M E T H ODE S G E N E R A L E S

liquide à la température ordinaire des laboratoires (15-20°). La pièce que l’on y plonge y restera plus ou moins longtemps suivant sa grosseur, puis on la portera dans de la paraffine molle, pure, fondue, maintenue dans une étuve réglée exactement à la température de son point de fusion. Cette paraffine est placée dans des boîtes de verre, ou dans de petits godets en métal que l'on met sur les rayons de l’étuve. On a soin de remuer la pièce déposée dans ce bain, en se servant d'une spatule conforme à celle qui est représentée figure 28; cela favorise la pénétration de la paraffine. La durée du bain de paraffine en fusion varie d'un quart d’heure à six heures, suivant la grosseur de la pièce et sa pénétrabilité; chacun apprendra par la pratique le temps nécessaire dans les différents cas; il faut toujours se rappeler qu'il est inutile sinon nuisible de prolonger au delà du strict nécessaire le temps consacré à cette opération.

Lorsqu’on juge la pièce bien imbibée de paraffine molle, on la porte dans un bain de paraffine dure, ou du mélange de paraffine molle et dure choisi pour faire les coupes, et maintenu en fusion dans une étuve dont la température ne doit jamais dépasser 60° et peut même être en dessous de ce chiffre si le mélange choisi fond à une température moindre. Là, elle se pénètre de cette paraffine dure qui se substitue peu à peu à la paraffine molle qui l’imprégnait. Si l'on voulait attendre une pénétration absolument complète et parfaite de la pièce par la paraffine dure, il faudrait la laisser dans le bain aussi longtemps qu’on l’a laissée dans la paraffine molle, mais cela n'est pas nécessaire, et après un temps assez court la paraffine dure a suffisamment imprégné l’objet pour permettre de belles coupes, et comme l’action prolongée de la chaleur est nuisible à la bonne conservation des éléments, il vaut mieux abréger ce temps de l’opération. Pour un objet de très petit volume, on peut se contenter de le laisser dix minutes à un quart d’heure dans la paraffine dure, un objet volumineux n'a pas besoin d'y séjourner plus de quatre heures, et souvent il suffit de deux heures au maximum. Au bout de ce temps, on peut faire l’inclusion, c'est-à-dire couler dans un moule à

fi 0 U P E S Il f S T 0 L 0 fi I Q U E S

la fois la paraffine dure et la pièce. Le moule dont on se sert consiste en un cadre métallique formé de deux moitiés et que l’on place sur une lame de verre. Pour pouvoir orienter les pièces on peut mettre sur un photophore, (comme l’indique la ligure 48) la lame en verre qui forme le fond du cadre, la lumière arrivant en dessous éclaire bien l’objet. Lorsque le moule établi aux dimensions que l'on a choisies est placé sur un photophore à portée de l’étuve renfermant la paraffine en

Fig. 48.

Moule à paraffine préparé sur un photophore pour une inclusion.

fusion, on y verse la paraffine et on y place la pièce à inclure. En se servant de la spatule ou d’aiguilles chauffées, l’on oriente cette dernière par rapport aux faces du moule, de manière à pouvoir faire les coupes dans le sens que l’on désire. Il importe absolument que la pièce plonge entièrement dans la paraffine et soit partout recouverle d’une couche assez épaisse de cette dernière. Si la paraffine est un peu dure et par suite se prend très vite, on peut pour éviter cette prise rapide qui gêne l'orientation des pièces, en ne laissant pas le temps nécessaire pour la mener à bien, chauffer légèrement le moule, ce qui retarde la prise de la paraffine et laisse du temps pour placer la pièce dans la position convenable. Dès que la paraffine s’est solidifiée et que la pièce suffisamment maintenue ne peut plus être dérangée par les mouvements imprimés au moule, on porte dans de l'eau froide ce dernier, avec la lame de verre sur laquelle il repose, en ayant soin que l’eau n’atteigne pas sa face supérieure ouverte, avant une solidification parfaite do

METHODES GENERALES

la paralline. Sans cela l'eau pourrait former des cavités ou des huiles au sein de la paraffine encore molle. Au bout d'un séjour d'un quart d'heure ou d'une demi-heure dans l’eau, la paraffine est parfaitement durcie, et l’on peut démouler le bloc contenant la pièce sans crainte de le déformer. Il suffit pour cela d'écarter les pièces de fer qui constituent le moule. Le bloc de paraffine est dès lors prêt à être coupé, et on peut immédiatement le monter dans le microtome. Si l'on ne veut pas ou si l'on ne peut pas le couper immédiatement, il est bon de l’envelopper dans une feuille de papier blanc sur laquelle on écrit toutes les indications nécessaires se rapportant à la pièce incluse, puis les blocs ainsi étiquetés peuvent être conservés dans un flacon à large goulot. Un étiquetage soigneux des pièces ainsi conservées est absolument indispensable pour éviter des erreurs souvent très désagréables.

2" Avantages et inconvénients des inclusions à la paraffine, précautions à prendre. — Les avantages des inclusions à la paraffine sont considérables. C’est grâce à celte méthode d’inclusion que la confection de coupes en séries ininterrompues est devenue facile, et chacun sait les services que l'étude de ces séries a rendus à l'embryologie. L'inclusion à la paraffine permet seule jusqu’à présent de faire des coupes très minces et régulières. On peut en effet obtenir des coupes d'un millième de millimètre d’épaisseur, ce qui est indispensable pour les études cytologiques. Enfin elle a mis à la portée de tous le moyen de faire des coupes fines d'une certaine étendue en un temps très court, et avec une sûreté absolue. C'est là un avantage très grand et qui a beaucoup contribué à la diffusion des recherches histologiques.

Malheureusement cette méthode a aussi quelques inconvénients. Si toutes les précautions n’ont pas été prises pendant la fixation, la déshydratation, l'imbibition par un dissolvant de la paraffine et enfin dans le cours de l'inclusion proprement dite, et notamment si l’on a laissé trop longtemps la pièce dans le bain de paraffine à 5o-60°, les tissus sont plus ou moins ratatinés, les cellules séparées les unes des autres

C 0 U P lï s 1 1 I S T 0 L 0 r. [ Q v E S

et les rapports des parties modifiés ou détruits comme le montre l’exemple du cartilage (fig. 47).

On sait du reste que l’inclusion à la paraffine détruit l'élasticité des tissus. Un élément anatomique placé dans la glycérine pure se ratatine, mais si faction de la glycérine a été ménagée graduellement de façon à ne pas amener de rupture, il revient ensuite à son état primitif, parce que son élasticité n’a pas été abolie. Avec la paraffine il n’en est plus de même (voy. Fixations , p. 106).

En dehors de ce point, il est assez difficile d’établir quelle part peuvent avoir dans celte altération des tissus les différentes manipulations nécessitées par l’inclusion, ou encore les hydratations et les déshydratations successives par lesquelles les coupes passeront avant d’être définitivement montées (voy. plus loin), mais il est incontestable qu’on ne saurait donner trop de soin à la préparation des inclusions.

A ce propos nous signalerons les points suivants :

a. Influence du fixateur. — Tous les fixateurs ne permettent pas également bien l’inclusion dans la paraffine. Ainsi l’acide osmique employé seul, qui fixe très bien les tissus, ne leur donne pas une résistance suffisante pour supporter sans dommage ce mode d’inclusion. L’exemple suivant le montrera : un ganglion de Casser du mouton est fixé par une injection interstitielle d’acide osmique à 2 p. 100 (Ranvier). Les cellules sont admirablement conservées, comme on peut s’en rendre compte en les dissociant partiellement dans l'eau, mais si l’on inclut dans la paraffine le reste de ce même ganglion, en prenant d’ailleurs toutes les précautions nécessaires, on voit que les cellules ont perdu leur forme globuleuse, sont

revenues sur elles-mêmes et se sont inégalement rétractées dans leur enveloppe endothéliale en prenant une forme étoilée irrégulière. Nous avons donc ici un exemple très net d’altérations produites au cours de l’inclusion. Mais si, au lieu de fixer le ganglion par l’acide osmique, on emploie pour cela le liquide de Flemming, on obtient de bien meilleurs résultats et les cellules sont beaucoup mieux conservées. 11 semble que l'acide chromique de ce dernier réactif, en se combinant avec

les éléments anatomiques, leur ait communiqué une résistance plus grande à l'action déformante des manipulations exigées par l'inclusion. Le choix d’un fixateur n’est donc pas indifférent lorsqu’on veut ultérieurement inclure les pièces à la paraffine. La liqueur de Flemming m'a paru constituer sous ce rapport un fixateur de choix. Il faut tenir compte aussi de la valeur de la fixation elle-même, et quel que soit le fixateur choisi, une pièce supporte d’autant mieux l'inclusion qu'elle a été mieux lixée.

h. Influence de la pénétration des pièces par la paraffine. — 11 arrive parfois que, faute d’une déshydratation suffisante ou d'une bonne imbibition par le xylol ou par un dissolvant quelconque de la paraffine, cette dernière ne pénètre pas l’objet. Dans ce cas les coupes sont impossibles, la pièce se détache du bloc de paraffine qui l’entoure, revient sur elle-même et se plisse, mais il peut arriver aussi que la pénétration, tout insuffisante qu’elle soit, permette cependant de faire des coupes, mauvaises du reste. Si l'on a alors la curiosité de les monter et de les examiner, on voit qu'elles sont considérablement détériorées. Or cette mauvaise pénétration de la paraffine se rencontre quelquefois. Certains tissus présentent une grande résistance à l’inclusion à la paraffine. Rawitz cite parmi eux le cartilage, l’os décalcifié, les faisceaux musculaires, les revêtements épidermiques ; j’y ajouterai le tissu fibreux et en particulier le derme cutané. Il importe donc, toutes les fois que l’on a affaire à une pièce contenant une certaine quantité des tissus susnommés, de faire grande attention à sa bonne pénétration par la paraffine. Pour cela on veillera à la déshydrater complètement par l’alcool absolu, à la pénétrer convenablement par le xylol et par la paraffine, ce qui est en fin de compte une question de temps ; il ne faut pas oublier toutefois qu'un séjour trop prolongé dans le bain de paraffine dure est nuisible aux bonnes conservations.

En somme, les précautions à prendre pour faire une bonne inclusion consistent à bien fixer les objets, en choisissant pour cela de préférence un fixateur très durcissant, tel que le liquide de Flemming, et à donner aux pièces une dimension convenable

(10 CP K S H ISTO LOGIQUES

pour permettre une pénétration complète et suffisamment rapide, afin de ne pas être obligé de les laisser trop longtemps dans le bain de paraffine fondant à une température élevée. Celte pénétration dépend du reste étroitement de la déshydratation parfaite de l’objet et de son imbibition complète par un bon dissolvant de la paraffine.

Ci-dessous un tableau indiquant la marche d’une inclusion et la durée de chacun de ses temps. Il est inutile d'ajouter que ces derniers chiffres n'ont rien d’absolu et qu'ils indiquent simplement les limites dans lesquelles on peut se mouvoir.

ORDRE de succession des

réactifs.

PIÈCES minces ou ayant au

maximum 1 mm.

de côté.

PIÈCES a\ ant au maximum 5 mm.

de côté.

PIÈCES ayant au maximum 1 cm.

de côté.