M E T H 0 D E S GE N E HALES

d’y arriver en trempant fréquemment le rasoir dans la soucoupe de droite et en y plongeant aussi la pièce lorsqu'il en est besoin.

Parmi les coupes recueillies dans la boîte de Pétri il y en a de meilleures les unes que les autres. Pour les rechercher on place la boîte sur un fond noir si les coupes sont blanches (après fixation par l’alcool par exemple) ou bien sur un fond blanc si les coupes sont noires (fixation par l'acide osmique), et grâce à cela il est facile de distinguer les coupes les mieux réussies. On 11e garde que ces dernières, les autres sont enlevées en se servant d'aiguilles à dissocier, et rejetées. Les coupes faites par ce procédé et recueillies dans l'alcool subissent ultérieurement des traitements différents suivant la nature du fixateur employé et la coloration que l'on désire leur donner, nous y reviendrons plus loin.

1° Calage des pièces dans la moelle de sureau. — Si la

pièce est trop petite pour être tenue à la main, on la fixe dans un cylindre de moelle de sureau en procédant de la manière suivante. O11 fend longitudinalement en deux moitiés un cylindre de moelle en se servant d'une scie d'horloger fine ou d’une lime plate très mince (un scalpel casserait inégalement le sureau), puis 011 pratique sur la face plane de chaque moitié du cylindre une logette de forme et de dimensions appropriées à celles de la pièce à couper, ou mieux un peu plus petite. On place la pièce dans cette loge et 011 rapproche les deux moitiés du cylindre que l'on peut réunir l'une à l’autre par quelques tours de fils non serrés, placés en dessous de la pièce. Cette dernière est maintenue en place par le sureau qui la presse de toutes parts, et qui forme en même temps un cylindre facile à tenir dans la main gauche. O11 coupe alors le tout, pièce et sureau, du même coup de rasoir, en suivant exactement les règles indiquées ci-dessus. Les minces lames de sureau, coupées en même temps que l'objet, flottent dans l’alcool à 00° dans lequel 011 recueille les coupes, il est, facile de les trier et de s’en débarrasser.

Pour faciliter l’exécution des coupes à la main, Ranvier a

COUPES HISTOLOGIQUES

imaginé il y a longtemps déjà son microtome décrit page 30. Dans ce microtome on place le cylindre de moelle contenant la pièce à couper, ou bien si la pièce est grosse on se contente de la caler avec des fragments de moelle qui l’entourent complètement et la maintiennent solidement au milieu de rùme du microtome. O11 coupe avec le rasoir à lame plane mouillé d'alcool. Le plateau du microtome guide la lame du rasoir qui doit être étroitement appliquée sur lui.

La pièce une fois affranchie, à Laide de la vis placée à la partie inférieure on peut faire monter légèrement la pièce et le sureau, on place alors la lame plane du rasoir sur le plateau du microtome et on attaque la pièce toujours très obliquement. On fait ainsi une

coupe d’épaisseur égale à la hauteur dont la pièce a été soulevée par lavis, on donne un nouveau tour de vis et l’on recommence autant de fois qu’il est nécessaire.

Pour bien faire les coupes, il importe de ne pas appuyer sur la table ou contre son propre corps le bras gauche qui tient l'instrument, mais de le garder libre à quelque distance du corps, le microtome étant tenu à peu près à la hauteur de l’estomac. Le bras ainsi indépendant de tout point d’appui s’adapte mieux aux

Fig. 50.

Manière de faire une coupe avec le microtome de Ranvier.

Fig. 49.

Calage d'uuc pièce dans la moelle de sureau.

M K T IHH) ES G ENE U A LES

mouvements de l’autre bras qui tient le rasoir et les coupes se font plus régulièrement. Lés coupes sont portées dans l’alcool en trempant dans ce dernier la lame du rasoir sur lequel elles se trouvent. Il est utile de caler très soigneusement la pièce avec du sureau, pour éviter tout mouvement de latéralité sous l’influence du rasoir; du reste le sureau se gonfle un peu en s’imbibant d’alcool et maintient de mieux en mieux la pièce.

Avec un peu d’habitude on arrive à faire avec le microtome de Ranvier des coupes assez étendues, assez minces et assez régulières. Il faut éviter de poser obliquement le rasoir sur le plateau du microtome , comme si l’on voulait entamer ce dernier, parce que l’on détériore beaucoup son tranchant. Pour maintenir celui-ci en parfait état, il est recommandé de passer fréquemment le rasoir sur le cuir pendant qu’on fait les coupes.

Il est certaines pièces très délicates qui souffriraient de la compression même légère exercée sur elles par la moelle de sureau, telles sont par exemple la rétine, la muqueuse olfactive, etc. Dans ce cas, pour maintenir la pièce on se sert soit de l'enrobage à la cire et l'huile, soit de l’enrobage au collodion.

2Ü Enrobage à la cire et l’huile. — On fait un mélange de cire vierge et d’huile d’olive que l'on fond à un feu doux. La quantité de chacune de ces substances est indiquée par le degré de dureté que l’on exige de leur mélange et qui varie nécessairement suivant les saisons. On creuse ensuite à la partie supérieure d’un cylindre de moelle de sureau une cavité de dimensions appropriées à celles de la pièce à enrober. On la remplit d’alcool à 90° qui se répand d’ailleurs bientôt dans tout le cylindre de moelle. On prend alors la pièce, déposée jusque-là dans de l’alcool à 90°, on la place convenablement dans la cavité préparée pour la recevoir en la maintenant avec de fines pinces, et on coule autour d'elle le mélange fondu de cire et d’huile. Ce dernier se prend en masse et soutient la pièce qu’il renferme sans la comprimer.

COUPES IIISTOLOGIQ ü E S

On porte dans le microtome de Ranvier le cylindre qui contient l’enrobage, ou on se contente de le tenir à la main et l'on fait les coupes comme il a été dit plus haut. Une fois celles-ci portées dans l'alcool, il est facile de les débarrasser de la cire qui les environne en se servant d’aiguilles à dissocier.

3° Enrobage au collodion. — Ce mode de contention des pièces peut être employé dans les mêmes cas que le précédent. Il est encore préférable, lorsqu’on veut faire dans un objet mince ou lamellaire comme l’iris par exemple, des coupes tangentielles ou parallèles à sa surface. Veut-on par exemple faire des coupes parallèles à la surface d’un iris, sans l’inclure dans la paraffine, on prend un bouchon de liège très fin et sans défauts ou un cylindre de moelle de sureau, on le trempe dans l'alcool à 90°, puis sur une de ses extrémités ainsi préalablement imbibée d'alcool, on coule une mince couche de collodion non riciné un peu épais, et sur laquelle on place l'iris à plat. On recouvre ce dernier de nouvelles couches de collodion qu’on laisse un peu évaporer; pour éviter tout déplacement on fait couler quelques gouttes de chloroforme sur la surface collodionnée qui se prend en masse, et on peut ensuite achever le durcissement en portant le tout dans du chloroforme. Au bout d’une heure ou deux le collodion est devenu solide et adhère parfaitement à son support, et on peut couper le tout soit à la main, soit au micro-

tome de Ranvier avec le rasoir mouillé d'alcool à 90°. Les coupes sont reçues dans l’alcool à 90°, le collodion ne gêne pas pour leur étude. On pourrait d’ailleurs le dissoudre par l’essence de girofle après déshydratation absolue de la pièce.

Les coupes obtenues par les moyens que nous venons de décrire sont toujours reçues dans de l’alcool à 90°; au sortir de ce liquide elles devront subir des traitements variables suivant le mode de coloration que l’on voudra appliquer, et qui seront indiqués à propos des colorations ; cependant les coupes laites après durcissement à la gomme doivent avant toute chose être débarrassées de cette dernière, comme nous allons l’indiquer.

M É T II 0 D E S fi É N Ê II A L E S

4Ù Dégommage et lavage des coupes durcies à la gomme. — On choisit parmi les coupes recueillies dans l’alcool les meilleures, les plus régulières; on les prend avec une spatule large, on fait égoutter l’alcool qui reste sur la spatule, et on transporte enfin la coupe dans un cristallisoir plein d’eau froide ou mieux tiède, 40°, ce qui active l’opération.

Le transport des coupes dans l'eau demande quelques précautions. Si en effet on se contente de les y porter directement, comme elles sont imbibées d’alcool fort, il se produit au contact de l’eau une diffusion énergique qui imprime à la coupe un tournoiement rapide. Ce mouvement n’a pas de grands inconvénients lorsque la coupe est homogène et constituée par des parties bien liées entre elles, mais il est désastreux lorsque la coupe est hétérogène et renferme des éléments libres, tels que les globules blancs ou les globules rouges, parce que ces derniers sont généralement entraînés hors de la, coupe ; de même la tige d'un poil placée dans l’épaisseur du derme est généralement arrachée de sa gaine qui reste vide, etc. Pour éviter cet inconvénient, il est bon de souffler un peu sur les coupes retirées de l’alcool et portées sur la spatule. La vapeur de l'haleine se précipite sur l'alcool et l’hydrate peu à peu, si bien que lorsqu’on porte la coupe dans l’eau, la diffusion est beaucoup moins énergique et n’entraîne pas de mouvements giratoires. En outre, dans le cas où l’emploi du procédé de l’haleine serait insuffisant, ou trop pénible (si l’on avait par exemple beaucoup de coupes), on arriverait au même résultat en passant ces dernières dans des alcools de degrés décroissants, 70, 30°, avant de les mettre dans l’eau.

Au fur et à mesure que l'eau imbibe la coupe, celle-ci se gonfle, la gomme se dissout peu à peu et finalement la coupe tombe au fond du cristallisoir où on peut la recueillir pour la colorer et la monter. La disparition complète de la gomme s’effectue en quelques heures, on peut l’activer en changeant l’eau du cristallisoir et en employant l'eau tiède. Lorsque les pièces durcies à la gomme ont dû passer auparavant par

GOT'PES HISTOLOGIQUES

l'acide picrique, elles abandonnent la couleur jaune qu’elles devaient à ce réactif en meme temps qu’elles se dégomment, cl lorsqu’elles tombent au fond du cristallisoir, elles sont devenues blanchâtres et sont prêtes pour les colorations ultérieures.

5" Manière de recueillir les coupes dans un liquide. —

Nous avons souvent parlé de prendre les coupes dans un liquide, voici comment il faut procéder: On plonge dans le liquide où

Fig. 51.

Manière de prendre une coupe dans un liquide.

elles se trouvent une lame de verre porte-objet parfaitement propre et que l'on tient obliquement. A l’aide d'une aiguille à dissocier plongée dans le liquide, on fait flotter une coupe et on l’amène sur la face supérieure du porte-objet. On la fixe sui ce dernier en la maintenant appliquée contre lui à l’aide de ta pointe de l’aiguille placée à l’une de ses extrémités, et tenant toujours l'aiguille en place, on retire doucement la lame en lui conservant la même obliquité et en faisant attention que le mouvement imprimé à la lame tende a etaler parfaitement la coupe sur cette dernière, ce qui est tiès facile. On retire enfin complètement le porte-objet du liquide, et la coupe est parfaitement étalée. Si elle ne l’est pas, en la replongeant partiellement dans le liquide avec e porte-objet et en s’aidant de l’aiguille, on achève de l’étaler convenablement. On procède de même si, au lieu d’une lame.

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on emploie une spatule, le moyen de réussir à étaler consiste à retirer obliquement du liquide la lame sur laquelle on place la coupe.

§ — Coupes aux microtomes a paraffine

Les coupes à la paralïine peuvent se faire avec n'importe quel microtome, mais comme le plus souvent on désire obtenir ces coupes en séries ininterrompues, on se sert pour cela des microtomes automatiques tels que ceux de Dumaige ou de Minot, qui permettent d’obtenir de longs rubans de coupes, dans lesquels les différentes sections sont soudées les unes aux autres et régulièrement disposées, sans qu’il en manque une seule. .Nous décrirons donc la manière de faire des coupes avec le microlome de Minot, nous réservant d’indiquer à propos du microtome à plan incliné comment on peut l’employer pour les coupes à la paraffine. Du reste, lorsqu’on sait faire un ruban de coupes, on sait à fortiori faire une coupe isolée.

(.es coupes faites après inclusion à la paraffine sont très minces, elles ne peuvent être longtemps abandonnées à ellesmêmes, et il faut aussitôt qu’elles sont faites les mettre sur le porte-objet et les y fixer de telle manière qu’elles ne puissent plus être dérangées ultérieurement (collage des coupes), enfin il importe, une fois collées, de les débarrasser de la paraffine qui les imprègne. Nous étudierons donc successivement: lu la manière de faire un ruban de coupes ; 2° le collage des coupes; 3° l’extraction de la paraffine.

1° Manière de faire un ruban de coupes. — Le bloc de paraffine est d’abord fixé sur le support à ce destiné ; pour cela on chauffe légèrement ce dernier et on y applique une face du bloc qui entre en fusion et adhère fortement à lui après le refroidissement, à cause du système de rayures dont il est pourvu. 11 faut avoir bien soin de ne pas trop chauffer le support pour éviter de fondre trop et inégalement le bloc de paralïine et pour tâcher de conserver autant que possible la surface d’implantation du bloc parallèle à la face qui a été

appliquée sur le support. Eu effet, on sait que l'orientation de la pièce est fixe par rapport aux faces du bloc de parafïine et permet de diriger les coupes dans un sens parfaitement déterminé, il faut donc que la surface qui sert de base soit parfaitement perpendiculaire aux autres. Le moindre changement de direction résultant d’une fusion inégale de la base

d’implantation entraînerait une obliquité très gênante. Pour bâter la fixation du bloc sur le support et éviter la fusion, on peut d'ailleurs refroidir le tout dans l’eau.

Ceci fait, avec un scalpel bien tranchant on enlève l'excédant de la paraffine qui entoure la pièce, en ayant soin de laisser toujours autour de cette dernière une bordure de paraffine d’un millimètre d’épaisseur au moins. Le mieux est de couper la paraffine de manière que la surface de section présentée au rasoir soit un rectangle parfait, ce qui est très important pour la formation du ruban.

On place alors le support du bloc dans la pièce destinée à le maintenir, et qui est mobile dans les trois directions de l’espace. On manœuvre cette pièce de façon que la surface de section du bloc soit parfaitement parallèle au fil du rasoir (il est bien entendu que cette surface de section est représentée par une face du bloc de paraffine, parfaitement plane ellemême , et que la pièce est orientée convenablement par rapport à cette face). Le bloc est avancé ou reculé, à l’aide de la vis, de telle manière que le rasoir entame très peu sa surface, car on doit absolument éviter pour affranchir la pièce, de faire des coupes trop épaisses (1 /2 millimètre par exemple), parce qu’on risquerait de décoller le bloc du support ou de le casser. La section du bloc doit se présenter au tranchant du rasoir par un des grands côtés du rectangle, jamais par un angle. Toutes les vis de la pièce mobile doivent être serrées à fond pour éviter des déplacements dans le cours du travail. On met le régulateur sur le chiffre choisi pour donner aux coupes l'épaisseur voulue 1, 2, 3, etc., etc., et on met en mouvement l'appareil. Une première coupe est faite, elle reste adhérente au fil du rasoir. On continue d’un mouvement régulier et de nouvelles coupes s’ajoutent à la première en se

planant a sa suite; en effet lorsque le bord inférieur d’une coupe vient au contact du bord supérieur de celle qui a été laite avant elle, il se soude avec lui, la nouvelle coupe repousse 1 ancienne, et ainsi de suite, de telle sorte que toutes les sections disposées en ligne et soudées entre elles forment un ruban comparable à un tænia.

On comprend maintenant pourquoi il faut que les bords du

bloc parallèles au tranchant du rasoir soient aussi parfaitement parallèles entre eux. S'ils ne le sont pas, les coupes en se soudant les unes aux autres forment un ruban non plus droit mais courbe, dont la concavité est tournée du côté le plus étroit de la surface de section, comme le montre la figure ci-jointe. Il est facile de remédier a. cela en enlevant un peu de paraffine du côté le plus large. On reçoit le ruban de coupes sur un morceau de carton, lorsqu’il est achevé on le découpe en fragments de dimensions appropriées aux porte-objets et aux lamelles dont on se servira pour faire les préparations, et pour cela on procède comme il est dit dans le paragraphe suivant.

2° Collage des coupes. — Toute la valeur d'une série de coupes résille dans ce que celles-ci sont régulièrement rangées sur le porte-objet dans l’ordre même où elles ont été faites, puisque, en suivant cet ordre, on peut reconstituer l’animal ou l'organe entier. 11 importe donc absolument qu’elles ne puissent plus abandonner leur place, être dérangées, une fois qu’elles ont été mises sur le porte-objet. Pour atteindre ce but on les colle sur ce dernier avec le mélange d’albumine indiqué page 70. Sur la surface des porte-objets bien nettoyés et très propres, on étend une couche aussi mince

Rubans de coupes.

que possible de ce mélange, en se servant d'une baguette de verre promenée horizontalement; on met ensuite sur le porteobjet un peu d’eau distillée, sur laquelle on transporte les fragments de ruban. Si la pièce est volumineuse, on 11e peut guère mettre sur le porte-objet qu’un seul fragment de ruban comprenant 2 à 5 coupes au maximum. Si au contraire elle est très petite (embryon) on peut y placer plusieurs fragments disposés les uns au-dessus des autres comme les lignes d'un livre. Le nombre des bandes du ruban de coupes ainsi placées sur le porte-objet et leur longueur sont nécessairement en rapport avec la dimension des couvre-objets dont on se sert; avec un peu d’habitude on arrive bien vile à savoir se tirer d’affaire dans chaque cas. Pour ne pas dépasser les dimensions du couvre-objet choisi il faut se rappeler que les coupes sont toujours un peu plissées lorsqu'elles viennent d’être faites, qu’elles occupent par suite tout d’abord moins de place, et que le ruban en s’étalant s'allonge un peu. Beaucoup d'histologistes font d’abord un très long ruban de coupes et le divisent ensuite en fragments de dimensions appropriées. Cette méthode offre plusieurs avantages, et en particulier celui de donner des coupes d’une épaisseur très régulière, mais elle présente les inconvénients suivants : parfois le ruban de coupes est enlevé par le moindre souille, parfois aussi il peut être retourné, et il en résulte des erreurs dans l’ordre des coupes ; aussi peut-011 faire des rubans courts, comprenant de 5 à 10 coupes, suivant leurs dimensions, et les transporter directement sur le porte-objet. Pour cela, on saisit le ruban par son extrémité inférieure à l'aide de pinces lines, puis glissant un pinceau très lin sous la dernière coupe adhérente au rasoir, on l’en détache, et le ruban ainsi soutenu par les pinces et par le pinceau est porté sur la lame recouverte d'eau distillée.

Si l'on doit mettre plusieurs rangées de coupes sur la même lame, on place le premier ruban près du bord antérieur de celle-ci, on met le second au-dessous du premier et ainsi de suite en les rangeant le plus régulièrement possible. Ces rubans flottent sur l’eau. Placés au contact les uns des autres, ils n’ont guère de tendance à se déranger, néanmoins il faut

faire grande attention à éviter tout déplacement dans leur ordre, ce qui pourrait causer des erreurs graves dans la lecture des coupes. Lorsque le porte objet a reçu la quantité de coupes

Fig. 53.

Manière d’enlever le ruban de coupes.

qu’il doit avoir, on le numérote avec un diamant dans le coin supérieur droit, comme la pagination d'un livre au recto. Ce

numéro qui ne peut pas s'effacer indique sa place dans la série.

Le porte-objet toujours recouvert de l’eau sur laquelle llottent les coupes est alors porté sur une plaque chauffante (voy. fig. 54) sous l’extrémité de laquelle brûle une lampe à alcool. L’eau en chauffant déplisse entièrement les coupes qui s’étalent d’une manière parfaite en gardant exactement leur place. Il faut avoir grand soin de ne pas chauffer jusqu’au point de fusion de la paraffine, ce qui gâterait irrémédiablement les préparations.

Les coupes étalées, on enlève l’excès d’eau en se servant d’un linge ou de papier buvard, et en prenant garde de ne pas

Fig. 5L

Plaque chauffante de Malassez,

C 0 U P E S 1 1 1 S T 0 L 0 G HJ U E S

déranger les coupes qui viennent alors reposer directement sur la lame de verre, en restant dans l’ordre où elles étaient. Si pendant ce temps de l’opération elles s’étaient déplacées, on les remettrait en place en faisant arriver au-dessous d’elles une certaine quantité d’eau qui en les soulevant permettrait de les disposer comme il convient à l’aide d’aiguilles ou de pinceaux. On sèche aussi bien que possible les porte-objets (sans toucher aux coupes), puis on les place sur une étuve à 35-40° où l’eau achève de s’évaporer, en même temps que les coupes adhèrent intimement au verre. Lorsque les lames sont bien sèches, on les passe dans une étuve chauffée à 55° au maximum, ce qui amène une adhérence parfaite sur la lame, en coagulant l’albumine. Au bout d'une demi-heure on peut les retirer, la paraffine s’est fondue, et les coupes sont collées d'une manière parfaite. On peut conserver pendant quelques heures les lames ainsi préparées, en ayant soin de les mettre à l’abri de la poussière. Lorsqu’on a recueilli toule la série de coupes se rapportant à un cas donné, on enlève la paraffine qui imprègne encore les sections en se servant du procédé indiqué dans le paragraphe suivant.

3° Extraction de la paraffine. — Les porte objets parfaitement secs et portant les coupes sont placés sur des photophores en bois (voy. p. 51), et on les arrose de quelques gouttes de xylol ou de toluène en se servant d'un ilacon compte-gouttes. On laisse pendant quelques minutes le xylol exercer son action dissolvante sur la paraffine, puis, prenant chaque porte-objet de la main gauche, on fait égoutter le xylol qui le recouvre dans un récipient quelconque pour le jeter plus tard. Tenant le porte-objet bien horizontalement, on fait de nouveau couler sur lui quelques gouttes du dissolvant de la paraffine, et en lui imprimant des mouvements, on fait circuler ce dernier sur toute sa surface de façon à bien la laver. On enlève encore le xylol et on recommence l’opération plusieurs fois de suite de façon à faire disparaître toute trace de paraffine. Le xylol qui sert à ces derniers lavages peut être recueilli pour être employé ultérieurement à différents usages et en