C. B. Soc. de biologie, avril

2. Maupas faisait ses cultures en chambre humide entre lame et lamelle. Les lamelles étaient soutenues par des poils de brosses à dents. Il isolait ses Infusoires à la pipette, par dilutions successives sur des lames. Ses travaux sont à lire par ceux qui veulent se livrer à l'étude des Infusoires. Arc/i. de zool. expcr., VI, 1888 et vil. 1889.

complétés par renlèvement des débris végétaux putréfiés. On les remplace par des feuilles fraîches ou des Algues.

2. Agitation mécanique. Suffit souvent pour répartir les produits de déchet accumulés vers la surface et les rendre inoffensifs; de même les matériaux nutritifs se trouvent mieux distribués. Enlever la croûte d'Algues qui se forme quelquefois à la surface.

3. Neutralisation . Avec une solution très faible (1 p. 100) de carbonate de sodium.

4. Addition à' wxiQ très petite quantité de phosphate de calcium en poudre.

Tsujitani i prépare une gélose à la décoction de paille :

Gélose 5 g.

Bouillon 50 cm3.

Décoction de paille à 20 p. 1 000 1 000 cm^

qu'il laisse solidifier en tubes inclinés. On creuse à la surface, avec le fil de plaline, des stries irrégulières et on ensemence les Infusoires dans l'eau de condensation. Les Infusoires montent le long des stries, tandis que les Amibes, auxquelles ils peuvent être mélangés, restent au fond du tube. On nourrit les Infusoires avec des Bactéries.

Les Infusoires parasites sont très difficiles à conserver en cultures. Metcalf est arrivé à faire vivre quelques jours les Opalines des Bombinaior, dans de grands verres de montre remplis de liquides appropriés. Elles vivent deux jours dans la solution physiologique à 6 p. 1 000, trois à neuf jours dans le même liquide additionné d'une partie du rectum et du contenu rectal de l'hôte. Opaiina ohtvigona {d'Hyla arborca) est l'espèce la plus résistante et 0. caudata la plus délicate. Metcalf conseille encore l'emploi du liquide de Locke :

Chlorure de calcium anhydre 0,07 gr.

Chlorure de potassium 0,01 —

Chlorure de sodium 0,06 —

Bicarbonate de sodium 0,01 à 0,03 —

Eau 100 cm3

Putter a proposé le liquide suivant, qui, lorsqu'il est absolument privé d'oxygène libre, permettrait de conserver les Opalines pendant trois semaines :

Chlorure de sodium ' 100 gr.

Tartrate de sodium et de potassium 5 —

Eau distillée 400 cm^

Les cultures en goutte pendante conviennent mieux pour l'étude des petites formes de l'intestin des Têtards. On ouvre cet intestin sous le

1. Tsujitani, Ueber cinc Méthode, die Infusorien zu cultivieren. Mittli. mcd. Gesell. Tokio,X\ni, ly04.

binoculaire (à 50 diam.) dans une g-outte de solution physiologique ou de liquide dé Locke, on sépare les Opalines et on recouvre d'une lamelle qu'on lute ù la vaseline. Ce lut est préférable à tous les autres, d'après Metcalf, à cause de sa souplesse. De telles cultures peuvent vivre un ou deux jours. Chez certains individus, on peut voir, avec une netteté étonnante, les chromosomes, les fibrilles du fuseau et les granules achromatiques, mais il faut quelquefois chercher longtemps avant de trouver un individu favorable à cet examen.

Fixation. — Il ne peut être question, pour les Infusoires, d'exécuter des frottis desséchés. La fixation doit donc se faire soit entre lame et lamelle, soit par la méthode des frottis humides, soit enfin en masse, par centrifugation.

De très nombreux lixateurs ont été proposés pour ce groupe, comme pour tous les autres. Notons d'abord que l'acide osmique en solution ou en vapeurs est souvent très infidèle. La plupart des auteurs recommandent l'emploi du sublimé, principalement sous la forme du sublimé alcoolique de Schaudinn, mais, d'après Brumpt et d'après notre expérience personnelle, le Bouin ou le Duboscq-Brasil donnent d'aussi bons résultats. Les formes très contractiles (Yorticelles) pourront être fixées par la méthode de ranesthésie sous lai/ielle, due à Certes et de Beauchamp ^ Les animaux sont placés dans une goutte d'eau, entre lame et lamelle; la préparation est mise sur deux cales, dans une boite de verre renfermant un peu d'alcool ou tout autre anesthésique volatil. Surveiller et, dès que les mouvements ont cessé, faire pénétrer un fixateur sous la lamelle.

Il est certain que le formol seul, en solution à 5 ou 10 p. 100, donne des résultats merveilleux. Les Infusoires s'y conservent aussi beaux qu'à l'état frais : en usant d'un éclairage convenablement réglé, on peut les étudier sans coloration aussi bien qu'à l'état vivant. Ce procédé est précieux, car il permet de conserver in toto^ simplement par addition d'eau formolée, le contenu intestinal d'un animal parasité ou le produit d'une culture. Nous avons vu des contenus rectaux d'Éléphant et d'autres Mammifères, rapportés ainsi par Brumpt de sa traversée de l'Afrique et montrant, après plusieurs années, de splendides Infusoires parasites. Le procédé est d'une extrême simplicité et réussit toujours.

Lorsqu'on a à sa disposition du matériel frais, qu'on étudie au fur et à mesure, il est préférable d'employer du formol légèrement

1. p. de Beauchamp, Fixation à l'état d'extension des animalcules contractiles et spécialement des Vorticelles. Bull. Soc. zooL. de France, XXIX, p. 26, 1904.

})icriqué. La lixalion est encore meilleure et la légère teinte jaune que prennent les animaux est très favorable à l'observation. Brumpt emploie de préférence du formol à 5 p. 100, auquel il ajoute 10 p. 100 de Bouin (p. 284); ce liquide sert à la fois de fixateur et de médium conservateur; on lute au lui de Kronig ou d'Apalby.

Voici, à noire avis, comment on doit procéder pour étudier et conserver au mieux les Infusoires parasites.

1° Etude ci/tologique. Sur frottis fixés humides au Bouin, au Duboscq-Brasil, au sublimé alcoolique, au Flemming, etc., puis colorés.

Pour faciliter l'adhérence des Infusoires à la lame, employer le procédé de la salive (p. 4^78) préconisé par Brumpt.

On peut aussi fixer en masse par cenlrifugalion. Pour conserver les échantillons fixés, sans qu'ils se mélangent, Metcalf préconise, à la suite de Mayer, l'emploi de capsules de gélatine formées de deux tubes emboîtés (capsules Le Huby de Le Perdriel). Ces capsules sont moins fragiles que les petits tubes de verre et évitent l'emploi du tampon d'ouate, dans lequel une partie du matL-riel peut se perdre. On ferme au collodion le cylindre intérieur, de manière que son contenu ne glisse pas entre les deux cylindres et ne soit pas écrasé. Le tout est jeté dans l'alcool fort à 95 ou 90, mais non à 80, qui ramollit la gélatine.

2° Etude morphologique. Déposer sur une lame une gouttelette de liquide renfermant les Infusoires, ajouter une goutte de Bouin très étendu, d'après la formule de Brumpt. Becouvrir d'une lamelle el luter. Avant d'ajouter le liquide fixateur, il est bon d'aspirer au buvard la plus grande quantité d'eau possible, sans que toutefois les Infusoires se dessèchent.

3° Conservation en masse dans le formol à 5 ou 10 p. 100, suivant la quantité d'eau qui imbibe les objets.

Coloration. — Le carmin et Thématoxyline sont les meilleurs colorants pour les Infusoires. Les meilleures teintures de carmin sont le carmin chlorhydrique et le carmin al une de Mayer. Lliématoxyline ferrique est indispensable pour l'étude du noyau. En ce qui concerne l'iiématoxyline alunée, les avis sont partagés : beaucoup d'auteurs el notamment iMetcalf, déconseillent riiémalun el préconisent Thématoxyline de Delafield. Cette dernière solution n'est vantée qu'à cause de sa puissance de coloration. J'ai déjà montré plus haut (p. 376) que cette formule est surannée et je

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crois qu'ici encore on peul la reuiplacer avec avanlaûjo par le glychémakin de Mayer, dont l'action est tout aussi énergique et dont la préparation et la conservation sont beaucoup plus aisées. J'ajouterai que l'hémalun de Mayer (nouvelle formule de 1904) m'a donné d'excellents résultats pour Balaniidium coli, B. eniozoon, Nyclotherus cordiformis Qi pour diverses Opalines.

Quoi qu'il en soit, il faut généralement surcolorer les Infusoires, puis les différencier dans de Falcool chlorhydrique très dilué (1 à 2 p. 1000), surveiller au microsco})e et ai'rèler l'action jiar un lavage à l'eau ou mieux, d'après Metcalf, à l'eau légèrement ammoniacale. Avec Thémalun de i\Ia}er (nouvelle formule) on peut arriver facilement à obtenir une bonne coloration par teinture progressive, sans difïérencialion. Pour éviter la décoloration des préparations, Metcalf conseille d'exposer, pendant quelques secondes, aux vapeurs d'ammoniaque, les Opalines déshydratées et imprégnées d'huile de cèdre, avant de les monter au baume. Pour examiner les grosses espèces, fixées et colorées in toto, on peut les mettre dans l'huile de cèdre, l'essence de girofle ou le terpin'ol, sous une lamelle supportée d'un côté par un cheveu. En imprimant de légers déplacements à cette lamelle, on peut retourner les Infusoires et les examiner sur toutes leurs faces.

Comme colorant de fond, on choisira l'éosine de Hochst après l'hémalun ou le glychémalun et la fuchsine acide après l'hématoxyline ferrique.

Coupes dinfusoires. — Ces coupes sont faciles à faire sur les Infusoires fixés en masse et désliydratés par centrifugation. Le culot, puisé avec une pipette, est inclus dans la paraffine et coupé comme un bloc de tissu. Pour faciliter cette inclusion, Metcalf conseille de faire tous les passages et l'inclusion dans de petits tubes de gélatine à fond rond, qu'on trouve facilement dans le commerce (capsules l.e Huby de Le Perdriel). On se débarrasse ensuite de la gélatine en la ramollissant dans l'eau froide. Voir aussi p. 312 et p. 475 (coupes cl'Amibes).

On colore les coupes à l'hématoxyline ferri([ue de Heidenhain, à l'hémalun, au glychémalun, à la safranine-lichtgrïin, etc.

Coloration des cils. — Les méthodes de coloration que nous avons indiquées pour les frottis et les coupes mettent généralement hien les cils en évidence, surtout en employant un bon colorant cyloplasmique. Pour une étude plus particulière de ces organes on peut employer le procédé de Lôfjler (p. 699), légèrement modifié pour être appliqué aux frottis humides. On a soin de ne chauffer ni le mordant, ni le colorant et de les faire agir tous deux à froid au moins une demi-heure. 11 faut éclaircir au xylol et non à l'essence de girolle. D"apres Waddinglon i, un