Ann. des se. nat., (5), XVII, p

2. Landrieu a proposé récemment un petit appareil en verre inventé par lui pour les cultures cellulaires. Voir à ce sujet sa thèse de doctorat en médecine, Les mycoses oculaires, Paris. 191-2; cf. p. -38.

3. II est plus facile d'opérer avec des lames, mais, lorsqu'on doit suivre la cul-

Fig. 265. — Pipette coudée pour ensemencement des cultures en cellule. — Original.

Fig. -266. — Pince de Debrand,

il est bon d'employer une pipette coudée (fig. 265). La goutte ne doit être ni tro[> petite, car elle s'évaporerait facilement, ni Iro}) grosse, car elle pourrait loucher les bords de la cellule. J'ai déjà dit (p. 244) que, sur les lames flambées, les liquides ont une fâcheuse tendance à s'étaler. On peut, pour obvier à cet inconvénient, sortir les lames de 'l'alcool et, sans les essuyer, allumer le liquide et le laisser brûler.

Ensemencement. — L'idéal, pour une culture en cellule, est d'ensemencer une seule spore. Malheureusement l'obtention de cette spore unique est un procédé long et délicat. Pour y parvenir, il faut faire une émulsion de spores, en s'arrangeant de manière à ce que chaque goutte renferme une spore. On dépose des gouttes sous une série de lames llambées et on choisit au microscope

celles (|ui renferment une seule spore.

On peut généralement se dispenser

Fig. 267. — Support en baguettes de verre pour colo- . , ' » •

rations et ensemencements. — Original. UC Cetie preCaUllOU,

surtout si on part d'une culture pure. Il suffit alors d'ensemencer un très petit nombre de spores. Pour cela, on fait une première émulsion de spores sous une lame flambée et on prélève une trace de cette émulsion qu'on ensemence sous la lame préparée.

Fermeture. — Prendre une des cellules, la retourner et la poser face en dessus sur la table. Sans tarder, appliquer la lame ensemencée sur la cellule, en mettant la goutte bien au milieu et en prenant bien soin qu'elle ne puisse toucher les bords de l'anneau de verre. On peut fermer à la vaseline qu'on applique au pinceau, en tenant le petit appareil entre le pouce et l'index. Je trouve préférable de lu ter à la paraffine tendre qu'on applique avec le fer à lu ter (fig. 181). Il peut être avantageux, dans certains cas, de mettre au fond de la cellule une goutte d'eau stérilisée, pour éviter le dessèchement. Il faut savoir que, même à la température ordinaire, cette eau se condense sur la lame supérieure et augmente peu à peu le volume de la goutte.

ture à un fort grossissement (300 diam.) il est indispensable d'opérer sur lamelles, qui permettent seules l'emploi d'objectifs à court foyer. Dan.s ce cas, on fixe la lamelle dans une pince de Cornet ou de Debrand et on fait ainsi très commodément l'ensemencement en dessous, exactement comme pour une lame.

TECHNIQUE MYGOLOGIQUE

Conduite de la culture. - Il faut toujours l'aire un assez grand nombre de cellules, à cause des insuccès inévitables (dessèchement ou étalement des gouttes). Les cultures à la température ordinaire réussissent généralement sans difficulté. Il n'en est pas de même de celles des Gham])ignons Ihermophiles, qu'on est obligé de pratiquer à Tétuve. Quand on juge que la culture est suffisamment dévelopj)ée, on détache la lame, on la retourne face en haut et on la met sécher à Tétuve à 37° : elle est alors prête à subir la coloration (Sabouraud).

Cultures à sec. — Depuis bien longtemps, les mycologues qui se sont occupés de Champignons filamenteux ont tâché

Fig. 268. — Culture sèche Fig. 269. — Culture sèche Fig. 270. — Culture sèche

on tube. D'après de sur lame piquée dans en cylindre Borrel. D'a-

Bcurmann et Gougcrot. la gélose. D'après de près de Beurmann et

Beurmann otGougerot. Gougerot.

d obvier à la difficulté d'observer les cultures en tubes et àTennui de préparer des cultures en cellules. Unna paraît être le premier qui ait résolu la question par la méthode des cultures dites sèches ou à sec ^ Il enseir.enrait les CJiampignons sur le bord d'une gouttelette du milieu solide, placée soit sur une lame, soit dans un tube et observait le développement du mycélium sur le verre sec. Ce procédé a été repris récemment, pour Tétude de la sporotrichose, par de Beurmann et Gougerot qui lui ont donné le nom

1. Unna, Die Zûchtung der Oberhautpilze. Monatsh. f. jirukt. Dermat., VII, p. 465, 1888. — Zur Untersuchungstechnik der llyphomyccten. Centralhl. f. /?«/.7eno;., XI. p. 1-9, -JO-ll. 1892.

de procéd ' des lames sèches : ils placent une lame de verre dans un tube garni d'un doigt de bouillon sucré (fig. 268), ils la piquent dans un tube de gélose sucrée (fig. 269), ou mieux encore disposent trois paires de lames dans un tube Borrel (fig. 270), en les maintenant écartées par un liège entaillé '. Après stérilisation de Tappareil, on ensemence le Champignon dans le liquide et le long des lames de verre; le mycélium se développe sur ces lames, sous forme de colonies étoilées, quelquefois très caractéristiques. Ce procédé est bien plus expédilif que celui des cultures en cellules, mais il est aussi moins rigoureux; le développement des colonies est livré au hasard et il est difficile de les suivre au microscope. Il est impossible de faire des cultures en partant d'une seule spore.

Méthodes d'examen. — Nous ne saurions assez répéter que la méthode des frottis ne convient pas pour les Champignons. C'est une erreur, malheureusement trop répandue parmi ceux qui ne sont pas botanistes et mycologues de profession, de croire que les Champignons doivent être traités par les méthodes bactériologiques. Les frottis ne peuvent donner aucune idée de la morphologie des Champignons, parce que leur confection fragmente le mycélium, détache les spores et brise les ramifications. A part quelques exceptions, les colorants bactériologiques ne donnent que de très mauvais résultats, parce qu'ils sont beaucoup trop énergiques. Lorsqu'on recherche des Bactéries, on s'efforce de les colorer le plus intensément possible ; peu importe la différenciation de la membrane ou du protoplasme, pourvu qu'on reconnaisse la forme de l'organisme et ses réactions colorantes (réaction de Gram, acido résistance). Pour les Champignons, il en est tout autrement : les caractères de la membrane, des cloisons, etc., ont une grande importance systématique. En outre, ce sont des végétaux fragiles qui, généralement, ne sui»portent pas sans dommage les procédés un peu violents des bactériologistes (fixation à la flamme, dessiccation, etc.). A part les Microsiphonés qui, pour certains points, se rapprochent des Bactéries, les Champignons réclament une technique délicate.

Lorsqu'on les étudie dans les tissus, ceux-ci doivent être traités par les méthodes histologiques, mais, lorsqu'on examine des Champignons en cultures ordinaires ou cellulaires, il faut éviter les manipulations qui ))euvent contracter et déformer les filaments

1. p. Chevallier a heureusement modifié ce dispositif en sulislituant au liège entaillé un lictit tube de verre.

mycéliens el les spores. Ici, deux cas peuvent se présenter : ou bien on veut faire l'élude c\ tologique du Champignon, et alors les procédés à employer sont exactement les mêmes que ceux de la cytologie animale ', pour la iixalion. Tinclusion et la coloration; ou bien on veut simplement faire l'élude morphologique, et alors il faut examiner le Champignon dans un liquide approprié, qui éclaircisse ses éléments tout en conservant leur forme. C'est dans ce liquide que devront être exécutés les dessins qui sont la base de toute bonne description systématique. Le montage au baume est très délicat et déforme généralement les Champignons. Il est préférable de monter en milieu liquide ou à la glycérine gélalinée, ceux qui n'ont pas élé traités par les méthodes histologiques.

Coupes de cultures. — Lorsque les cultures cellulaires sont difticiles à obtenir et que la dilacération des cultures ordinaires ne donne pas de bons résultats, la meilleure méthode est alors de fixer la culture en masse, par un fixateur hislologique, de préférence par le liquide de Duboscq-Brasil, qui mouille très bien les Champignons. On extrait alors la culture du tube ou du matras et on la traite exactement comme une pièce hislologique, mais en prenant bien soin de ne pas léser la couche mycélienne. Les coupes réussissent très bien avec la carotte et avec la gélose. On fait des coupes un peu épaisses, de manière à bien voir l'insertion des conidies. Colorer de préférence au bleu de Unna, avec différenciation par l'élher glycérique.

Recherche des Champignons dans les tissus. — Lorsqu'il s'agit de Champignons filamenteux, le meilleur procédé de recherche est l'examen des tissus dans la potasse à 40 p. 100 (voir p. 714 l'examen des teignes). Lorsque le Champignon n'existe pas, dans les tissus, à l'état filamenteux, la recherche directe est généralement inutile: il est préférable de recourir d'emblée à la culture. C'est le cas de la sporotrichose et en général des mycoses généralisées. On peut arriver cependant à déceler ces Champignons dans les fragments de tissus fixés, inclus, puis colorés par un colorant basique, par exemple le bleu polychrome de Unna (p. 427) ou le bleu de toluidine, seul associé à l'éosine (p. 429) : l'hématéine-éosine donne quelquefois aussi de bons résultats. Nous étudierons plus loin les cas particuliers.

1. Un modèle d'études cytologiques est le travail de Maire, Recherches cijtolof/iques et taxonomirpies sur les Basidionnjcèles. Thèse do Paris sciences), in-S" de -209 p., S pi., 1902. Bull. Soc. mijcol. de France. 190-2.

712 MIÎTHODES SPÉCIALES

Quoi qu'il eu soil, daus lous les cas de mycoses, ou fera bien de couserver d'une part du matériel à sec dans des tubes stériles, d'autre part du matériel fixé par uu fixateur histologique, de préférence le liquide de Bouin.

Examen et coloration des Champignons filamenteux. — Qu'il s'agisse d'une culture ordinaire dissociée ou d'une culture cellulaire, il faut débarrasser les filaments mycéliens de l'air qu'ils emprisonnent entre eux, les éclaircir et au besoin les colorer.

Un des meilleurs milieux ^ d'observation est certainement le lactopJiéïiol de Amann (p. 444). Il suffit souvent d'examiner le Champignon dans ce liquide ])0ur étudier parfaitement sa morphologie. Ce procédé présente Tavanlage de ne masquer aucun des détails de la membrane. Pour le matériel desséché et pour chasser les bulles d'air, il suffit de chauffer doucement la préparation, jusqu'à apparition de bulles, de façon à chasser l'air et à rendre leur turgescence aux filaments mycéliens. On peut monter les préparations dans ce même liquide en lutant au lut de Kronig (p. 447).

Le meilleur colorant pour ces préparations est le bleu coton qu'on emploiera, suivant les cas, en dissolution à 1 p. 100 dans l'eau ou à 0,5 p. 100 dans le laclophénol. A mon avis, le bleu au lactophénol est très supérieur au bleu lactique. Les recherches de Guéguen^ ont montré que le meilleur bleu coton est le bleu C4B de Poirrier (Société anonyme des matières colorantes de Saint-Denis). Le bleu au lactophénol colore soit la membrane, surtout lorsqu'elle renferme de la callose, soit le contenu protoplasmique des filaments. Après coloration, on lave à l'eau et on monte au lactophénol, ou à la glycéiine gélatinée, après imprégnation ])ar le lactophénol.

Dans certains cas, on emploie avec avantage le Sudan III en solution dans le lactophénol (solution concentrée à chaud), qu'on peut additionner d'un millième de bleu coton, comme le conseille Guéguen. On met ainsi en évidence des matières grasses ou au moins sudanophiles. On peut aussi se servir avec avantage du triple colorant de Guéguen ^ (acide lactique 100, Sudan III, 0,1, dissoudre à chaïul et ajouter 0,1 de bleu coton et 30 gouttes de

1. Pinoy a proposé le milieu suivant : ITjdrate de ehloral 40 gr., glycérine 20 gr., eau 20 gr., solution alcoolique d'acétate de plomb à 2 p. 100, 10 cm\ Filtrer. Bull. Soc. pat/toi. exot., 11, p. G2, 1909.

2. Bull. Soc. mj/color/iqite de France. XXI, p. 42-16, 1905. a. Ibidem, XXIT, p. 224-22C, 1900,

teinture d'iode; conserver à l'abri de la lumière) qui met en évidence à la fois les graisses, Tamidon et le glycogène.

Inoculations expérimentales. — Il nous est impossible de donner ici le détail des méthodes d'inoculation particulières à l'étude de chaque mycose. C'est d'ailleurs un champ dans lequel l'ingéniosité de l'expérimentateur devra se donner libre cours. Le temps n'est plus où l'on injectait des doses massives de spores dans les veines d'un Lapin : ces procédés, un peu violents, sont trop éloignés des voies plus discrètes que suit la nature pour produire l'infestation de Torganisme animal ou humain.

Une heureuse tendance à se rapprocher de ces voies naturelles s'est montrée depuis quelques années. Je n'en donnerai pour exemple que la réussite des tentatives de Pinoy pour reproduire expérimentalement certains mycétomes. Ce succès est dû, d'un coté au choix de l'animal réceptif, en l'espèce le Pigeon, et, d'un autre côté, au mode spécial d'inoculation, dans la patte de cet animal.

L'étude expérimentale des mycoses présente des difficultés particulières : ce sont en effet des maladies souvent locales, au moins au début. 11 ne suffit pas toujours, pour les reproduire, d'introduire dans la circulation ou dans le péritoine l'agent pathogène, sous une forme quelconque. Nous ne savons pas au juste à quel état se trouve, dans la nature, le Champignon, au moment où il pénètre dans l'organisme. Cet état favorable peut être celui de spores ou de conidies ou encore de mycélium développé dans des conditions particulières. C'est ce que Pinoy réalise en inoculant, dans les pattes des Pigeons, des cultures étouffées sous l'huile de vaseline.

11 faut ensuite trouver, ])our chaque Champignon, un animal réceptif: ainsi, le Lapin se prête aux mycoses aspergillaires généralisées, le Pigeon aux mycoses localisées dans la patte, le Rat fait très facilement de l'orchite sporotrichosique, le Cobaye convient pour l'étude expérimentale des teignes, etc.

Enfin, il faut choisir le meilleur mode dïnoculation, en se rapprochant autant que possible des moyens naturels. Or il est probable que les Champignons pénètrent presque toujours dans l'organisme par la voie cutanée, beaucoup plus rarement par les voies respiratoire ou digestive. Pour les mycoses généralisées, on emploiera la voie sous-cutanée, sanguine ou péritonéale. Pour les mycoses localisées, on emploiera uniquement la voie sous-cutanée :

on aura souvent avantage, au lieu d'iuoculer à la seringue une émulsion de spores, à insérer sous la peau de petites échardes ou des fragments de Bambou, sur lesquels on aura auparavant cultivé le Champignon à expérimenter.

En cas de succès, il est absolument indispensable d'oblenir des rétrocultiires, en partant des lésions obtenues. C'est la seule preuve irréfutable de la réussite de Texpérience.

Blastomycètes.

Les cultures seront examinées dans le lactophénol et colorées au bleu coton. On peut aussi faire des frottis et les colorer, soit au Romanovsky, soit au bleu coton en solution aqueuse à 1 p. 100, à l'azur II alcalin, etc. Dans les frottis d'organes et dans les coupes, on pourra les rechercher par la méthode de Gram. Lé bleu de toluidine en solution dans l'eau distillée (Vuillemin et Potron) colore bien la membrane, surtont dans les coupes de tissus.

L'action pathogène sera étudiée le plus souvent par inoculation intra-péritonéale au Lapin ou au Cobaye.

Pour obtenir des asques avec les Levures, faire des cultures soit sur blocs de plâtre, soit sur milieu très peu sucré ' (eau 100, gélose 1, peptone 1, glucose O.^lo), ou mieux encore sur des lames en terre de pipe (Thiry) plongeant, dans un tube à essai, dans quelques cm"^ de ce dernier liquide préparé sans gélose.

Champignons des teignes^.

1. Prélever les poiis, squames ou cheveux avec la pinceàépiler ou par raclage avec une lame. Conserver entre deux lames flambées, enveloppées dans une feuille de papier portant les indications manuscrites. Cette réserve peut fournir pendant longtemps des cultures pures ou du matériel de diagnostic.

2. Diagnostic. — La méthode classique consiste à faire l'examen extemporané dans la potasse à 30 p. 100 (eau 70, potasse en pastilles 30). Mettre le cheveu ou la squame entre lame et lamelle,

1. Gorodkowa, Uober das Vcrfahren rasch die Sporcn vou Ilofepilzen zii gcwinncn. Bull, jardin iuipévial Sainl-Pctcrsiourij , YIII, p. 165, 1908.

5. Tous les détails qui vont suivre (sauf la nouvelle méthode (|ue je propose pour le diagnostic) sont empruntés à l'ouvrage du D'" Sabouraud, Maladies du cuir chevelu.., III, Maladies cryptogamiques. Les leir/nes. Paris, Masson. in-8" de 8r»5 p.. 28 pi., 1910.

TECUiMQUE MYCOLOGIQUE 715

dans la soliilion de polasse : cliauITer avec précaution jusqu'à apparilioii de bulles. Examiner la préparation telle quelle, après avoir essuyé les bords avec des bandelettes de buvard. Diapbragmer fortement.

Il n'est pas facile, après le traitement par la potasse, d'obtenir les ])réparations permanentes indispensables pour les comparaisons.

Nouvelle méthode. — Je préfère beaucoup, pour le diagnostic, traiter les cheveux ou les squames par un des éclaircissants de Amann. Le lactophénol n'éclaircit pas assez : le meilleur milieu à employer est le chlorallactophénol (p. 724). Si les cheveux sont très opaques, prendre le chlorallactophénol salicylé ([). 725). Chauffer très légèrement pour faciliter la pénétration. On obtient ainsi, instantanément, des préparations au moins aussi bien éclaircies que par la jiolasse et dans lesquelles les éléments ne sont pas dissociés. Le cheveu est simplement ramolli, mais ne s'écrase pas.

Pour rendre ces préparations permanentes, on peut les monter telles quelles, en lutant simplement la lamelle au lut de Kronig. On peut aussi enlever la lamelle, absorber Téclaircissant avec du buvard et le remplacer par du chloralphéuoL puis par de la térébenthine de Venise ou du baume. L'opération ne demande que quelques instants et les cheveux la sup}»ortent très bien car ils sont peu fragiles.

3. Préparations colorées de cheveux et de squames. Méthode de Sabouraud. — Dégraisser au chloroforme, faire bouillir deux ou trois minutes dans Tacide formique, laver à l'eau distillée, colorer une minute au bleu de Sahli (p. 391), laver, déshydrater, monter au baume.

4. Méthode d'ensemencement. — Tout le secret de la réussite consiste dans V ensemencement parcellaire sur le milieu d'épreuve de Sabouraud (p. 703) : la partie parasitée du cheveu ou du poil devra donc être divisée en parcelles aussi petites que possible, sur une lame tlambée, avec un scapel stérile. Les fragments, saisis avec le fil de platine flambé puis humecté sur la gélose, sont disposés dans les tubes, à un centimètre Tun de l'autre. Cette fragmentation est indispensable pour mettre en liberté les éléments du mycélium, condition sans laquelle la culture ne serait pas possible.

Poir riierpès circiné, on fait sourdre du pus ou (W la sérosité

716 MKTHODES SPECIALES

qu'on ensemence. Si la lésion est sèche, on racle des squames qu'on fragmente el qu'on ensemence.

Sabouraud recommande de faire de nombreux tubes (5 ou 6 au moins) el de n'ensemencer que 5 ou 6 parcelles sur chaque tube. Laisser les tubes non capuchonnés à la température ordinaire, ou au plus à l'étuve à 25°. Pour conserver les cultures avec leur forme ty|»ique et éviter l'apparition du pléomorphisme, il faut repiquer sur miheu de conservation (p. 704).

5. Inoculations expérimentales. — Le Cobaye est l'animal de choix, mais il est immunisé par une première inoculation. Tondre entre les deux épaules, charger de culture une aiguille mousse flambée, insérer le Champignon dans le derme. Le traumatisme est guéri en cinq' jours; les lésions apparaissent vers le huitième jour et guérissent spontanément au bout d'un mois. C'est vers le quinzième jour qu'on trouve le |)lus de poils malades, parasités surtout à la base. On peut aussi inoculer des poils malades, mais en ayant soin de ne prendre que la base, pour éviter les Moisissures banales qui souillent l'extrémité.

Mycétomes.

Le diagnostic des mycétomes ^ doit toujours se faire par l'examen des grains dans la potasse, à chaud ou à froid : ce procédé permettra de reconnaître la présence des filaments mycéliens, d'écraser les grains, d'étudier leur forme, etc. Pour les mycétomes à Discomijces, on pourra aussi faire des frottis avec les grains et colorer par l'azur II alcalin ou par le Qram : un examen à l'état frais bien fait, avec ou sans potasse, montrera toutefois beaucoup plus de choses que ces frottis, où les éléments sont dissociés et fragmentés.

Il faut toujours fixer histologiquement des pièces. Pour les coupes, on emploiera d'abord la coloration à l'hématéine-éosine qui permettra de juger des réactions des tissus. Si le Champignon ne se colore pas, on complétera la coloration en faisant un Qram ordinaire ou modilié d'après Lignières (p. 717). Bien entendu, les pièces seront lixées au Bouin comme d'habitude. La détermination du Champignon ne peut se faire que par les cultures.

Si on pense avoir isolé l'agent pathogène, il faudra expérimenter

1. E. Briimpt. Les myrétomos. Arch. de parasitolorjie. X. p. 489-579. pi. XII- XXI, 1906.

TECHNIQUE MYGOLOGIQUE 717

par inoculations locales (inélhoile de Pinoy, p. 713), de piéférence par insertion sous la peau de fragmenis de Bambou, épines, aiguillons, etc., sur lesquelles on a obtenu des cultures.

Actinomycoses.

L'étude pratique des actinomycoses comprend le diagnostic, Texamen des coupes et les cultures.

Examen du pus. — La recherche des grains dans le pus ne présente généralement aucune difficulté : il suffit d'étaler un peu de pus sur une lame et d'examiner à l'œil nu ou à un faible grossissement. On isole les grains avec une aiguille, on les transporte dans une goutte de solution physiologique et on examine entre lame et lamelle en écrasant légèrement. En diaphragmant convenablement, on voit très bien l'aspect miiriforme des grains et, dans les portions plus écrasées, les filaments et les massues.

Lorsqu'on veut isoler une certaine (piantité de grains, on peut, comme le fait Lignières, traiter le pus par la potasse à 10 p. 100, centrifuger et laver le dépôt à plusieurs reprises.

Coloration du pus. — La coloration des Champignons de l'actinomycose présente une difficulté particulière, parce qu'il faut mettre en évidence les filaments mycéliens et les massues. On profite de ce que les filaments sont fortement basophiles et prennent le Gram, tandis que les massues sont plutôt acidophiles et ne prennent pas le Gram. On pourra donc faire d'abord un Gram, par la méthode ordinaire, puis colorer le fond et les massues par l'éosine à 1 p. 100 ou mieux par la fuchsine acide à 1 p. 100, ou encore par la fuchsine phéniquée de Ziehl, mais sans chauffer. La fuchsine acide présente l'avantage de donner une coloration intense et de permettre une différenciation facile par l'eau : on arrête la différenciation en lavant à l'eau acidulée par l'acide acétique.

On peut faire des coupes de pus très instructives, en laissant tomber de grosses gouttes de pus dans du Bouin et en traitant ensuite comme un fragment de tissu.

Coloration des coupes. — De très nombreuses méthodes ont été proposées \ mais aucune n'est parfaite. Celle qui m'a donné

1. Voir notamment la rovuc de P. Chausse, Méthodes de coloration communes à l'actinobacillose. l'actinomycosc et la l)otryomycose. Anii. Institut Pasteur, XXIII, p. 503-508, 1909. D"après Lignières. la meilleure méthode pour colorer V Actinobacillp est le Romanovskv.

les meilleurs résuUats est encore celle de Lignières* que j'emploie comme il suit :

1. Colorer à l'hémaléiae, différencier et virer comme d'habitude (p. 374).

2. Colorer au violet pliéniqué (p. 39i) pendant trois minutes à

froid.