller l'objet et de détériorer gravement le rasoir. Il faut, au contraire, fixer l'objet à une petite distance du rasoir, un demi ou un quart de millimètre, et l'amener au contact de la lame par le jeu du chariot micrométrique.

Il est préférable, pour chaque nouveau bloc, de ramener la vis micromélrique à son point de départ. Avec le Minot de Leilz, cette manœuvre s'exécute instantanément, grâce à une pince spéciale qui permet de désembrayer la vis. Les positions respectives du rasoir el de l'objet se règlent ensuite pour chacun d'eux, soit avec la coulisse du rasoir, soit en avançant ou reculant le porteobjet, suivant la hauteur du bloc.

Avant de commencer à couper, il faut aussi régler Vépaisseur des coupes, au moyen du disque gradué ou de l'excentrique, suivant les modèles. On peut commencer à couper à 10 ou 12 [x, puis passer ensuite à 5 ou 6 a, qui est l'épaisseur normale des bonnes coupes histologiques. Si, pour entamer le bloc, on veut faire des coupes plus épaisses, il faut réserver pour cela une zone particulière du rasoir, car la partie du tranchaut ayant servi à

336 METHODES GKNERALES

faire des coupes épaisses ne peut plus donner de bonnes coupes minces, sans avoir été affûtée de nouveau.

Tout étant l)ien en place, on tourne la manivelle du microtome avec une vitesse modérée. Si le bloc a été bien inclus, le rasoir bien affûté et si la température est convenable, les coupes se collent automatiquement les unes aux autres, de manière à former une chaîne ou ruban. Cbacune s'attache par son bord antérieur à la coupe qui la précède et par son bord postérieur à la coupe qui la suit.

Les rubans de coupes constituent un des principaux avantages de la méthode à la parafline : ces rubans sont très faciles à manipuler et à coller sur les lames. Pour les coupes en série, on est absolument sûr de Tintégrité de la série et de la conservation de Tordre des coupes, sans qu'il soit possible d'en perdre ou d'en déranger sans s'en apercevoir.

Il est à conseiller de ne pas faire de rubans trop longs. On laisse les premières coupes glisser sur la lame et, dès que le ruban a dépassé celle-ci, on le saisit par son extrémité avec une pince fine, au moyen de laquelle on le soutient sans exercer de traction, tout en tournant la manivelle de l'autre main ^ On peut en dérouler ainsi 20 à 30 centimètres si les coupes se font bien. Pour couper le ruban, on prend un bon scalpel, au moyen duquel, sans lâcher la pince, on recueille l'autre extrémité du ruban sur la lame du rasoir, en ayant bien soin de ne pas rayer le tranchant. Le ruban est ainsi transporté, avec la pince et le scalpel, sur une feuille de papier où on l'étalé.

Il est bon de savoir que le moindre courant d'air peut déchirer le ruban et disperser les coupes. Il faut même éviter de parler en manipulant les rubans. Un autre accident provient de l'électrisation du ruban, qui se tord et ondule dans l'air et vient souvent toucher une pièce du microtome à laquelle il se colle. Pour éviter cet ennui, on ne débitera que de courtes portions à la fois.

4. Soins à donner au microtome. — Ils consistent à bien graisser les coulisses au moyen de bonne huile de vaseline. Il faut aussi que ces coulisses soient serrées juste à point, sans jeu ni excès de serrage. Ce réglage se fait, pour chaque coulisse, au moyen de deux ou quatre vis. La vis micrométrique doit être

1. Je considère comme superflus les appareils spéciaux destinés à dérouler les rubans de coupes sur une bande de papier ou de toile.

serrée suffisamment, autrement la roue dentée n'est pas entraînée par le levier et le chariot n'avance plus.

Dès qu'on a fini de couper, il faut enlever le rasoir et le remettre dans sa boîte. Cette précaution a non seulement pour but de ménager le tranchant, mais encore d'éviter des accidents très graves. Rien n'est dangereux comme de laisser un rasoir sur un microtome à paraffine; le tranchant dirigé en haut peut, à la moindre inattention, produire des coupures terribles.

Il va sans dire que la plus minutieuse propreté est de rigueur. Le rasoir doit être débarrassé, avec un chiffon imbibé de toluène, de la paraffine adhérente, provenant des débris de coupes. Cette opération doit être répétée, pendant la confection des coupes, autant de fois qu'il est nécessaire, car le ruban ne peut glisser convenablement si le rasoir n'est pas parfaitement propre.

Lorsque le microtome ne sert pas, il doit être recouvert d'une cloche, d'un cadre vitré ou au moins d'une boîte de bois ou de carton, de manière à le préserver de la poussière.

5. Insuccès et remèdes. — Malgié la perfection du mécanisme du iMinot, le débutant est souvent aux prises avec des difficultés qui le rebutent, lorsqu'il n'en connaît t)as la cause et le remède.

1. Les coupes ne se font pas : ou bien le chariot n'avance pas parce que la vis micrométrique est à fond de course, et alors il faut la ramener au point de départ, ou bien a du jeu, et alors il faut serrer la vis de réglage ; il arrive aussi que le rasoir n'a pas été serré dans sa pince et qu'il se déplace devant l'objet.

2. On entend un bruit métallique, dont il faut chercher la cause. Normalement le microtome est silencieux, on ne doit entendre que le bruit du levier qui rencontre l'excentrique et celui de l'encliquetage. Les autres bruits proviennent toujours du rasoir, dont l'inclinaison est mauvaise; il faut donc vérifier cette inclinaison. 11 peut arriver aussi, avec les blocs très bas et très plats, qu'une des vis d'orientation vienne buter sur une des pièces du chariot porte-rasoir. Dans ce cas, on modifie latéralement la position de ce chariot, ou bien on avance le porte-objet, de manière à pouvoir reculer un peu le chariot micrométrique horizontal.

3. Les coupes s'enroulent et le ruban ne se fait pas. Il y a à cela plusieurs causes : généralement, cet accident est dû à ce que la parafline est trop dure ou le laboratoire trop froid. On y remédie de plusieurs façons : 1" couper plus mince, 2° chauffer le laboratoire, 3° refaire l'inclusion définitive avec une paraffine plus tendre. Souvent le premier remède

suffit.

4. Les coupes se font bien, mais ne se collent pas : mêmes causes et mêmes remèdes que })0ur le n° 3. En outre, il suffit quelquefois de tourner un peu plus vite pour faire adhérer les coupes.

5. Les coupes se plissent exagérément et le ruban colle au rasoir. C'est le défaut contraire du précédent : la paraffine est trop tendre ou le

M. Langeron. — Précis de Microscopiç, -^^

338 iMETHODES GENERALES

laboratoire trop chaud. Voici comment on peut y remédier : i" couper plus épais; 2" couper dans un endroit plus froid (cave, courant d'air, etc.); 3" refroidir le bloc et le rasoir dans l'eau glacée et se hâter d'obtenir (juelques coupes; 4° refaire l'inclusion définitive avec une paraffine plus dure.

Ces inconvénients se font surtout sentir dans la saison chaude et dans les pays tropicaux. Pourtant, avec de la (taraffine à 55° et en coupant du grand matin, on peut arriver à tourner la difliculté.

6. Le ruban est courbé dans un plan horizontal. 11 a été dit (p. .333) que, pour empêcher cet accident, il fallait que les bords supérieur et inférieur du bloc soient exactement parallèles.

■ 7. Les coupes sont striées ou déchirées. Cet accident provient souvent d'un polissag(^ insuftisant des facettes du biseau : les petites dents et stries microscopiques suffisent pour dilacérer les coupes. Des débris de tissus, qui restent adhérents au tranidiant et se dressent au-dessus de son arête, suffisent aussi pour pioduire des stries et des décliirures. Dans ce cas, on y remédie en passant sur les deux faces du rasoir un linge imbibé de toluène ou simplement la pulpe du doigt.

8. Les coupes se détachent du ruban et ce dernier est troué de perforations régulières correspondant à l'objet. Cet insuccès se produit lorsque l'inclusion déTinitivc a été faite dans une paraffine trop froide : l'objet n'a pas pu faire corps avec elle. Le seul remède consiste à recommencer l'inclusion.

9. Les coupes sont à la fois plissées et ondulées: leur épaisseur n'est pas uniforme. Cet accident se produit avec un rasoir trop incliné ou avec des objets très durs. Dans le premier cas, le rasoir vibre avec un bruit sec; dans le second les tissus crient sous le couteau et se coupent jiar saccades, il faut alors bien alfùter le rasoir et couper très lentement, en recueillant au besoin les coupes une à une.

10. Les coupes se pulvérisent. Ccl accident arrive avec des tissus très durcis, cuits ou mal pénétrés par la paraffine. Il n'y a aucun remède, si ce n'est de collodionner la surface de section. Pour cela on se sert d'un petit pinceau et de celloïdine fluide, mais séchant en deux ou trois secondes, sans laisser de traces luisantes à la surface de la paraffine. On passe ce pinceau très légèrement sur la surface de section avant chaque coupe. Il faut avoir bien soin de ne pas mouiller les grands côtés du bloc, car les coupes adhéreraient au rasoir. Pour couper, on attend que la pellicule de collodion soit sèche. Les coupes sont recueillies une à une et collées au Schœllibaum (p. 350).

11. Les coupes ne sont pas toutes de la même épaisseur, (juelquefois même elles alternent régulièrement^. 11 peut y avoir plusieurs causes : le rasoir n'est pas bien immobilisé, il n'est i)as assez incliné, ou bien enfin la vis micrométrique est mal réglée ou usée.

Emploi du microtome rocking. — Les précautions à prendre sont les mêmes (lue pour le Minol. L'orientation du rasoir est automati({ue, car le porte-rasoir est très étroit et il suffit de bien serrer la lame avec

1. Il ne faut pas confondre cet accident avec un autre phénomène qui résulte de l'élasticité de la paraffine. Quand on cesse pendant quelques instants de manœuvrer le microtome. le bloc, qui a été comprimé par suite des cliocs successifs contre le tranchant du rasoir, reprend sa longueur primitive. Aussi la première coupe qui se détache, quand on recommence un autre ruban, est-elle toujours plus épaisse, mais les suivantes reprennent l'épaisseur primitive.

les deux vis de pression. L"oI)jcl doit être petit el pas trop dur. Aux causes d'insuccès déjà énumérées, s'ajoutent celles provenant de la résistance de l'objet qui peut dépasser la puissance du ressort antagoniste.