Loco citnto, voir p. 390, note

3. Centralbl. /'. innere Medizin, XXIII, n« 11, p. 265-268, 1902.

Ce mélange })eiil être employé aussi bien pour les coupes que pour les frottis. Il colore en bleu les éléments basophiles et en rouge les éléments acido})liiles : ces derniers sont généralement très mal mis en évidence par le Romanovsky. Aussi Pappenlieim a-t-il, avec raison, préconisé l'emploi successif du May-Grïmwald et du Romanovsky-Giemsa pour colorer tous les élémenls, y compris les acidophiles. Nous étudierons donc l'emploi du mélange de May-Griinwald en même temps que la méthode panoi>tique de Pappenheim (p. 406).

Il faut bien savoir que le May-Grùnwald ne colore pas les noyaux des Protozoaires et ne peut convenir seul pour Tétude des parasites du sang.

Il en est de même du mélange à Véosinate de bleu de toluidine de Pappenheim (19ti). On peut le préparer soi-même en mélangeant deux solutions aqueuses à 0,1 p. 100 de bleu de toluidine et d'éosine, recueillant le précipité sur un filtre, le desséchant et le dissolvant à 0,5 p. 100 dans l'alcool méthylique. Il est préférable d'acheter le mélange préparé par Grûbler. Il présente, sur celui de May-Grunvvald, l'avantage de colorer métachromatiquement les granulations des labrocytes.

Méthode de Romanovsky.

Nous savons que cette méthode repose sur Temploi d'un mélange à proportions variables d'éosinate d'azur de méthylène, d'éosinate de violet de méthylène et de bleu de méthylène.

Nous avons expliqué (p. 387 et 408) le mode d'action de ces colorants neutres. Nous savons aussi que cette méthode est la seule qui puisse donner une coloration métachromatique spécifique du noyau des Protozoaires.

Nous avons vu que l'éosinale d'azur peut donner cette réaction, mais que la présence du bleu de méthylène est nécessaire pour obtenir une coloration tout à fait parfaite de la chromatinc, sans qu'on puisse expliquer pourquoi.

Nous savons aussi que ce mélange ne produit que la métachromasie neutrophile. Pour obtenir la métachromasie basophile, il faut y adjoindre de l'éosinate de violet de méthylène.

Donc, pour obtenir du mélange de Romanovsky le maximum d'effet utile, il doit renfermer, en proportions convenables, les éosinates d'azur et de violet de méthylène et du bleu de méthylène.

Les innombrables formules qui ont été proposées pour réaliser ce mélange n'ont plus, à mon avis, qu'un intérêt historique. On semble

avoir complètement abandonné, et avec raison, les procédés à Veau, qui consistent à mélanger extemporanément des solutions aqueuses d'éosine et de bleu chargé d'azur et de violet de méthylène (procédés de Nocht, de Laveran, etc.).

Les procédés à Valcool méthylique jouissent de la faveur parce qu'ils donnent des résultats beaucoup plus sîirs et plus rapides. Ils reposent sur l'isolement du colorant neutre et sur sa dissolution dans l'alcool méthylique (principe de la méthode de Jenner, 5" mode d'emploi des colorants neutres, p. 402). Mais, sous cette forme, le colorant neutre ne peut agir; il faut le mettre en liberté par addition d'eau. Celle-ci doit être ménagée de telle sorte que la matière colorante reste encore un certain temps à l'état de dissolution et puisse exercer son action. En effet, dès que la précipitation du colorant neutre est complète, le colorant n'agit plus, ni à froid, ni à chaud; il est inutile de prolonger le contact avec l'objet à colorer, car il ne reste plus en solution que l'excès de colorant basique qui sert à retarder la précipitation.

On est donc pris entre deux alternatives : en solution alcoolique, le corps neutre ne colore pas; par addition d'eau, il précipite et ne colore plus. Pour réussir, il faut donc saisir le stade intermédiaire, dans lequel le colorant neutre est encore dissous dans l'alcool méthylique très dilué. Ceci nous rend compte des précautions à observer pour bien réussir une coloration, surtout avec le mélange de Giemsa.

Les solutions les plus employées actuellement, pour obtenir la coloration de Romanovsky, sont celles de Giemsa et de Leishman. Pour le travail normal de coloration des fr^Dttis, je conseille vivement l'emploi de la méthode panoptique de Pappenheim et surtout du mélange panchrome de Pappenheim qui réunissent les avantages des méthodes de May-Griinwald et de Romanovsky, et donnent une coloration très délicate et très nuancée. Pour le diagnostic rapide, la méthode rapide de Giemsa donne des résultats excellents, supérieurs à ceux que fournit le procédé de Leishman. Comme ces procédés sont destinés à la coloration des frottis desséchés, je donnerai ensuite les méthodes particulières applicables aux frottis humides et aux coupes.

Procédés applicables aux frottis desséchés.

I. Méthode panoptique de Pappenheim '. — Ce procédé est basé sur lemploi successif du mélange de May-Grûnwald et do celui de Giemsa. Le premier colore surtout les éléments acidophiles et les granulations neutrophiles des leucocytes, tandis que le second colore les noyaux et les parties azurophiles. Séparé-

I. Pappenheim, Panoptische Universalfârbung fiir Blutpraparate. Afedizinische Klinik, IV. 2, p. 1244, 1908.

ment, chacune de ces deux méthodes donne une coloration incomplète, car le May-Griinwald colore mal les noyaux el pas du tout les corps azurophiles, tandis que le Giemsa met insuffisamment en évidence les parties acidophiles et les granulations neutrophiles.

1° Fixation. — Verser sur le frottis 10 gouttes^ de liquide de May-Griinwald. Couvrir avec une hoîle de verre hien sèche. Laisser

agir 3 minutes. // est essejiiiel que le

liquide ne sèche pas ".

Un grand avantage des mélliodes à Talcool est de dispenser de la fixation par l'alcool absolu Fig. 171. — Boîte de ^^^j^ rivec les méthodes à Peau, devait durer Pétri, pour colorations ^j^. minutes. Ici, comme dans le Leishman ou au Romanovsky, da- j^ Qiemsa rapide, la fixation est produite très près Pappenncim. . ,1.1 1 -.u i- • •- j

^ ^' rapidement par 1 alcool methylique qui. sert de

dissolvant au colorant. C'est un grand avantage pour les colonies, où il est souvent très difficile de trouver et de conserver de l'alcool absolu.

2" Coloration. — En deux temps.

Premier temps. — Découvrir le frottis, verser à sa surface 10 gouttes d'eau distillée ^ Bien mélanger avec le May-Griinwald,

en inclinant la lame en tous sens. Laisser agir une minute au moins.

£ COOlT é C"

Ce temps a pour but de

colorer tous les éléments

acidophiles en rose vif et

les granulations neutro-

philes. Pour eiïectuer la

coloration, on se sert avec

avantage du support en

verre avec cuvette représenté par la figure 172. On opère ainsi très

proprement, sans tacher la table et on peut même laver à la pisselte

sur la cuvette.

Fig. 17'3. — Cuvette et support pour colorations au Romanovsky. d'après Giemsa et Pappcnlieim.

Deuxième temps. — Rejeter le colorant précédent et, sa?2s

1. Ou 12, 15 gouttes, si c'est nécessaire pour bien couvrir la lame.

■2. Si cet accident arrivait, il faudrait, pour y remédier, laver le frottis à l'alcool methylique, de façon à dissoudre le précipité adhérent. On verserait ensuite de nouveau 10 gouttes de mélange colorant et on passerait immédiatement au premier temps de la coloration.

3. Employer toujours un noml)re de gouttes d'eau distillée égal au nombre des gouttes de May-Grûnwald qui ont servi pour la lixation.

laver, verser sur le frottis du Giemsa dilué ^ dans la proportion de 3 gouttes pour 2 cm"^ d'eau distillée. Laisser agir de 5 minutes à 30 minutes ou une heure, suivant la nature et l'ancienneté du frottis : un frottis frais demande en général 10 à 15 minutes de coloration.

3° Lavage. — On peut laver à l'eau distillée, à la pissette, ou plus simplement sous le robinet, sous un jet d'eau assez fort. Le lavage doit donc être violent, pour entraîner les précipités, et rapide, pour ne pas nuire à la coloration. Quelques secondes suffisent.

Si la coloration était trop bleue ou trop intense-, on pourrait la différencier- en prolongeant un peu le lavage, de préférence alors dans l'eau distillée.

A° Séchage. — Dès que le lavage est terminé, se hâter de sécher le frottis par compression, dans un cahier de papier Joseph.

Il ne faut pas craindre d'appuyer, comme lorsqu'on sèche au buvard une ])age d'écriture. Mais il faut éviter que le buvard glisse sur le frottis, car la mince couche de sang serait éraillée. Il ne faut jamais chauffer un frottis pour en achever la dessiccation, mais le passer à deux ou trois reprises dans le buvard. Se méfier du transport possible de parasites d'une lame à l'autre par l'intermédiaire du buvard.

5° Examiner avec l'objectif à immersion dans une goutte d'huile de cèdre, sans lamelle; après examen, enlever l'huile de cèdre en plongeant la lame dans un tube Borrel plein de xylol ou de toluène, sécher au buvard, et conserver à sec sans lamelle, et bien à l'abri de la poussière, dans des boîtes à rainures. En effet ces colorations ne peuvent supporter ni les milieux réducteurs, ni les milieux acides; le mieux est de les conserver à sec au contact de l'air (p. 465).

Pour examiner avec les objectifs faibles à sec (recherche des Pilaires, etc.), on étend avec le doigt une mince couche d'huile de cèdre sur le frottis, pour le rendre transparent. Il ne faut jeûnais examiner un frottis non imbibé d'huile de cèdre, car on ne distingue aucun détail. Pour les objectifs forts à sec, mettre une grosse

1. Voir p. 408 les précautions à prendre pour cotte dilution.

2. On peut différencier aussi par le tannin-orange de Unna. étendu de son volume d'eau, mais ce procédé, excellent autrefois après la coloration au bleu Borrel-éosine, nuit à la finesse des tons que fournit la méthode panoptique.

goulte d'iiiiile de cèdre et une lamelle, alin de ne pas risquer de faire immersion avec les objeclifs à courle dislance focale. Après examen, plonger la lame dans le loluène : la lamelle se détache d'elle-même.

Précautions à prendre pour préparer le Giemsa dilué.

La solution de Giemsa poui^^la coloration de Romanovsky (Giemsa's Lôsung fur Romano\vskyfârbung- de Griibier) est ainsi constituée :

Azur II éosine 3 gr.

Azur II 0,8 —

Glycérine de Merck . 125 —

Alcool méthylique de Kahlbaum 375 —

Bien entendu, il ne faut pas la préparer soi-même, mais Tacheter toute faite. Nous avons exposé (p. 389) la nature de l'azur II; Tazur II — éosine est réosinate d'azur, qui agit comme colorant neutre et qui est doué de la métachromasie neutrophilo spéciliciue pour les corps azuropliiles (p. 403). Nous savons aussi (p. 390) que, dans les flacons un peu anciens de solution de Giemsa, il y a toujours un peu de violet de méthylène. Naturellement le liquide renferme aussi de l'éosinate de bleu de méthylène et un excès de colorants basiques (bleu de mélhylène et azur de méthylène), calculé de manièie à retarder la précipitation de l'éosinate d'azur, au moment de la dilution, sans toutefois influencer la coloration.

La g-lycérine a pour but de donner des solutions plus concentrées en matière colorante que l'alcool méthylique seul ne pourrait le supporter et d'obvier à l'extrême volatilité de cet alcool (qui bout à 67°). Primitivement ' la teneur' en glycérine était de 50 p. 100, mais, depuis 1907-, elle a été abaissée à 25 p. 100, sans que la puissance colorante et la faculté de conservation du liquide aient été intluencées.

En opérant la dilution, il faut éviter tout ce qui peut favoriser la précipitation de l'éosinate d'azur.

1° L'eau distillée ne doit pas être acide : il est même préférable qu'elle soit légèrement alcaline. Les moindres traces d'un acide organi(|ue ou minéral et même l'anhydride carbonique nuisent à la coloration. Cette sensibihté est telle que le papier de tournesol est impuissant à déceler les traces d'acide suffisantes pour altérer les composants basiques du colorant. 11 faut employer, comme réactif indicateur '^ la solution alcoolique d'hématoxy-

1. Giemsa, Eine Vereinfachung und Vervollkommung meincr Methylenazur- Methylenblau-Eosin Farbemethode. Centralbl. f. Bakt, Orig., XXXVII, p. 308, 1904

2. Giemsa, Beitrag zur Farbung der Spirochate pallida in Ausstrichpraparaten Deutsche med. ^yocll., n" 17, 1907.

3. Ces détails sont empruntés à Giemsa. Deutsche med. Woch., n" 12, 1910.

Une. Dissoudre dans de l'alcool à 95 quelques cristaux d"hénialoxyline, ou prendre la soluliou à 1 p. 100 qui sert pour la méthode à la laque ferrique (p. 377). Prendre 10 cnr^ de Feau à essayer, y ajouter 2 gouttes de la solution dliématoxyline et agiter. Si, au bout de cinq minutes, Teau est restée incolore ou jaunâtre, ajouter à la provision d'eau distillée et goutte à goutte, une solution à 1 p. 100 de carbonate de sodium ou de potassium, jusqu'à ce que celte eau, éprouvée par Thématoxyline, prenne, au bout de cinq minutes (et non d'une seule minute), une coloration violacée, faible mais nette.

A la rigueur, on peut se servir d'eau de pluie ou de neige fondue, après ébullition et fillration. Dans les eaux de source, les sels de magnésium sont les plus nuisibles.

Pour la mise en évidence des granulations de Maurer, dans les hématies parasitées par le Plasmodium falciparum, il faut une eau franchement alcaline : on la prépare en ajoutant une nouvelle goutte de carbonate de potassium à 1 p. 100 pour 20 cm^ d'eau distillée.

2° Le mélange ne doit pas être concentré. — La dilution 7iormale esi de 1 goutte de Giemsa pur pour 1 cm^ d'eau distillée. On peut, pour la méthode panoptiqiie de Pappcnheim, porter la dose à 3 gouttes pour 2 cm% mais c'est l'extrême limite qu'il ne faut jamais dépasser. On risque non seulement de voir le mélange précipiter rapidemeiît, mais, en outre, la trop grande concentration en glycérine et en alcool méthylique nuit à la coloration. Giemsa insiste beaucoup sur ce po'int, car on est facilement tenté de forcer la dose.

3'' Propreté absolue du matériel (éprouvettes, pipettes, lames et lamelles). — Lorsque du précipité est adhérent aux parois de ce matériel, la dilution est beaucoup moins stable et précipite avant d'avoir coloré. Il faut donc laver soigneusement les vases avec de l'eau distillée ou de l'alcool, en cas de précipité trop adhérent. Rincer à l'eau distillée et éviter toute trace diacide.

¥ Ne pas agiter le mélange. — On est souvent tenté de secouer le liquide pour assurer son homogénéité : c'est une pratique dangereuse, qui amène promptemeut la précipitation du colorant. Il faut donc se servir d'un vase assez large, ayant au moins 3 cent, de diamètre : on mesure l'eau distillée dans une éprouvette spécialement destinée à cette usage et on la verse dans le large tube où on fait le mélange. On a soin d'y introduire d'abord l'eau et de

faire loaiber dans celte dernière les goiiUes de liquide de Giemsa. EflecUier rapidement le mélange en agitant très doucement, par un mouvement tournant. Si on prépare une certaine quantité de mélange, il faut agiter au fur et à mesure qu'on fait tomber les gouttes.

5^ Préparer le mélange immédialement au moment de s'en servir et jamais à Tavance, même pour quelques minutes. Nous avons vu, en effet (p. 405), que le colorant produit son effet maximum au moment où la solution alcoolique est additionnée d'eau. Lorsquun mélange a précipité, il est inutile de prolonger la coloration ou de colorer à chaud. La seule chose qu'il y ait à faire est de jeter le mélange, de bien rincer le frottis à Teau distillée et de le recouvrir d'un autre mélange préparé avec soin.

6*^ Ne jamais introduire dans le mélange aucun instrument métallique.

7° Conservation des colorants neutres. — Le meilleur moyen, pour conserver intactes les solutions alcooliques de colorants neutres (Giemsa, Giemsa rapide, May-Griinwald, panchrome, Leishman, etc.), est de les garder dans des flacons compte-gouttes à tétine, du modèle représenté ligure 173. On a sur la table, dans une étagère (lig. 168) ou un bloc en bois (fig. 167) toute la série des colorants usuels.

On évite ainsi les confusions de compte-gouttes, et Fintroduclion de poussières ou d'impuretés dans les liquides. En outre, les gouttes ont toujours le même volume, puisqu'elles sont toujours comptées avec le même instrument. En voyage, on retire les lubes comptegouttes, on les numérote pour les emballer à part et on les remplace par des bouchons de liège numérotés.

II. Méthode rapide de Giemsa ^ — Elle consiste à fixer par la solution alcoolique du colorant, puis à inonder la préparation avec une quantité déterminée d'eau distillée.

Nous avons vu (p. 4.08) que la solution mère de Giemsa renferme 25 p. 100 de glycérine. Cette quantité, qui est nécessaire pour sa conservation, empêche de l'employer telle qu'elle, comme la solution de Leishman, pour la fixation des frottis. Il faut donc la

Fig. 173.

Fla-

con compte gouttes à tétine.

1. Giemsa, Uebor eine neue Sclincllfarbiing mit meiner Azureosinlôsung. Mûnclimed. W'och., i\^ 47, 1910, et Archiv fiir Schiffs-und Tropenhygiene, XIV, p. 695, 1910.

diluer avec son volume d'alcool niélhylique ou d'acélone. Je donne à celte dilution le nom de Giemsa rapide. Les liquides de dilution doivent être très purs, anhydres et sans trace d'acide. L'acétone ne convient pas pour les pays chauds, à cause de sa trop grande volatilité. 11 ne faut préparer à la fois qu'une petite quantité de dilution, car elle ne se conserve pas comme la solution mère.

l» Fixation. — Mettre le frottis dans une boîte de verre bien sèche (boîte de Pétri (fig. 171) ou boîte carrée, genre de boîte de Laveran). Verser sur le frottis 15 goultes de Giemsa rapide. Couvrir et laisser agir 30 secondes.

2° Coloration. — Verser sur la lame lo cnr^ d'eau distillée, additionnés au besoin de 3 gouttes de carbonate de potassium à 1 p. 1000. Le frottis doit être bien recouvert par le liquide. Remuer doucement pour homogénéiser. Colorer de 3 ào minutes, ou beaucoup plus longtemps si on veut avoir une coloration plus intense.

3° Laver rapidement sous le robinet, sécher au buvard et examiner dans l'huile de cèdre.

D'après Giemsa ce procédé pré.^enle sur celui de Leislimari les avantages suivants :

1° La teneur en azur est plus constante et Texcès de colorant basique est moins grand, d'où coloration plus régulière et plus intense.

2° La présence de la glycérine empêche l'évaporation rapide du mélang-e et la formation de précipités.

3" La solution mère peut servir à volonté pour ce procédé rapide ou pour d'autres colorations *.

III. Mélange panchrome de Pappenheim (Pappenheims Panchromgemisch de Griibler). — Pappenheim a combiné ce mélange de manière à arriver à colorer le plus grand nombre possible d'éléments différents, avec des nuances particulières, correspondant à toutes les réactions cytologiques actuellement connues : basophilie, acidophilie, neutrophilie, métachromasie bas)[)hile et neutrophile.

Ce qui manque surtout aux mélanges genre Giemsa ou Leishman, c'est la faculté de colorer métachromatiquement les chromotropes basophilcs, tels que le protoplasme des Protozoaires et les granulations des labrocytes. Aussi Pappenheim a-t-il voulu composer un mélange du type Giemsa (alcool méthylique-glycérine) renfermant, d'une part le bleu de

1. Par exemple l'ancien procédé lent, dans lequel on fixe 10 minutes par l'alcool absolu et colore 1 à 12 heures dans la dilution normale.

méthylène, l'azur de méthylène et l'éosine et, en outre, le bleu de toluidine et le violet de méthylène. L'avantage du bleu de toluidine est de permettre une coloration plus intense des éléments acidophiles, car l'éosinate de bleu de toluidine est beaucoup plus facile à dissocier que les éosinates de bleu de méthylène et d'azur. L'avantage du violet de méthylène est de colorer métachromatiquement les chromotropes basophiles (granulations des labrocytes).

Voici la teneur du mélange panchrome, mais il est bien préférable de l'acheter tout fait chez Grlibler :

Bleu de méthylène 1 gr.

Bleu de toluidine 0,5 —

Azur 1 1 —

Violet de méthylène 0,75 —

Éosine 250 —

Glycérine 200 —

Acétone 50 —

1° Fixation. — Verser sur le frottis 10 gouttes de mélange de May-Grïmwald (ou d'éosinate de bleu de toluidine de Pappenheini, p. 404). Couvrir et laisser agir trois à cinq minutes.

On peut aussi fixer en cinq minutes, par immersion dans un mélange à parties égales d'alcools métliylique et éthylique absolus.

2° Coloration. — Premier temps. Gomme dans la méthode panoptique (p. 406).

Deuxième temps. Verser sur le frottis un mélange de 15 gouttes de panchrome pour 10 cm^ d'eau distillée. Colorer au moins cinq minutes. Pour les Protozoaires, il est préférable de colorer au moins 20 minutes à l'étuve à 37".

3° Lavage et séchage au buvard, comme pour la méthode panoptique (p. 407).

4" Différenciation. — Après séchage au buvard, il est bon de différencier par le mélange suivant.

Alcool méthylique 75

Acétone 25

Ce procédé est certainement très supérieur à toutes les autres variantes de la méthode de Romanovsky (Giemsa, Leishman, etc.) et même au procédé panoptique de Pappenheini. Notamment, pour les Protozoaires, il donne une différenciation beaucoup plus précise. Il permet de colorer des frottis très anciens et il ne donne jamais de précipité. Actuellement je ne me sers plus que de cette méthode.

lY. Procédé de Leishman'. — Cotte méthode est encore très en usage dans les pays de langue anglaise, mais, à mon avis, elle ne vaut pas les procédés de Pappenheim.

1" Fixation. — Verser sur le frottis 6 gouttes de solution de Leishman -, couvrir avec une boîte de verre bien sèche, laisser agir 30 secondes.

2° Coloration. — Découvrir le frottis et verser sur la lame un nombre de gouttes d'eau distillée double de celui des gouttes de la solution de Leishman, soit 12 gouttes. Mélanger avec soin, en balantjant la lame et laisser agir cinq à dix minutes.

3" Différenciation à l'eau distillée. — Ce temps est très important et doit être contrôlé au microscope. 11 a pour but de dissoudre le précipité, de préciser la coloration rouge des noyaux des Protozoaires et de donner aux hématies une teinte rosée.

4° Sécher au buvard et examiner dans l'huile de cèdre.

Procédés applicables aux frottis humides.

Voir p. 628 la méthode de préparation et de fixation des frottis humides. La coloration peut être efl'ectuée soit par le procédé de Giemsa, soit par les méthodes de Pappenheim (panoptique et panchrome). Pour ces deux dernières méthodes, procéder comme il est indiqué pour les coupes (p. 416).

Procédé de Giemsa ^ — 1° Fixation. — Dans le subhmé alcoolique de Schaudinn (p. 283), pendant douze à vingt-quatre heures.

Giemsa trouve que le sublimé est très supérieur à l'alcool et au formol qui modifient trop la structure de la chromatine et l'empêchent de prendre la teinte azurophile caractéristique. En outre, le sublimé est facile à éliminer par l'iode. Je crois, néanmoins, qu'on peut très bien fixer au Bouin; dans ce cas, le traitement à l'iode est inutile, il suffit d'éliminer complètement l'acide picrique (p. 271 et 348).

2° Lavage : Premier temps. — Laver rapidement à Teau et plonger cinq à dix minutes dans du Lugol faible * ainsi constitué :

1. Journ. Roy. micr. Soc. London, p. 715, 1901. — Brit. med. jown., II, p. 757,

2. Acheter chez Grûbler la solution toute faite ou le colorant sec qu'on dissout dans l'alcool méthj-Iique pur à la dose de 0,15 p. 100. Les produits Soloïd sont aussi très bons.

3. Giemsa, Ueber die Fârbung von Feuchtpraparaten mit meiner Azur- Eosinmethode. Deutsche med. Wocli., p. 1751, 1909.

4. L'emploi du Lugol est indispensable, car la solubilisation du sublimé par l'iodure de potassium seul aboutit à la production d'un précipité opaque de mercure métallique provenant de la dissociation du proto-iodure de mercure (p. 295, note 1).

Eau distillée 100 cm'^

lodure de potassium 2 gr.

Lugol ordinaire (p. 395) 3 cni-^.

Deuxième temps. . — Immédiatement après le Irailemenl an Liigol. laver rapidement à Fean el i)longer dix miaules dans ^ :

HyposuHite de sodium 0,5 gr.

Eau distillée, t , 100 cm^.

Troisième temps. — Laver cinq minutes à Teau courante.

3° Coloration, pendant une à douze heures ou plus, dans la dilution' normale de Giemsa (p. 409), soit une goutte par centimètre cube d'eau distillée. Après la première demi-heure, rejeter le colorant et le remplacer par une dilution fraîche.

La coloration doit être faite dès que le lavage est terminé, car si on conserve les frottis quelque temps, ils perdent leur colorabilité.

A° Lavage rapide à Feau distillée, au besoin différenciation prolongée.

5° Déshydratation par passages successifs dans les quatre liquides suivants ^ :