CHAPITRE H

La leclini(]ue m)^cologique tient, pour l)eaucoiip de points, de la technique bactériologique. En etïet, Tétude vraiment scientifique des Champignons, et surtout des Champignons microscopiques, repose sur la méthode des cultures pures. Les difficultés sont pourtant moins grandes que pour les Bactéries et les précautions moins rigoureuses, car les contaminations sont plus faciles à déceler, en raison du volume des élémeuls et de leurs caractères morphologiques bien définis.

Le cadre de ce volume ne me permet pas de m'étendre sur ce chapitre, aussi, pour cette question comme pour les précédentes, je me bornerai aux indications les plus essentielles.

Milieux de culture. — Lorsqu'on veut faire l'étude biologique complète d'un Champignon, il faut le cultiver sur un grand nombre de milieux et étudier les modifications qu'il leur imprime. Pratiquement, pour le diagnostic et l'étude morphologique, deux sortes de milieux suffisent : la carotte ^ et un milieu gélose.

Carotte. — On lave soigneusement les carottes et on les découpe à l'emjiorte-pièce (fig. 259), ou simplement au couteau, en prismes allongés, qu'on introduit dans des tubes spéciaux (fig. 260) ou simplement dans des tubes ordinaires.

Avoir soin de remplir d'eau l'ampoule inférieure jusqu'à la base du morceau de carotte. Pour les tubes ordinaires mettre un doigt d'eau. Stériliser vingt minutes à 120".

Milieux géloses. — Les milieux géloses types sont ceux de

1. Ou une racine analogue, dans les pa^ys où la carotte n'est pas connue. En Europe, je considère la carotte comme supérieure à la pomme de terre pour les Ghampi nons. La betterave est aussi très favorable.

Saboiiraud : ces milieux, créés pour l'élude des teignes sont de deux sortes.

Le milieu d'épreuve est un milieu fortement sucré (4 p. 100), sur lequel les Champignons des teignes prennent leurs formes typiques : le milieu de conservation est un milieu non sucré, destiné à empêcher les Champignons des teignes de se pléomorphiser.

Outre ces deux milieux, j'en emploie un troisième, renfermant moitié moins de sucre (2 p. 100) que le milieu d'épreuve et plus favorable, à mon avis, pour beaucoup de Champignons.

Pour les cultures en milieu liquide ou en goutte pendante,

Fig. -259. - Manière de découper lés pommes de terre ou les carottes à l'emporte-pièce. a, emporte-pièce; b. manière de découper la carotte sur un disque de bois ou de liège; c, cylindre découpé par l'emporte-pièce; rf, les deux moitiés du cylindre. D'après Bezançon.

Fig. 260. — Tube pour carottes.

on aura d'excellents bouillons sucrés en supprimant simplement la gélose dans ces formules. Aucun de ces milieux^ solides ou liquides, ne doit être neutralisé.

Enfin, pour beaucoup de Moisissures, on obtient d'excellents résultats avec la gélatine aux pruneaux .

Milieu d'épreuve :

Eau de source i 000 cm'^.

Glucose massée de Glianut ^ 40 gr.

Peptone granulée de Chassaing 10 —

Gélose coupée en petits morceaux 18 — •

1. Ou maltose brute de Chanut suivant les cas. Sabouraud a démontré la supériorité dos sucres bruts sur les produits chimiquement purs. Ces sucres, ainsi que la peptone. se trouvent chez Cogit, à Paris.

Milieu de conservation :

Eau de source 1 000 cm-^

Gélose 18 gr.

Peptone granulée de Ghassaing- 30 —

Gélose sucrée ordinaire :

Eau de source 1 000 cm^.

Glucose massée de Chanut 20 gr.

Peptoae granulée de Gliassaing- 10 —

Gélose 18 —

Gélatine aux pruneaux : Faire tremper 10 pruneaux dans 250 cm3 d'eau pendant une nuit. Faire cuire à feu doux pendant une ou deux heures, décanter, compléter à 250 cm^ et ajouter 15 p. 100 de gélatine. Faire fondre au bain-marie. Répartir en tubes. Stériliser vingt minutes à 110°. A la place de la gélatine on peut mettre 1,8 p. 100 de gélose.

Fabrication des milieux de culture. — Elle exige quelques précautions très simples, mais indispensables, ([ui ont été mises en lumière par Sabouraudi.

1" Chauffage. — Mélanger tous les éléments dans un grand ballon, laisser la gélose s'imbiber pendant une demi-heure, puis porter à l'autoclave. Monter lentement à 120° avec une seule couronne de gaz, éteindre dès qu'on atteint cette température.

2° Filtralion. — Quand l'autoclave est redescendu à 100°, ouvrir et bien agiter le ballon pour mélanger exactement le contenu. Mettre dans l'autoclave deux iDallons de un litre, munis chacun d'un entonnoir et d'un filtre plissé en papier Chardin. Répartir la gélose dans ces deux entonnoirs. Dès qu'un des filtres ne laisse plus passer le liquide que goutte à goutte, on enlève l'entonnoir, on le remplace par un autre garni d'un filtre neuf, au-dessus duquel on crève le filtre engorgé. L'entonnoir sale est lavé et garni d'un autre filtre. On continue, en s'arrangeant de telle sorte que les filtres laissent toujours couler un filet de liquide. On obtient ainsi une iiltration très rapide, avec un déchet insignifiant et on évite l'emploi de l'appareil à liltrations chaudes dont la lenteur est désespérante. L'autoclave éteint, mais encore chaud, suffit pour maintenir la gélose à l'état liquide.

Après Iiltration, on réunit le tout dans un même ballon et on agite pour assurer l'homogénéité du liquide.

3" Reparution. — Avec un entonnoir dont la douille porte un tube de caoutchouc muni d'une pince de Mohr et d'un tube efhlé. Garnir convenablement les tubes ou les matras coniques. Ne pas mouiller les parties qui seront en contact avec le bouchon d'ouate. Boucher à l'ouate ordinaire, mais ne pas faire les bouchons trop serrés, car ils ne sécheraient pas après la stérilisation.

4° Stérilisation. — Monter très lentement à 120° avec une seule couronne de gaz. Eteindre dès qu'on a atteint cette température. Aussitôt que la pression est tombée, retirer immédiatement les tubes et les incliner en les soutenant avec un gros tube de verre (lig. 261).

1. Annales de Dermatoloyie, p. 93, 1908. — Arch. de Parasitoloyie, XII, p. 33, 1908. — Maladies du cuir chevelu, III, Maladies cryptogamiques, Paris, Masson, 1910, p. 113.

Pendant toute la durée des opérations, la gélose ne doit pas se solidifier. 11 ne faut donc s'interrompre, si peu que ce soit, à aucun moment. Un litre de gélose

donne environ cent tubes. Une gélose glucosée bien faite doit

être transparente et de couleur légèrement bleuâtre, ce qui indique que le sucre n'a pas été caramélisé. La gélose maltosée est beaucoup plus foncée.

Cultures en tubes. — C'est le procédé ordinaire, qui su f fil pour la plupart des cas, soit qu'on parte des lésions, soit qu'on fasse seulement un repiquage. L'ensemencement se pratique avec les mêmes précautions que pour les Bactéries (fig. 263). Il faut employer des fils de platine assez résistants, car les Champignons forment souvent des enduits difficiles à dissocier. Des trois formes représentées par la figure 262, le fil droit et la spatule sont les plus favorables. L'anneau ou anse * sera réservé pour la manipulation des milieux et des cultures liquides.

Le repiquage se fera de préférence en points séparés, plutôt qu'en stries. On obtient ainsi de belles cultures concentriques. Au contraire, les cultures premières partant des lésions devront être faites en longue strie, de façon à disséminer les germes à la surface du milieu de culture et à rendre leur séparation éventuelle plus facile. Ensemencer abondamment . caries produits pathologiques sont généralement pauvres en germes.

Ne jamais capuchonnerles tubes et les laisser presque toujours à la température du laboratoire.

Conservation et envoi des cultures de Champignons. — Pinoy - a donné à ce sujet des indications très judicieuses : les cultures de Champignons à spores résistantes (Ascomy-

261. — Manière d'incliner les tubes pour solidifier la gélose. D'après Bezançon.

Fig

abc

Fil?. 262. — Trois modèles de lils de platine, a, spatule ; 6, anse ; r, aiguille.

Daprcs Bezançon.

1. C'est ce que certains ouvrages français appellent ose. Je crois inutile d'adopter ce terme gerraaniiiuc. suirisammcnt traduit par le substantif anse.

2. Pinoy, Conservation et envoi dos cultures de Cliampignons inférieurs. Bail, .^oc. pat/iol. exof., II. p. 60-63. 1909.

M. Langeron. — Précis de Microscopie.

cèles) doivent être parfaitement desséchées et conservées ou expédiées en tubes simplement l)oucliés au coton. Pour les espèces à spores fragiles (iMucorinées), on pourra conserver très longtemps les cultures vivantes en les ensemençant dans du bouillon sucré (1 p, 100), sous une couche d'huile de vasehne (3 cm^ pour 10 cm'' de bouillon). Ne jamais expédier de tubes scellés ou cachetés, renfermant des cultures sur milieu humide, car toutes les spores germent en môme temps et les colonies meurent faute d'air.

Cultures en matras. — Ces matras sont des petits flacons coniques d'Erlenmeyer, au fond desquels on coule un mince disque de gélose. Au centre on fait un ensemencement en piqûre. On obtient ainsi de magnitiques cultures circulaires, très caractéris-

Fig. 263. — Manière d'ensemencer les tubes do gélose. D'après Bezançon.

tiques. L'avantage de ces récipients est de donner aux Champignons un cube d'air plus considérable et un espace libre bien plus grand.

Cultures en cellules. — La méthode des cultures en gouttes pendantes est la méthode cardinale de la mycologie : elle seule permet d'observer In situ les organes de fructification, sur lesquels repose toute la systématique.

En effet, l'examen direct, par dilacération des cultures, ne montre généralement que des débris dissociés. On y reconnaît bien les organes caractéristiques, mais ils ont généralement perdu tout rapport avec le mycélium. Je ne mentionnerai que pour mémoire le procédé du décalque (Klatsch) qui nécessite l'emidoi de boîtes de Pelri et ne donne pas de meilleurs résultats.

Au contraire, la culture en cellules, en gouttes pendantes ou sur miheu solide, permet de suivre pas à pas le développement du mycélium, d'observer l'apparition des appareils de fructification et enfin de fixer la culture en préparation définitive, au moment favorable.

La méthode des cultures en gouttes pendantes, (elle que nous

Fig. 264.

Culture en cellule sur lame.

Original.

l'appliquons, est due à Van Tiegliem et Le Monnier *, qui Tont employée pour leurs belles recherches sur les Mucorinées. Elle consiste essentiellement à cultiver les Champignons dans une goutte de milieu solide ou liquide, placée à la face inférieure d'une lame ou d'une lamelle reposant sur une cellule en verre (fig. 139 et 264). Celle-ci est formée par

un anneau de verre (fig. 138) collé sur une lame. Voici la technique à laquelle je me suis arrêté -.

Préparation des cellules. — Elle consiste à coller les anneaux sur les lames au moyen du lut de Kronig (p. 447). Je choisis des anneaux de 18 à 20 mm. de diamètre, de façon à pouvoir les recouvrir avec des lamelles 22x22. Je fais fondre un peu de lut dans une petite capsule de métal ou de porcelaine placée sur la platine chauffante (fig. 147). Je plonge dans le lut fondu la tranche de Tanneau de verre, je la pose sur une lame, je porte le tout un instant sur la platine et j 'appuyé fortement pour assurer l'adhérence parfaite.

Au moment de se servir de ces cellules, on les flambe et on les retourne sur un support analogue à celui de la figure 267. D'autre part, la lame ^ sur laquelle on pratiquera l'ensemencement est flambée

et retournée sur le même support ou simplement tenue, face flambée en dessous, avec la pince Debrand (fig. 266).

Lorsqu'on emploie un milieu solide, on en dépose une trace au-dessous du milieu de la lame avec la spatule de platine. Pour les milieux liquides,