V. — CULTURE DES T R Y PA N OSO M ES ET DES LEISHMANIA

La culture des Trypanosomes se fait en ensemençant le sang parasité dans des tubes de milieu de Griffon et de Besançon, ou gélose au sang. Ce milieu, très improprement nommé milieu de Novy-Neal, a été modifié par ces deux derniers auteurs, puis par Ch. NicoUe, qui a beaucoup simplifié sa préparation et Ta rendue tout à fait pratique.

Milieu gélose-sang (formule Ch. NicoUe^). — On prépare le mélange suivant, sans neutraliser ni alcaliniser :

Eau ordinaire 900 gr.

Gélose 14 —

Sel marin 6 —

On répartit dans des tubes à essai, sur 3 à 4 centimètres de hauteur, et on stérilise à l'autoclave. On peut préparer ainsi à l'avance une provision de tubes qu'on peut conserver longtemps, pourvu qu'on les préserve de la dessiccation.

Tout récemment, Manceaux - conseille de faire macérer d'abord la gélose dans de l'eau distillée qu'on renouvelle deux fois, d'abord au bout de cinq à six heures, puis au bout de vingt-({uatrc heures; on parfait alors le poids de 914 ^r., puis on ajoute le sel et on fait fondre. Cette macération et ce lavage favorisent beaucoup les cultures.

1. C. R. Acad. des Sciences, CXLVI, p. 843, 1908. — Anii. Inst. Pasteur, XXII, p. 397, 1909.

2. Manceaux, Sur la technique de culture des Leishmania. Bull. Soc.paih. exot., IV. p. 586-28S. 1911.

M. L.\NGERON. — Précis de Microscopie. 32

En outre, Nicolle et Manccaux ' cultivent Leïahmania tropica sur milieu solide (gélose au sang bien fraîche), après aspiration de Teau de condensation. Ce procédé est commode pour purifier les cultures.

Pour rendre ce milieu propre à la culture desTrypanosomes, il suffit d'ajouter à chaque tube un tiers de son volume de sang de Lapin, prélevé par ponction aseptique du cœui\ suivant le procédé de Gh. Nicolle -.

Ponction du cœur chez le Lapin (méthode de Gh. Nicolle). — On prépare d'avance une ou plusieurs grosses seringues de 20 centimètres cubes, stérilisées avec leurs aiguilles spéciales. Ces aiguilles sont en acier et de gros calibre (longueur 2 cent., diam. 1,5 mm.). On peut se servir de seringues en verre, mais d'après Manceaux, les seringues à armature métallique sont plus commodes, à cause de Tanneau (jui termine la tige du piston et qui permet de modérer à volonté la course de ce dernier. Les seringues en verre sont stérilisées entièrement enfermées dans de gros tubes à essai bouchés au coton. Les seringues à armature métallique ne sont enfoncées dans ces gros tul)es que jus([u'au plateau métallique supérieur; on fait un bon joint de coton ordinaire pour fermer le tube. On peut ainsi manœuvrer le piston pour s'assurer de son fonctionnement et cela autant de fois qu'on le désire puisqu'on n'aspire que de l'air stérile. Au moment d'opérer, on retire du tube seringue et aiguille et on vérifie une dernière fois, en aspirant dans la fiamme d'un bec Bunsen.

Les tubes de gélose salée, fondus à 100°. sont maintenus liquéfiés à 45"-50°. On immobilise alors un Lapin sur l'appareil de contention : on rase la région précordiale et on la stérilise à la teinture d'iode.

Pour ponctionner le ventricule droit, on opère de la façon suivante : l'index gauche est appuyé sur Tangle formé par la septième côte gauche avec Fappendice xyphoïde. On remonte en comptant 4 espaces intercostaux. On arrive ainsi au 3" espace intercostal qu'on pique à 3 mm. du bord sternal, en dirigeant Taiguille de bas en haut et d'avant en arrière, en inclinant légèrement à droite.

On pénètre brusquement, puis on retire légèrement Taiguille de 2 ou 3 mm. La seringue doit être tenue comme une plume à écrire. La pointe de l'aiguille doit être parfaitement intacte, afin de ne pas blesser le myocarde.

Si on incline trop peu à droite, on pi(|ue le ventricule gauche, ce qui ne présente pas d'autre inconvénient que de fournir le sang plus lentement. Si on incline trop à droite, on longe le bord droit du cœur et on

L C. n. Soc. bioL, LXX, p. 712, 1911.

2. C. R. Soc. biol., 4 juillet lOÛu.Yoir aussi Balfour, Note on a method of obtainingr blood aseptically. 4"' fiep. Wellcome Laho. Khartoum. A. Med., p. 107, 1911.

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fait une ponction blanche. 11 faut alors retirer un peu l'aiguille, de manière que la pointe seule soit dans la paroi; on rectifie la position et on pique de nouveau.

Ainsi praliquûe, la ponclion du cœur est sans danger pour l'animal, à condition qu'on ne lui prenne pas trop de .^^ang. Un même animal peut (Hre ponctionné plusieurs fois, avec des intervalles.

On aspire le sang lentement et, lorsque la seringue est remplie, on retire Taiguille brusquement. Bien entendu, si on doit aspirer plusieurs seringues, on laisse l'aiguille en place. Dans les deux cas, on se hàle de répartir le sang dans les tubes renfermant la gélose liquéfiée. Un aide présente les tubes à l'opérateur qui les garnit de sang : un second aide les saisit et les roule entre les doigts, pour effectuer le mélange du sang et de la gélose. On les incline ensuite (fig. 261) et on les laisse ainsi pendant douze heures, de manière a assurer la solidification.

Si la gélose est trop chaude, le sang est cuit et devient noir. Si on a trop agité le mélange, il se forme une mousse persistante. Des tubes bien réussis doivent présenter une gélose rouge sang, bien transparente. A la base de la couche de gelée, il doit y avoir une certaine quantité d'eau de condensation.

J'ai vu Mauceaux opérer seul de la manière suivante. Le Lapin est bien attaché sur un plateau métallique et les tubes de gélose sont liquéfiés au bain-marie et placés à côté du Lapin. On ponctionne le cœur et on remplit la seringue. Pour répartir, on continue à tenir la seringue de la main droite, le pouce passé dans l'anneau. De la main gauche on débouche chaque tube, on le prend, on y verse environ 2 cm-^ de sang, on le rebouche sommairement et on le replace au bain-marie. On doit faire 12 à 13 tubeSj avec une seringue de 20 cm^ de sang. Lorsque la seringue est vidée, on reprend les tubes un par un : on bouche à fond, on flambe l'orifice et le coton, on roule soigneusement entre les doigts pour bien mélanger le sang et la gélose et finalement on incHne.

On place les tubes à fétuve à 37° pendant quelques jours et on élimine ceux qui présentent un développement microbien. Cet accident est très rare lorsqu'on opère avec soin.

Ensemencement. — On ensemence les Trypanosomes dans l'eau de condensatiou; au cas où cette dernière ne serait pas assez abondante, on ajouterait un peu de solution physiologique stérilisée. Ce milieu convient aussi bien aux Trypanosomes des Pois-

bOO

sons qu'à ceux des Maumiifères. Hrunipl a reconnu que les premiers donnent de plus belles cultures dans ces conditions que sur des milieux au sang de Poisson (Raie, Chien de mer).

Pour Texamen, on pn'lève un peu de liquiile avec une pipette stérile ou encore, dans certains cas, on enlève les petites colonies formées par les Flagellés. On examine en goutte pendante ou en frottis colorés. Les meilleurs frottis sont obtenus, d'après Nicolle, en centrifugeant le liquide additionné d'un peu de solution physiologique ; on aspire le liquide clair, on lave avec un peu de solution physiologique et on centrifuge de nouveau. On rejette alors le liquide et on étale le culot.

Pour préserver les tubes de la dessiccation, on les capuchonne avec des capuchons stériles ou mieux, d'après Manceaux, on recouvre chaque tube d'un autre tube stérilisé bouché à Fouate (fif . 185).

Milieu au sang chauffé. — Mathis * est arrivé à cultiver certains ïrypanosomes, ainsi que les Leishmania sur un milieu préparé en ajoutant simplement, à un volume de gélose nutritive (ou mieux de gélose salée de Nicolle), un ou deux volumes de sang défibriné de Bœuf ou de Cheval (ou d'un autre animal).

Le mélange est effectué avec la gélose refroidie aux

environs de 50°, après avoir été fondue à 100°. On

roule soigneusement les tubes, puis on les incline.

, Après soliditication, stériliser, soit par plusieurs chauf-

Mauceaux fagcs à 75-80° OU 100'\ pendant une heure; soit à

pour con- l'autoclavc à 120°, pendant quinze minutes. Les subserver les ^ ^

tubes de slauccs toxiqucs pour les Trypanosomes se trouvent milieu Ni- détruites en même temps. Si l'eau de condensation est

colle . — . '

Original, insuffisaute, ajoutcr qiielques gouttes d'eau physiologique stérile, avec une pipette stérile.

Milieu liquide hémoglobinisé. — Row - remarque que l'hémoglobine est l'élément nécessaire pour la culture des Leishmama et organismes voisins; il est bon que l'hémoglobine soit dissoute dans un milieu fluide et ne soit pas contenue dans les hématies.

Fig. 185. — P r 0 e é dé du double

1. C. R. Soc. de bioloi/ie, LXI, p. 550, 1906 et LXXI. p. 538, 1911.

2. R. Row, A simple haz-moglobinized saline culture médium, for the growth of Leishmania and allied Protozoa. Brit. med. journ., I, p. 1119, 1912.

FLAGELLÉS aOl

Il propose donc d'employer, comme milieu de culture, de l'eau salée addilionnée de sang hémolyse. Voici comment il opère :