Ibidem, p

4. C. R. Soc. de biologie, LXVI, 8 mai 1909. — Vitalité, résistance et activité des globules Ijlancs dans les maladies. Semaine médicale, 3 nov. 1909. On y trouvera diverses autres techniques que nous ne pouvons reproduire ici, faute de place. Pour l'étude de ïactivit' leucocytaire et du pouvoir leuco-actioant des liumeurs, voir la Thèse de Ch. Foix, Paris, 1911. où on trouvera des détails complets sur la technique à employer : dans des ampoules à injections, coupées en deux, on mélange, d'une part, 10 gouttes de sérum normal, 10 gouttes de sérum artificiel citrate (NaCl 7 gr. 5, citrate de sodium 6 gr., eau lOOOi, 1 goutte d'émulsion de Levures de muguet (tuées au formol puis lavées) et 1 goutte do sang normal témoin ; d'autre part, les mômes éléments, mais avec une goutte do sang à étudier. Brasser. Porter 30 minutes à l'étuve à 37", centrifuger 10 minutes, étaler le culot en frottis épais, sécher, hémolyser, colorer au Romanovsky. INumérer

Levures

les polynucléaires et les Levures incluses et établir le rapport — j r-r—. .

i - ^' polynucléaires

M. Langeron. — Précis do Microscopic. *0

goutte de sang, soit le culot de centrifugalion des sérosités ou du liquide céphalo-rachidien. On porte vingt minutes à 37° puis on examine en chamhre humide. Opérer cet examen rapidement (o minutes), pour que les leucocytes n'aient pas le temps de mourir.

/. Recherche des leucocytes à granulations iodophiles. — Faire un frottis, le sécher et le laisser pendant quelques minutes dans un cylindre de Borrel, au fond duquel on a mis quelques cristaux d'iode; puis examiner à l'immersion, en recherchant les leucocytes fjui renferment des granulations brun acajou.

Frottis desséchés. — iMélhode loiidamentale de riiématologie. Préparer des Icnnes neuves et bien dégraissées par brossage

dans Fean de savon, lavées à Feau, conservées dans l'alcool à 90" (p. 236) (ou simplement lavées à Talcool ammoniacal), puis essuyées soigneusement avec un linge non pelucheux ; une ou plusieurs lamelles 22 X 32, aussi minces et souples possible, les choisir à bord bien droit, sans échancrures ni saillies, renforcer une des extrémités par une éliquette collée à cheval sur le pelil côté. Prélever le sang comme il est dit plus haut (p. 621).

Avoir soin d'employer, pour chaque frottis, une goutte de sang bien ronde et bien fraîche, non coagulée.

Lorsque le sang a tendance à se coaguler ou à s'étaler autour de la plaie, bien essuyer la peau et faire

Fiff. 241. — a-d, les quatre temps , ,,

successifs de l'exécutioa d'un frot- SOUrdrC UUC UOUVelle gOUttC par UUC

tis de sang; e, aspect que doit pressiou légère.

présenter le frottis terminé. ^ ,, /• , • j i- ,r n-

D'après Langeron in Archives de Confection deS frottlS. — ClUq

parasitohMjie. IcmpS :

a. Déposer une gouttelette de sang à un centimètre environ de Textrémité d'une lame (fig. 241, «), ou encore prendre cette gouttelette avec le tranchant du petit côté

de la lamelle.

b. Tenir la lamelle inclinée à 45'' (fig. 241, b) et mettre le petit côté en contact avec la lame, au point où se trouve la goutte de sang .

c. Attendre que cette goutte ait fusé (fig. 241, c) par capillarité tout le loug du petit côté.

cl. Tirer la lamelle (fig. 241, d), eu appuyaut légèreiiieut, de façon à étaler le sang eu couche mince et uniforme. 11 y a deux façons de procéder : ou bien on tire la lamelle de gauche à droite (fig. 241, d), et alors les éléments sont entraînés par capillarité et par frottement, ou bien on pousse la lamelle (fig. 242) de droite à gauche, et les éléments sont entraînés seulement par capillarité. Les deux procédés sont bons. Le second a l'avantage de ne pas rouler ni comprimer les éléments, mais il permet moins facilement de régler l'épaisseur et la marche des frottis. Ce qui est essentiel, c'est de tirer la lamelle d'un seul coup et sans s'arrêter ni se reprendre.

Fig. 242. — Exécution d'au frottis en poussant. D'après Daniels.

Fig. 243. — Exécution d'un frottis de sang avec une aiguille. D'après Daniels.

e. Dessécher rapidement le frottis, en agitant la lame ou en réventant avec un carton, un éventail arabe, etc. Cette dessiccation rapide est indispensable pour la bonne conservation de la forme des globules et des parasites. /Ve jamais chauffer pour sécher les frottis.

Conditions que doit remplir un frottis. — Il doit être mince et complet :

1° Mince : les globules doivent être étalés en une seule couche et séparés les uns des autres, sans se recouvrir ni former d'amas.

2° Complet : la goutte de sang doit être étalée en entier (donc ne pas la prendre trop grosse!). S'il en est autrement, la lamelle

entraîne, avec Texcès de sang, la plii]»art des leiicocvles, des hématies parasitées, des Pilaires, etc., d'où erreurs de diagnostic. Le frottis doit présenter l'aspect représenté eu e (fig. 241), avec une extrémité arrondie et des bords accessibles à Tobservation microscopique.

Autres procédés. — En cas de besoin, on peut faire le frottis avec une aiguille (fig. 243) ou avec une autre lame, dont on a cassé un coin, de telle sorte que la couche de sang n'alteigne pas le bord de la première lame. Autrement on ne peut examiner les parties latérales du frottis; cet inconvénient serait très grave, parce que c'est sur les bords qu'il y a le plus de leucocytes et de Protozaires.

Proscrire absolument les procédés où on emploie du papier (carte de visite, papier à cigarettes, etc.). Ces objets absorbent le plasma, retiennent les leucocytes et les hématies parasitées et donnent des frottis détestables.

Les divers étaleurs métalliques qui ont été proposés sont tous à déconseiller parce qu'ils donnent des frottis trop minces et trop larges.

Insuccès. — 1. Le sang s'étale mal par places : lame malpropre ou grasse.

2. Le frottis se termine par une ligne droite et épaisse : goutte de sang trop grosse ou lamelle trop appuyée, ou encore on s'est repris à plusieurs fois et on a tiré la lamelle en hésitant.

3. Le frottis se termine par de grandes dentelures ou de longs prolongements : lamelle trop appuyée ou à bord irrégulier. Recommencer en poussant la lamelle de droite à gauche (fig. 242).

4. Le frottis est troué de petites perforations rondes : ce sont les traces de trompes de Mouches. Cet accident est très fréquent dans les pays chauds.

Frottis épais. — Ce procédé, dû à Ross^, est destiné à permettre

de découvrir, clans le sang, des parasites qui y existent en très petit nombre. Déposer sur une lame plusieurs grosses gouttes de sang (fig. 244, a), les réunir en une seule nappe avec une aiguille (fig. 244, 6) et laisser sécher. Sans fixer, colorer par le Giemsa dilué (1 goutte pour 1 cm>^ d'eau dist.), laver très doucement, sécher sans buvard sur un égouttoir(voir p. 492). Ce procédé est très employé dans les pays anglais, mais je trouve qu'il donne des résultats si médiocres et si aléatoires que je n'en conseille pas l'emploi habituel. Les frottis de ce genre un peu anciens se colorent très mal. Voir p. 522, note 2, la modification de James.

Frottis humides -. — En hématologie, ce procédé n'est utile que pour

Fig. 244. — Exécution dun frottis épais par la méthode de Ross. D'après Daniels.

1. Lancet,!, p. 86, 1903. — Thompson Yates Laboratories Reports, V, part. 1, 1903. •2. Voir p. 482 les méthodes de Breinl et Moore, Rosenbusch, Minchin.

des recherches cytologiques très spéciales. Faire de préférence les frottis sur lauielle. de manière à les déposer face en dessous et à les faire flotter à la surface du fixateur. Ne prendre (jue du sang riche en parasites, faire les frottis sur lamelle par la méthode ordinaire ou puiser et étaler la g-outle de sang avec une effilure de pipelte. Se hâter pour que la couche n'ait pas le temps de sécher.

Tous les fixateurs conviennent. On colore ensuite à l'hénialoxyline ferrique (p. 377) ou au Giemsa pour frottis humides.

Si on fait les frottis sur lame, les déposer face en dessous, sur deux cales, dans une cuvette ou une boîte de Pétri pleine de fixateur.

Méthode de Weidenreich i. — Elle consiste à fixer le sang avant l'étalement. Mettre dans un bocal bouchant à Témeri 5 cm ' d'acide osmique à I p. 100 avec 10 gouttes d'acide acétique cristallisable. Exposer d'abord la lame pendant deux minutes aux vapeurs osmiques, puis étaler le sang et, sans sécher, exposer aux vapeurs pendant une minute. Sécher, lixer par l'alcool absolu pendant dix minutes. Laver pendant une minute dans du permanganate de potassium très dilué (2 gouttes de solution à 1 p. 100 dans 50 cm-^ d'eau). Laver à l'eau, puis sécher au buvard. Colorer au llomanovsky.

Conservation des frottis desséchés. — Ils se conservent très longtemps, à condition de nè.lre pas fixés. En voyage, il ne faut donc jamais fixer les frottis. On se contente de les emballer, séparément ou par petits groupes, dans des feuilles de papier, portant une indication ou un numéro d'ordre. Ces paquets sont enfermés daiis des boîtes hermétiquement closes et conservées à l'abri de l'humidité. La colorabilité des froltis diminue au fur et à mesure qu'ils vieillissent; pourtant, avec les méthodes de Pappenheim (procédé panoptique et surtout panchrome), on peut, en prolongeant la coloration pendant une heure, obtenir des résultats suffisants.

Coloration du sang -. — La découverte des colorations panoptiques a lendu inutiles, dans la pratique courante, toutes les autres méthodes de coloration. Je conseille donc, en ce qui concerne le sang, de laisser de côté toutes les anciennes méthodes (hématéine-éosine, triacide d'Ehrlich. bleu polychrome) : ces procédés étaient excellents autrefois, mais ils doivent passer maintenant dans le domaine histori(iue ou être réservés à des recherches spéciales. Avec les mélbodes panoptiques, on obtient d'un seul coup et avec une seule préparation, la coloration élective de tous les éléments normaux et anormaux du sang, avec des nuances précises et constantes, correspondant à leurs affinités chroma-

\. l'olia luenialolofjica, III, p. 1-7, 1006.

2. Pour la coloration des leucocytes dans les tissus, voir p. (.51.

tiques. On colore en outre des éléments (granulations azurophiles, chromatine des Protozoaires, corps en demi-lune, hématies granuleuses) que les autres méthodes ne peuvent pas mettre en évidence.

Qu'il s'agisse du sang normal on pathologique ou de la recherche des Hématozoaires (p. 522), je conseille de colorer les frottis, soit par la méthode panoptique de Pappenheim (p. 405), soit par le panchrome de Pappenheim (p. 411).

Fig. 245. — Bocal pour fixer les frottis par l'alcool absolu. — Original.

Les parties acidophiles (hématies, granulations éosinophiles) sont rouges ou rosées; les noyaux des leucocytes et des hématies, violet plus ou moins foncé; les noyaux des Protozoaires et les granulations azurophiles, d'un beau pourpre. Les granulations neutrophiles sont violettes, les granulations basophiles des iabrocytes*, d'un bleu foncé presque noir; les ponctuations basophiles des hématies, bleu cobalt. Le protoplasme des lymphocytes est d'un beau bleu ciel. Les hématoblastes sont violacés.

Procédés particuliers. — On peut encore fixer

le frottis (cinq minutes dans l'alcool méthy-

lique pur, dix minutes dans l'alcool absolu, fig. 245), laisser sécher, puis

colorer dans le Giemsa, dilué, avec les précautions ordinaires, à 1 goutte

pour 1 cm'^ d'eau distillée.

Pour la coloration spécifique des granulations neutrophiles, fixer par la chaleur : mettre un cristal d'urée (fondant à 131°) sur une extrémité de la lame, poser la lame sur la platine chauffante (fig. 147), surveiller et retirer dès que le cristal commence à fondre. Après refroidissement, colorer quinze minutes au moins par le triacide d'Ehrlich, laver très rapidement à l'eau, sécher.

Pour la coloration spécifique des granulations acidophiles, opérer de même avec le triacide d'Ehrlich spécial pour ces granulations (éosineaurantia-induline).

Hématoblastes. — Contrairement à ce qui est dit dans certains ouvrages, les hématoblastes sont très faciles à colorer par la méthode de Romanovsky et notamment par la méthode panoptique et le panchrome de Pappenheim. Il faut donc les étudier sur des préparations colorées : ils sont très visibles dans toute l'étendue de la préparation et pas seulement dans sa portion initiale comme

1. Les labrocytcs sont assez abondants, à l'état normal, chez le Lapin et surtout chez le Cobaye et le Hérisson, où ils sont très caractéristiques.

on l'a dit quelquefois à loit. Ils sont légèrement azuiopliiles el, dans les préparations fixées, ils se colorent par Tazur de méthylène (orthochromaliquemenl), par Téosinate d'azur (mélachromaliquement) et en partie par le bleu de crésyl brillant. En outre, Tazur et le bleu de crésyl, donnent avec eux des colorations vitales.

On peut étudier les hématoblastes soit dans des frottis ordinaires de sang d'un Mammifère quelconque, soit par le procédé à Tencre de Cliine (p. 699;, qui permet d'en faire facilement une numération assez exacte par rapport aux -hématies; mais la technique la plus précise est due aux recherches d'Achard et Ayuaud '. Le fait capital, démontré par ces auteurs, est que les hématoblastes disparaissent au contact des tissus; il est donc indispensable de prélever le sang par ponc/ion veineuse.

Prélèvement. — Seringue en verre de 5 cm^, avec aiguille d'acier de 15 mm. de longueur et de 1 mm. 7 de diamètre. Aspirer 2 cm^ de citrate de sodium à 10 p. 100 préalablement stérilisé. Désinfecter la peau avec un liquide aqueux (pour éviter la vaso-constriction). Ponctionner rapidement la veine, pousser un peu de citrate, puis aspirer. Verser le sang- dans un tube paraffiné ou dans le fixateur.

Examen à l'état frais. — Laisser sédimenter, puis prélever du plasma et examiner en goutte pendante, sous lamelle vaselinée. Les hématoblastes apparaissent sous forme de petits fuseaux très pâles.

Coloration. — Frottis desséchés faits avec le sang citrate. Le Roma-

novsky réussit seu/. On peut aussi fixer le sang en masse 2 avant de l'étaler.

.,,,,,., , hématies

Numérations. — Elle est destinée a établir le rapport ^hématoblastes

= ^. Il est indispensable de recueillir le sang par ponction veineuse

comme plus haut. Retirer la seringue, en laissant l'aiguille pour remplir un mélangeur Potain destiné à numérer les hématies. Ajouter un peu de sang au liquide de dilution suivant :

Citrate de sodium 10 gr.

Chlorure de sodium 5 • —

Eau distillée Q. s. pour 500 cm».

Formol à 40 p. 100 10 cm».

1. Aynaud. Le globulhi de l'Homme. Méthodes d'observation et de numération applicables en clinique. Progrès méOical, 52 avril 1911; Annales de V Institut Pasteur, XXV. p. 56-78, 1911.

2. Par exemple dans un mélange de 9 cm^ d'acide osmique à 5 p. 100 avec 1 cm' de citrate de sodium à 10 p. lUO. On fait tomber 5 gouttes de sang dans 10 cm- de fixateur. Centrifuger deux fois, étaler le second culot et colorer au Romanovsky.

3. Aynaud, Méthode de numération des globulius de l'Homme, C. R. Soc. de biolorjîe., 18 juin 1910. — Brodie and Russel, The enumeration of blood platelets, Journ. of pliysiolof/ij, XXI. 1807. — Helber, Zâhlung der Blutplattchen, Dtsch. Archu: f. klin. Med., LXXXl, 1905.

de manière à avoir un liquide rosé. Dans les 16 grands carrés de la cellule de Thoma (fig. 247), il doit y avoir 1 200-1 500 hématies. Numérer à 500 diamètres, en diaphragmaal tortement. Compter hématies et héma-

IT

toblastes dans les 10 grands carrés et étaijlir le rapport j-. Pour connaître

le nombre d'hématoblastes par mm^, diviser le nombre d'hématies par ce rapport. A l'état normal, le chiflre moyen est de 216 000.

Réticulum fibrineux. — A Tétude des hématoblastes se rattache celle du réticulum hbrineux, méthode très simple, dont Hayem et ses élèves ont su tirer des déductions intéressantes.

Déposer une goutte de sang sur une lame bien propre, ou mieux sur une cellule de Ranvier (Mg. 142). l'ifiuer le doigt du malade de manière à avoir une grosse goutte, dans laquelle on puise avec une fine pipette ou sur laquelle on pose doucement le centre de la lame. Recouvrir très délicatement d'une lamelle et fermer à la vaseline, sans déplacer la lamelle. Examiner à 500 diamètres le réticulum fibrineux (jui se forme dans les lacs situés entre les piles de globules. Normalement ce réticulum est pres([ue invisible. On peut en môme temps apprécier grossièrement le noml)re des leucocytes.

Causes d'erreur dans l'examen des lames de sang.

Balfour i a donné une excellente revue de ces causes d'erreurs (avec figures en couleur). Il les di%'^se en deux groupes, suivant qu'elles sont d'origine externe ou ([u'elles i^roviennent du sang lui-même.

r Corps étrangers d'origine externe. — Poils d'Insectes, filaments de coton, simulant des Microlilaires. Cellules de Levures, conidies cloisonnées, spores diverses. Pour les animaux blessés par coups de feu, se méfier des parasites intestinaux et des spermatozoïdes qui peuvent passer dans le sang. Examiner les parties de la lame non couvertes de sang, pour voir si on n'y trouve pas les mêmes corps; se rappeler que les parasites du sang sont rarement isolés. Ne pas oublier que le buvard, avec leijuel on sèche les préparations, peut transporter d'une lame à l'autre hématies et parasites. Les débutants se méfieront des précipités colorés.

2° Corps étrangers d'origine interne. — Dans le sang frais : hématies crénelées, vacuoles (quel([uefois très trompeuses), granulations issues des leucocytes, hématies altérées par le chaulîage (intentionnel ou accidentel), hématoblastes, hémoconies, corps flagelliformes indéterminés.

Dans les préparations colorées : hématoblastes (principale cause d'erreur, on les reconnaît à leur structure réticulée; ceux des Sauropsidés (cellules en fuseau, Spindelzellen) sont encore plus trompeurs). Altérations globulaires (corps en pessaire, en demi-lune-, anneaux de

1. Balfour, Fallacies and puzzles in blood examination. Fourlh Report of the Wellcome tropical rescarch Laboratories at Kliartiioum, vol. A. Médical, p. 109- 125, 1911.

2. M. Langeron, Hématies en demi-lune, C. H. Soc. de biologie, LXX, p. 43-1, 1911. Association française pour V avancement des sciences, Conr/rès de Dijon. p. 588-596, 1911. '

Cabot, taches marginales azurophiles, qu'il ne faut pas confondre avec les Anapiasina, restes nucléaires ou centrosomes, etc.)- Altérations globulaires artificielles dues au frottis, aux fautes de technique, etc. Altérations leucocytaires et débris leucocytaires : il faut aussi reconnaître dans les leucocytes les plasmosomes de Ferrata (petits et métachromati(iues) et les corps de Kurloff ' (fréquents chez le Cobaye, volumineux et azurophiles).

d° Hématozoaires nouveaux ou douteux. — Sergentella Iiominis Brumpt, 1910. Corps de Hœfer, corps X de Howell et Horrocks, retrouvés par Balfour2 chez l'Homme (extra ou endoglobulaires, formés d'une masse centrale colornble en bleu, entourée d'une capsule rose).

A ces causes d'erreur, on peut ajouter celles qui ont été signalées récemment par Schilling-Torgau 3. Je ne suivrai pas cet auteur dans ses considérations hypothétiques sur la structure des hématies. Je signale seulement les faux parasites (reproduits expérimentalement chez le Chat et le Cobaye) ({ui apparaissent, au cours des anémies, sous forme d'une aire bleue plus ou moins annulaire, avec un ou plusieurs points rouges.

Schilling- considère comme des i)seudo-parasiles : les formes persistantes du paludisme (Dauerformen) de Plehn; les parasites du typhus exanthémalique de Krouipecher-Goldzicher et Angyom; VAnaplasma marginale et tous les corpuscules marginaux; les parasites de la fièvre jaune de Seidelin. Je reproduis ces indications sous toutes réserves et seulement pour recommander aux observateurs la plus grande prudence.