I. — COUPES A LA PARAFFINE

Les coupes à la paraffine sont collées sur lames, séchées, puis colorées et montées an baume. Un des grands avantages de la méthode à la paraffine est donc la possibilité d'effectuer toutes les opérations sur lames, procédé beaucoup plus facile, ]»lus rapide et plus sûr que celui qui consiste à transporter chaque coupe de liquide en liquide.

Collage des coupes sur lames. — Les rubans de paraffine que nous avons obtenus ont été transportés sur une feuille de papier et tenus à Tabri des courants d'air. On peut conserver longtemps ces rubans dans un tiroir, ou mieux dans des boîtes plates en carton, ayant environ 25 millimètres de hauteur et IS sur 24 centimètres pour la longueur et la largeur. Ce procédé est très commode pour conserver provisoirement des provisions de rubans débités, destinés à être collés ultérieurement, si la pièce est intéressante, ou à être distribués aux élèves, dans les laboratoires où on fait de l'enseignement.

Pour coller les coupes sur lames, on prélève, avec un bon scalpel, une ou plusieurs coupes et on les dépose sur une lame bien propre, c'est-à-dire lavée préalablement à l'alcool (p. 236). Ce prélèvement exige plusieurs précautions. La longueur du ruban à coller sera proportionnée à la dimension des lamelles. Lorsqu'il s'agit de coupes en séries, on en met le plus grand nombre possible dans un espace correspondant à la surface d'une ou de deux lamelles. On range les rubans côte à côte, en séries disposées en largeur (lig. 165, 1) ou en hauteur (fig. 165, 2]

Il faut, en calculaiil les dimensions, tenir compte de la dilatalion qu'éprouvera le ruban, une fois qu'il sera sectionné dans rinlervalle qui sépare deux coupes. Cette opération ne présente aucune difticulté avec les objets volumineux ou de teinte foncée (pièces fixées aux mélanges osmiques ou picriques), mais elle peut être délicate avec des pièces très petites ou incolores. Dans ce cas, un bon moyen est de prévoir la difficulté avant de faire les coupes et de donner au bloc une forme trapézoïdale, en coupant les petits côtés non parallèles. Il en résulte une série de crans, correspondant chacun à la ligne qui sépare deux coupes successives.

On peut encore incliner légèrement le bloc sur Thorizonlale, de manière à ce que les grands côtés ne soient pas tout à fait parallèles au rasoir; on obtient encore une série de crans, délimitant les

coupes.

Étalement des coupes. —

Certains micrographes déposent Fig. 165. — Deux manières de ranger 1 1 11 .•' j / n sur une lame les rubans de coupes

les coupes sur de 1 eau tiede (albu- ^^ séries. mineuse ou non), contenue dans

une capsule ou un cristallisoir et ne les recueillent sur les lames que lorsqu'elles sont étalées. Je ne conseille pas ce procédé qui, à mon avis, ne convient que pour les coupes un peu épaisses et de grande surface qu'on traite isolément. Je préfère beaucoup procéder à Tétalement sur lames; c'est le seul procédé applicable aux coupes minces et aux séries.

On peut opérer de deux façons : ou bien on dispose les coupes sur la lame, comme il a été dit plus haut, et on introduit sons ces coupes, avec une pipette, sans les déranger, le liquide qui sert à étaler et à coller; c'est là, à mon avis, le procédé de choix. Ou bien on verse sur la lau.e une grosse goutte de liquide et on dépose les coupes sur cette goutte; ce dernier procédé convient très bien pour distribuer des coupes à des élèves, car, une fois en contact avec le liquide, elles ne risquent plus de s'envoler au moindre courant d'air.

Uuoi qu'il en soit, dès que celte opération est effectuée, on porte les lames chargées de coupes sur une étagère de Malassez (fig. 1 47) modérément chauffée ou au-dessus de l'étuve à paraffine. La seule

diffiCLillé de l'étalement consiste à clianffer les lames juste assez pour que les coupes s'étalent sur le liquide tiède, sans toutefois que la paraffine fonde. Avec un peu d'attention, il est facile d'y arriver, en choisissant sur l'étagère l'endroit où la température est la plus favorable. Il faut aussi que les coupes flottent librement sur une couche épaisse de liquide. On voit alors les coupes se déplisser et devenir d'une planéité parfaite ; à ce moment, on relire la lame de l'étagère et on procède au séchage.

Insuccès et remèdes. — Avant d'étudier cette seconde opération, nous devons passer en revue les divers insuccès qui peuvent se produire.

1" Les coupes ne se déplissent pas, même en élevant la température. Cet accident est le plus fréquent, car si les coupes froncées s'étalent d'ellesmêmes, les plis véritables sont beaucoup plus difficiles à faire disparaître. Dans ce cas il faut, avant de chauffer, déplisser les coupes sur la goutte de liquide avec des aiguilles. Pour cela, on coupe les bords ' du - ruban de paraffine en face des plis et on exerce de légères tractions longitudinales. On fera bien, pour les coupes incolores, d'opérer sur fond noir (fig. 228). Il est inutile de tenter le déplissement après chauiïage et commencement d'étalement, car alors les plis sont irrémédiablement collés.

2° Il peut y avoir des huiles d'air sous les coupes : il est nécessaire de les enlever avant de chauffer. Pour cela on déplace légèrement les coupes à la surface du liquide. En cas de bulles particulièrement tenaces, la dernière ressource est de piquer la bulle, à travers la coupe, avec une aiguille.

3" La paraffine fond. Tant ijue cet accident est limité aux l>ords du ruban, rien n'est perdu. Il suffit de retirer promptement la lame de la plaque chauffante et de la déposer sur un corps froid. On peut encore souffler délicatement sur les coupes pour hâter le refroidissement. Mais si la paraffine qui soutient la coupe a fondu, il n'y a plus aucun remède, car les éléments cellulaires seront sûrement dissociés et rendus méconnaissables. Weber2 a montré que, même avant la fusion, il se produit une dislocation de l'édifice cristallin de la paraffine. Ce phénomène, qui déforme la coupe et modifie les rapports des éléments, nous est révélé par l'aspect transparent que prend le ruban de paraffine.

4° Il n'y a pa? asse: de liquide, alors les coupes ne peuvent s'étaler librement, elles se plissent et se dessèchent sur les bords. Quand on s'aperçoit à temps de ce défaut, il est facile d'y remédier.

5° Le ruban se courbe. Quehjuefois, en effet, la courbure du ruban ne se manifeste qu'à l'étalement. Évidemment cet accident n'est pas grave en soi et ne compromet pas la qualité des coupes. Il faut pourtant

1. Cette opération est d'autant plus facile que les murs latéraux du bloc (p. 333) sont moins épais.

•2. Weber, Notes critiques sur l'étalement et les déformations des coupes à la paraffine. C. B. Assoc. des anatomistes, 3" session, p. 72-77, 1901.

TRAITEMENT ET COLLAGE DES COUPES 34;j

s'efforcer de l'éviter ^ et y porter remède, car des préparations qu'on laisse en cet état dénotent, chez l'opérateur, un manque de soin reg-rettable, qui peut se manifester par des négligences plus graves. Sans attacher aux détails d'esthétique une im|iorlance qu'ils n'ont pas, je prétends que ces petits défauts des préparations sont d'un fâcheux augure, car un travailleur qui ne sait pas s'astreindre à les éviter, manquera à peu prés sûrement une préparation difficile. C'est en s'habituant à travailler proprement et minutieusement qu'on arrive à exécuter des techniques délicates et à voir ce que les autres n'ont pas encore vu. II faut donc remédier à la courbure du ruban et aligner correctement les coupes. Pour cela, après étalement, on coupe, avec un bon scapel, de petits triangles de paraffine, entre chaque coupe, de manière à rétablir la rectitude de l'alignement.

Liquides pour rétalement et le collage des coupes. — Gomme nous l'avons dit plus haut, dans le procédé que nous recommandons, rétalement et le collage des coupes sur lames ne sont que deux temps d'une même opération. Il nous reste donc à étudier les liquides employés dans ce but.

Les méthodes à recommander sont celles de l'eau distillée, de Teau albumineuse et de la gélatine. Nous étudierons ensuite les procédés de collage sans étalement préalable.

1. Eau distillée. — Cette méthode repose sur la propriété que possède le verre parfaitement propre de retenir fortement, par adhésion moléculaire, les coupes qui sont mises en contact intime avec lui.

Deux conditions sont nécessaires pour réussir cette méthode : des lames rigoureusement propres et des coupes parfaitement étalées.

Pour avoir des lames propres, P. Masson conseille (p. 237) de les traiter par un mélange à parties égales d'alcool à 90 et d'acide chlorhydrique, ou lave ensuite à plusieurs eaux et on se sert de ces lames sans les essuyer.

La méthode à l'eau distillée est la plus élégante, puisqu'elle ne laisse, entre la lame et les coupes, aucune trace de colle. Mais elle ne donne pas une sécurité absolue et ne convient tout à fait que pour les coupes d'organes parenchymateux, sans cavités ni portions chitineuses ou sclérosées.

2. Eau albumineuse. — C'est la méthode de choix pour les matériaux fixés dans des liquides non chromés. On prépare l'eau albumineuse au moyen de l'albumine de Mayerqui se trouve

1. En outre, on gagne de la place et du temps avec des coupes bien alignées et on peut en mettre un plus grand nombre sur une lame.

dans le commerce ((Triibler). On peut, la faire soi-même en mélangeant poids égaux de blanc d'œuf et de glycérine et filtrant le mélange. Il faut avoir soin de couper le blanc d'œuf en tous sens avec des ciseaux et de bien le battre avec la glycérine. On ajoute 1 gramme de salicylate de sodium dissous dans un peu d'eau. La fiUralion est extrêmement lente; il faut couvrir Tentonnoir pour le préserver de la poussière. On peut encore liltrer à part le blanc d'œuf préalablement coupé ou battu et le mélanger ensuite avec la glycérine.

A 50 centimètres cubes d'eau distillée^ on ajoute XV gouttes de solution albumineuse et on se sert de ce liquide pour étaler et coller. On peut encore, plus simplement, dissoudre extemporanément un peu d'albumine sècbe dans de Teau distillée et filtrer. 3. Gélatine. Méthode de P. Masson. — Ce procédé convient à la fois pour les pièces chromées ou yion chromées. Faire dissoudre dans un tube à essai d'eau distillée 1 centimètre carré de gélatine blancbe. Se servir de ce liquide pour étaler les coupes. Sécber comme d'habitude. Éliminer la paraffine par le toluène, laver à l'alcool, puis, pour tanner la gélatine., passer dans un mélange de formol (1 partie) et d'alcool (4 parties). Laver à l'eau et colorer. Ce procédé est bien plus rationnel que ceux qui consistent à mélanger à la gélatine liquide la substance insolubilisante.

Séchage des coupes. — Quel que soit le liquide employé, il faut, dès que les coupes sont étalées, faire écouler avec précaution l'excès de ce liquide et placer les lames sur un égoutloir, de préférence à l'étuve à 37°. Pour se débarrasser du liquide, sans déranger les coupes, on maintient celles-ci avec la pointe d'une aiguille, pendant qu"on incline doucement la lame. Quand on emploie le procédé de l'égoultoir, il est inutile d'essuyer la lame. Dès qu'on est assuré que les coupes ne se dérangeront plus, on les dispose une dernière fois avec l'aiguille et on pose la lame sur un égoutloir à plaques photographiques. L'excès d'eau s'écoule très bien et l'adhérence devient parfaite.

Les coupes doivent être parfaitement desséchées avant d'être débarrassées de la paraffine. 11 faut donc les sécher à la température ordinaire au moins pendant douze heures ou à l'étuve à 37** au moins iiendanl trois ou quatre heures. Pour cela on les laisse sur l'égouttoir ou dans une boîte en bois à rainures.

P. Masson étale à la température de 46°, égoutte le liquide, essore les coupes avec du papier mousseline, sèche à l'étuve à

42-45° en 15 minutes. Il obtient ainsi des coupes transparentes et très adliérentes.

Élimination de la paraffine. — Il est bien évident que les coupes ne peuvent être colorc'cs correctement*, si elles ne sont pas débarrassées de la couche de parafllne qui les imprègne. Même si le matériel a été coloré en masse avant les coupes, il faut encore enlever la paraffine avant de monter au baume.

On commence par chauffer modérément la lame, de manière à faire fondre la paraffine. Cette fusion n'est d'ailleurs indispensable qu'avec le procédé à Talbumine, car il a alors pour but de coaguler la mince couche de colle et de rendre l'adhésion définitive plus parfaite.

En opérant ce chauffage, il faut prendre l)ien soin de ne pas dépasser trop le point de fusion de la paraffine, sous peine de détériorer gravement les coupes. Je signale cet écueil parce que j'ai vu souvent les débutants y échouer. Il est commode d'opérer en posant la lame sur une portion convenablement choisie de l'étagère de Malassez (fig. 147); on surveille mieux la fusion qu'avec la flamme du bec Bunsen et on obtient un chauffage plus égal.

Dès que la paraffine a fondu, on n'a plus qu'à plonger la lame dans un cylindre Borrel plein de toluène. Il est indifférent que la paraffine se soit solidifiée de nouveau après fusion.

Lorsqu'on ne traite qu'une lame à la fois, on peut se contenter de verser à sa surface du toluène pour dissoudre la paraffine, puis de Talcool à 90° pour chasser le toluène et enfin de plonger la lame dans l'eau. Les flacons compte-gouttes, analogues à celui que représente la fig. 160, sont très commodes pour ces opérations..

Mais si on colore de nombreuses lames, il y a intérêt à installer une batterie de cyhndres Borrel, de manière à déparaffiner rapidement les coupes. Je me sers d'un bloc de bois (fig. 167) ou d'une étagère en fil de fer (fig. 168) Fig. i66. — Flacon contenant cinq cylindres Borrel"-. Les deux pre- compte-gouttes

i - ' . pour toluène ei

miers sont remplis de toluène et servent à dis- aicooi.

soudre la paraffine, les trois autres sont pleins

d'alcool à 90° et destinés à éliminer le toluène paraffiné. En sor-

1. Nous verrons page 415 une exception à cette règle (procédé de Scliillingi. •2. On peut prendre aussi des tubes JoUy i Gg. 1701 qui exigent une moindre quantité do liquide.

tant du troisième alcool, les coupes peuvent être plongées dans

Fi;?. 167. — Batterie de cylindres Borrel dans un bloc de bois.

Fig. 168. — Batterie de cylindres Borrel dans nue étagère en fil de fer.

de Feau contenue dans une boîte à rainures (fig. 169} en verre ou

en porcelaine.

On croit généralement qu^il faut laver les coupes à l'alcool absolu en les sortant du toluène. C'est une erreur. Je me sers toujours d'alcool à 90° et ce liquide ne se trouble

Fig. 169. — Cuve à rainures en . , '■

verre où en porcelaine. jamais.

Je recommande tout particulièrement l'emploi des batteries de tubes, parce que ce procédé est très économique i. On peut passer dans le même liquide une très grande quantité de coupes. Il faut changer le

toluène dès qu'on voit des cristaux de paraffine se former au-dessus du liquide sur la paroi du tube. On jette alors le contenu du premier tube; le second tube devient le premier et peut servir longtemps encore. 11 faut changer l'alcool dès que les coupes, au sortir de cet alcool, donnent à l'eau une teinte laiteuse. On rejette alors les deux premiers tubes et on fait passer le troisième à la place du premier. Dès ({ue les coupes sont bien hydratées, il faut les colorer, car il est très mauvais de les garder longtemps dans l'eau. Pourtant, lors([ue les pièces ont été fixées au Bouin, il est nécessaire que tout l'acide picrique soit éliminé avant la coloration. Pendant le collage des coupes, une grande quantité de ce corps s'est déjà dissoute dans l'eau tiède qui a servi à l'étalement et, si les cou|)es sont minces, elles sont à peu j>rès décolorées. Avec des coupes plus épaisses, il faut prolonger le séjour dans les alcools, au besoin à l'étuve, jusqu'à disparition complète de toute coloration jaune.

Un bon moyen d'activer V élimination de l'acide picrique est d'employer le procédé de Jellinek, déjà mentionné p. 271, note 1. On ajoute à l'alcool quelques gouttes de solution aqueuse saturée de carbonate de lithium;

1. En mettant dans chaque cylindre un prisme de Borrel (fig. "245, p. 630) on diminue la quantité de liquide et on peut traiter trois lames à la fois ou même six en les plaçant dos à dos.

Fig. 170. — Batterie de tubes Jolly dans une étagère en fil de fer.

l'alcool se trouble. On y plonge les coupes : on voit alors le trouble disparaître et l'alcool jaunir. On ajoute peu à peu la solution de carbonate de lithium, jusqu'à ce que le précipité ne se dissolve plus. A ce moment les coupes sont décolorées et il ne reste plus qu'à les laver dans un dernier alcool.

Conservation des coupes collées. — Les coupes, collées par un des procédés que nous venons d'indiquer et bien séchées, peuveul être conservées indéliuiment, pourvn qu'elles soient à Tabri de la poussière. On peut constituer ainsi des réserves précieuses, destinées soit à des travaux futurs, soit à renseignement. A mon avis, le meilleur procédé pour conserver les coupes collées est de les garder dans des boites à rainures fermant bien. Mais il ne faut pas oublier de bien étiqueter les coupes, car, au bout de (juelques mois ou de quelques années, on peut ne plus les reconnaître et alors on n'a plus qu'un matériel inutilisable. L'encre de Chine silicat.'e (p. 455), bien sèche, résiste à tous les liquides. Les traits des crayons gras pour le verre s'effacent sous le doigt et dans le toluène. On peut aussi graver un numéro d'ordre, soit avec un petit diamant à écrire sur le verre, soit môme avec un fragment de silex. Voir p. 455 le moyen d'écrire sur le verre avec une pointe d'aluminium.

Procédés rapides de collage. — Ces procédés, qui suppriment l'étalement des coupes, ne peuvent être employés qu'avec des coupes non plissées, ni com])rimées. Or il est bien rare, à moins de coupes très épaisses, que la parafline ne soit pas un peu tass'e et que les coupes aient exactement la même surface que le bloc. L"em}»loi des procédés rapides est donc déjà très limité par cette condition. De plus, i! ne permet pas la conservation des coupes collées et non colorées.

Albumine de Mayer. — On étend sur la lame, avec un pinceau, une très mince couche d'albumine glycérinée, suivant la formule donnée plus haut. Appliquer les coupes sur la lame ainsi enduite, appuyer légèrement avec un pinceau sec. Passer à la flamme pour coaguler l'albumine et fondre la paraffine. Déparaffiner et colorer.

Ce procédé est excellent et donne une adhésion parfaite. Malheureusement, il ne convient que pour des coupes sans plis. Henneguy combine ce procédé avec celui de l'eau. Il verse de l'eau distillée sur la lame enduite d'albumine et étale comme il a été dit plus haut (p. 343).

Collodion de Schœllibauia. — On le prépare en mélangeant une partie (le coUodion avec 3 ou 4 parties d'essence de girofle. On étale en couche très mince sur la lame avec un petit [)inceau. et on appliciue les coupes en les étalant avec un pinceau sec. On peut sécher pendant dix minutes à Tétuve à 37'' ou même faire fondre de suite la paraffine et déparaffiner, de i)référence par l'éther de pétrole (Field et Martin) qui ne dissout pas le coUodion comme le toluène.

Ce procédé est heaucoup moins sur que le précédent. 11 n'est à recommander que pour ohtenir très rapidement une préparation ou pour certaines manipulations d'élèves avec des coupes épaisses et non plissées.

Insuccès. — Le seul insuccès qui puisse se produire, dans le traileuKMit des coupes avant coloration, est le décollement. Cet accident peut être dû à diverses causes : lames mal nettoyées, coupes mal séchées, tissus très scléreux, etc. 11 n"v a (|u'un remède, applicable seulement aux coupes épaisses, c'est de recueillir la coupe qui se décolle, de la colorer sur lame ou dans un verre de montre et de lui faire subir sur ce support toute la série des opérations. Généralement il est préférable d'abandonner la préparation et d'en faire d'autres. Il faut savoir (lue certains tissus très sclérosés sont rebelles au collage.

Collodionnage des coupes. — Ce procédé, conseillé par Regaud ', peut remédier, dans une certaine mesure, au décollement des couiies à la paraffine. Il ne s'applique qu'aux coupes déjà déparafflnées par le toluène. On prépare la solution suivante :

CoUodion ordinaire non riciné 20

Éther 40

Alcool absolu 40

Au sortir de l'alcool à 90' on y plonge les coupes pendant une à deux minutes, on égoutte avec soin et, sans sécher, on plonge dans l'alcool à 70°. Le coUodion est immédiatement précipité sous forme de pellicule transparente qui préserve les coupes de tout décollement, et ne gène en rien la coloration. On lave ensuite à l'eau et on colore.