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toxicité. Exner, qui l'avait bien compris, opérait avec des « solutions physiologiques » d’albuminoïdes.

La considération d'isotonie est une condition extrêmement grave. Le tissu tendant à se mettre à l'équilibre avec le liquide qui le baigne. son indice subira une variation du fait de l'hypo ou de l'hypertonicité de ce médium, De sorte qu'étant données les relations existant entre l'indice de réfraction d’une solution et sa pression osmotique, on peut dire que l'indice du tissu est fonction des variations d'indice du liquide d'immersion.

Le point 6 (fig. 15 b) où se produit l'égalité entre les indices de l’objet N, et d’un liquide N, qui n'est pas en équilibre primitif avec lui, à une valeur différente du point a où se produirait cette égalité si le système était dès le début en équilibre osmoti- que. Cette variation est assurément “ TUE 5 peu génante lorsque l'opération est effectuée sur de gros fragments de muscle, qu'elle est menée rapidement et que l'erreur sur le À est minime, elle devient par contre importante lorsque l'objet est très petit, ou que la mesure dépasse une certaine limite de temps. Cette limite d’accommodation évidemment variable est du reste assez restreinte, et pour des cils vibratiles elle peut tomber, si la différence de À est appréciable, à quelques minutes à peine; la chose n’est donc point négligeable.

L'erreur qui peut résulter de ces variations pour l'évaluation de l'indice de l’objet, erreur que nous tenterons de calculer plus loin, est assez difficile à fixer a priori, mais son existence suffit à rendre extrèmement problématique l'emploi de quatrième décimales.

La recherche de la constitution de liquides d'indices donnés et de A connus, problème de physique pure, sera traité isolément dans un des chapitres suivants. Nous utiliserons ici directement, sans autres explications, des liquides préparés suivant les données théoriques de ce chapitre.

Un dernier point nous reste à examiner pour pouvoir appliquer la méthode d'immersion : ce sont les procédés optiques permettant de préciser l'égalité d'indices entre le liquide et l’objet.

Fig. 15 6.

Détermination de l'égalité d'indices entre l’objet et le liquide (!).

Au moment où l'indice du liquide est égal à celui de l’objet, les ondes lumineuses traversent la zone de contact des deux corps avec un minimum de perturbations. En particulier les phénomènes de réflexion et de réfraction disparaissent à la surface de l'objet, et le procédé classique pour déterminer l'égalité d'indices entre l'objet et le liquide consiste à repérer le moment où, de ce fait, l'objet devient invisible au sein du liquide. Malheureusement ce procédé n’est guère applicable que dans des cas exceptionnels. Dès que les pouvoirs dispersifs de l'objet et du liquide ne sont pas identiques, ou bien que l’un ou l'autre est coloré, objet ne disparaît plus dans le liquide au moment de l'égalité d’indices, et l'on en est réduit à chercher un minimum de visibilité de ses contours ; cette opération est fort aléatoire et nécessite de nombreux tätonnements. Aussi les auteurs se sont-ils ingéniés à trouver des procédés permeltant de diagnostiquer cette égalité d'indices sans faire appel à la notion d'invisibilité.

Méthode de Maschke.

Un des premiers, Maschke (1880) signale un procédé fort intéressant, mais qui malheureusement n’est guère plus général que la méthode d'invisibilité. Maschke remarqua que lorsqu'on fait varier d'une manière continue l'indice du liquide où est immergé un objet transparent et incolore, Les parties sombres de celui-°i se nuancent d’une série de teintes assez constantes :

bleu grisâtre + bleu + bleu clair + blanc.

Inversement les parties claires se colorent en : jaune + orangé + brun jaunâtre.

L'égalité d'indices entre le liquide et l'objet correspondrait précisément au moment où la teinte orangée devient brunâtre. Les colora-

tions sont plus vives lorsqu'on met un écran opaque au centre de l'objectif, ne laissant passer que les rayons marginaux. Il s’agit très

4. Nous croyons nécessaire de développer spécialement ce point dont diverses indications seront utilisées dans les chapitres suivants (lumière polarisée, etc }.

probablement là d’un phénomène d’aberration chromatique déterminé par l’objet.

Maschke employait comme liquides d'immersion des mélanges d’eau et de glycérine, ou d'huiles d'amandes et de cassia ; il pensait pouvoir atteindre la déuxième décimale de l'indice.

On peut faire à la méthode de Maschke la même objection qu’à la iiéthode d'invisibilité, les moindres variations de dispersion ou d’absorption doivent la rendre impraticable. Avec un objet qui ne serait point incolore, les téintes risqueraient de devenir fort différentes de célles qu'indique l'auteur. Cette méthode qui peut être utile dans des cas particuliers, manque donc également de généralisation.

Méthodes de pénombre, procédé Schræder van der Kolk.

Un groupe de techniques beaucoup plus importantes est fondé sur les déplacements des zdnes de pénombre.

Lorsqu'on examine dans une préparation au microscope, avec un faisceau lumineux centré, la limite de contact d'une substance transparente À incluse dans üne autre B d'indice différent, on aperçoit cette limite sous la forme d’une mince ligne de contour obscure plus ou moins nette.

Si l’on remplace le faisceau lumineux centré par un faisceau oblique, on constate que la ligne s'étale dans le corps A sous forme d’une petite

Fig. 16. -- Limite du contact des deux substances d'indices différents. 4° Lumière centrée; 2 Lumière oblique Na << N8 ; 3° Même lumière, Na > Ns.

frange de pénombre ; mais cèt étalément ne se produit que sur wn seul côlé du corps À (nous verrons tout à l'heure sur lequel) ; Pautre côté paraît le plus souvent au contraire plus clair, plus lumineux que précé-

demment. Les choses réstant en l’état, c’est-à-dire /a direction de l'éclairage restant constante ainsi que la hauteur dé la misé au point du microscope et la position de la limite des deux corps, lorsque l’on fait varier l'indice de réfraction de l’un des corps B depuis une valeur plus petite que l'indice de l'autre corps À jusqu’à une valeur plus grande, on s'aperçoit que la petite frange de pénombre changé de côté dans le corps À par rapport à la limite de séparation à parlir du moment précis où les deux indices passent par l'égalité (fig. 16).

Tant que l'indice N, << N, la zone de pénombre est par exemple, dans le côté droit du corps A, dés que N; devient < N, cette zone obscure passe dans le côté gauche de A, tandis que l’ancienne zone lumineuse gauche de A, s’il en avait, passe à droite ou disparaît. — // y a inversion des zones de pénombre et de lumière dans l’objet A.

Ce fait extrêmement important et que nous étudierons plus loin en

Fig. 47. — Schéma du phénomène Schræder dans le cas d’un objet o d'indice n plongé dans un milieu #’. L'objectif du microscope 0b7. est représenté par sa lentille frontale, et le champ oculaire ch. oc. est supposé rabattu sur le plan du tableau.

K direction de la lumière incidente centrée. I. n > n'. IL n < n'.

détail, permet dé déterminer avec uné précision assez grandé l'égalité

d'indices des deux substances en contact; et en particulier d'un corps et de son médium d'immersion. On conçoit donc tout son intérêt vis-àvis de la mesure des indices.

Une théorie élémentaire de ce phénomène a été donnée par Duparc et Pearce (1908).

Le contour obscur d’un objet transparent immergé dans un liquide d'indice différent du sien, et éclairé par des rayons lumineux centrés sur l’axe optique du microscope, résulte de ce que les bords de l’objet agissent grosso modo sur les faisceaux lumineux comme un système optique convergent ou divergent (convergent si l'objet est plus réfringent que le liquide, divergent s’il l'est moins) ; et de ce que la portion extrême des rayons marginaux issus des bords de l’objet ne peut pas pénétrer dans l'objectif, parce qu'elle converge trop (dans le premier Cas (fig. 17, 1) ou diverge trop (dans le second cas fig. 17, 11). D'où une région obscure correspondant à ces rayons éliminés du champ de l'objectif.

Si, au lieu d'éclairer l’objet par de la lumière centrée, nous l’éclairons par de la lumière oblique, nous allons, en faisant ainsi basculer

Fig. 48. — Même phénomène lumière oblique.

D n' ; : ; . ee inf Pre quid , IV. n <n'; M, diaphragme ; K. lumière incidente

tout le système de rayons lumineux par rapport à l’axe du microscope, récupérer dans l'objectif, d’un côté de l’objet, une partie des rayons

précédemment éliminés ; et de l’autre côté de l’objet au contraire, augmenter la portion éliminée. La mince bordure noire qui entourait l’objet uniformément dans le cas de la lumière centrée va être remplacée par une zone obscure plus large, unilatérale, empiétant d'autant plus sur l’objet que la lumière sera plus oblique.

Le faisceau marginal récupéré (fig. 18) sera pour le système convergent

Fig. 19, — Phénomène Schræder.

En haut : fragments de verre (n —1,52) dans 1,60 et 1,33, diaphragme venant de la gauche {il faut noter que l'image obtenue sur la plaque microphotographique est droite par rapport à l’objet, et non inversée comme celle observée directement à l’oculaire).

En bas, phénomène Schrœder sur des fibres musculaires plongées dans un liquide d’iodice inférieur, diaphragme venant du bas.

le faisceaux de rayons issus du côté opposé à celui d’où vient la lumière,

dans le cas de la divergence ce sera au contraire le faisceau issu du côté de la lumière incidente qui sera récupéré. Nous aurons donc, en lumière oblique, dans le premier cas (objet plus réfringent que le liquide agissant comme convergent) une zône obscure occupant seulement le bord de l’objet du côté d’où vient la lumière; dans le second cas (objet moins réfringent, donc divergent) la zûne obscure sera du côté opposé à celui d’où vient la lumière.

Les indications pratiques qui résultent de ces considérations sont très simples; on peut facilement produire l'éclairage oblique en glissant sous la platine du microscope une feuille de carton qui intercepte la moitié du faisceau incident, ou même, plus simplement, en promenant le bout du doigt entre la source et le miroir du microscope (Schræder van der Kolk, 1892). En tenant compte du renversement des images produit par le microscope, on peut énoncer les deux règles ci-dessous :

4° L'objet est plus réfringent que Île liquide si la bordure d'ombre apparaît dans l’objet du côté où l’on introduit le diaphragme.

> L'objet est moins réfringent que le liquide si l'ombre apparaît dans l'objet du côté opposé à celui où l’on introduit le diaphragme.

Il suffit donc, pour déterminer l'égalité d'indices entre les liquides et l'objet, d’obsérver en lumière oblique le moment où la zône d'ombre passe d'un côté de l'objet à l’autre. Ce procédé, extrêmement utile, permet d’avoir des renseignements, même si l'objet ou le liquide sont colorés. La détermination peut être faite, par un observateur exercé, de façon à obtenir la 3° décimale et même quelquefois une approximation sur la 4°; c’est dire que le procédé est assez précis.

Indications pratiques — Voici quelques indications pratiques pour l’emploi du procédé Schræder.

On doit opérer cette mésure en lumière naturelle convergente (polariseur enlevé si l’on se sert d’un microscope polarisant) de préférence la lumière du jour, ou la lumière d’un arc diffusée par un écran en verre dépoli ; lumière blanche où monochromatisée, bien entendu, suivant la précision recherchée.

Il est bon de supprimer le condensateur, celui-ci pouvant introduire des causes d'erreurs assez gèénantes : il est le plus souvent impossible, par suite de la construction même des microscopes, de glisser la feuille de carton servant de diaphragme entre le condensateur et la platine. Si, d'autre part, on la glisse en dessous du condensateur (entre le miroir et celui-ci) on est forcé de tenir compte très rigoureusement de la position du foyer du condensateur par rapport à la préparation. En effet on conçoit facilement que, par suite du croisement des rayons lumineux à ce foyer, l'ombre du diaphragme sur la préparation s'inversera suivant que cette préparation se trouvera dans la nappe du cône lumineux située entre le condensateur et son foyer, ou dans la nappe située au delà de ce foyer (fig. 20).

Une telle disposition nécessite l’immobilisation du condensateur dans une position nettement repérée. Il est plus simple pour éviter toute incertitude

Fig. 20. — Action du condensateur sur le phénomène Schræder.

19 Diaphragme # sous le condensateur Cond., le foyer de celui-ci étant au-dessus de la préparation ; l’ombre sur la préparation est du même côté que le diaphragme.

2° Diaphragme sous le condensateur, le foyer de celui-ci étant au-dessous de la préparation ; l’ombre sur la préparation est du côté opposé au diaphragme. 0bÿ, objectif; ch.oc, champ oculaire rabattu ; Prép., préparation.

d'enlever le condensateur. Je recommanderai pour ces mesures, l’emploi d'objectifs faibles (par exemple, un no 3 de Nachet) : les zônes de pénombre sont beaucoup plus nettes. Quelques constructeurs fournissent pour le Schræder des diaphragmes spéciaux coulissant dans une douille de la monture du condensateur. A la rigueur,un simple carton tenu à la main est suffisant dans la plupart des cas ; il est très facile en outre à chacun de fabriquer un diaphragme rotatif, analogue à celui que représente la figure 21 par exemple:

il est composé d’un des valets V du microscope pouvant pivoter dans son trou, et à l'extrémité duquel est reliée par un fil métallique courbe /, une lame de zine Z glissant sous la platine PL.

Tout Je système tourne par une simple Fig. 21. — Diaphragme pour pression du doigt sur le valet, au- le Schrædér

tour de l’axe de celui-ci. L'avantage d’un pareil diaphragme est qu'on peut régler sa hauteur une fois pour toutes, et qu'il peut s’'employer indifféremment sur les deux côtés de l’objet.

Au lieu d’intercepter, comme dans les expériences précédentes, une moitié du cône lumineux allant du miroir à la préparation, c'est à-dire

Fig. 22. — Schéma du phénomène Schræder, le diaphragme étant au niveau de la pupille d’émergence.

4 Objet fonctionnant comme convergent (n > n’); le diaphragme Diaphr. intercepte les rayons marginaux tels que b issus de l’objet et augmente la pénombre du côté d;

2 Objet fonctionnant comme divergent (n <Z n'): le diaphragme intercepte les rayons marginaux tels que b issus de l’objet et augmente la pénombre du côté d; a.oc, anneau oculaire ; P, préparation:

le faisceau incident, il est évident qu’on peut intercepter avec un résultat analogue une moitié du cône d'émergence (fig. 22).

C'est la base de la méthode employée par Exner (1887) antérieurement aux indications données par Schrœæder. Le microréfractomètre d’Exner est fondamentalement un diaphragme mobile placé au niveau de la pupille d'émergence du microscope (au-dessus de l’oculaire) et pouvant masquer une partie du faisceau émergent.

Ce dispositif est réalisé au moyen d'une douille s’emboîtant au-dessus de l'oculaire du microscope, et portant un diaphragme asymétrique mobile sous l'effet d’un bouton de serrage ; on réalise la coïncidence du diaphragme avec la pupille d'émergence en relevant plus ou moins la douille jusqu’à la disparition du cercle coloré qui limite les bords du champ : en somme, en cherchant la position du maximum achromatique qui est une des caractéristiques de la pupille d'émergence.

À la rigueur, el en se basant sur le raisonnement précédent, il nous a été possible d'observer le phénomène Schræder sans aucun diaphragme mobile. I suffit d’incliner l’œil, au niveau de l'oculaire, de façon à ce qu'il ne reçoive plus les rayons centraux, mais uniquement les faisceaux marginaux d'un seul côté.

C'est, simplifié mais moins commode, le procédé Exner, la théorie en est la même. Il y a élimination dans l’un et l'autre cas, d’une partie des faisceaux marginaux

Méthode des franges de Becke (!)

La méthode Schrœder est fondée sur les modifications du contour de l’objet lorsque l’on rend la lumière oblique : une autre méthode décrite pour la première fois par Becke, est basée sur les modifications de ce même contour lorsque l’on change la position du plan focal antérieur du microscope, c'est-à-dire lorsqu'on fait varier la mise au point de cet instrument (2).

Quand, après avoir mis au point la limite de séparation des deux corps d'indices différents, on dérègle légèrement cette mise au point, on constate qu'il se forme une frange lumineuse bordant la région du contour, et d'autant plus large que la mise au point est plus déréglée. Cette frange bianche apparaît, si la mise au point est faite au-dessus de l’objet (c’est-à-dire si le tube du microscope est relevé), du côté du corps le plus réfringent; au contraire, si la mise au point est au-dessous de l’objet, la frange se trouve du côté du corps le moins réfringent. (PI. TL, 1).

La frange blanche de Becke est nettement visible en lumière centrée, convergente, et de préférence avec un objectif à foyer court. À mesure que la mise au point se dérègle, la frange diminue bien entendu d’in tensité, et devient de moins en moins visible.

On conçoit l'intérêt de cette remarque pour la mesure des indices par immersion : au passage par l’égalité d'indices entre la pièce et le

1. Un cas particulier de ces phénomènes a élé inscrit avec force détails bien avant le travail de Becke : c’est l’aspect des bulles d’air dans les préparations, aspect dont les modifications avec la mise au point ont préoccupé depuis longtemps les micrographes.

Je renvoie sans insister aux descriptions de Dujardin, Traité du microscope; de Ranvier, Traité; de Nægeli et Schwendener, Das Mikrokop, el à l'excellent chapitre de Carnoy dans sa Cytologie générale : on ÿ verra un résumé des ébauches d'explications théoriques de ces aspects basées sur la réfraction, la réflexion totale ou même la diffraction.

2 Cf. Duparc et Pearce, Traité,

médium, opposé de la limite de séparation.

la frange disparaîtra, pour reparaître ensuite sur le bord

La théorie de la frange de Becke s'appuie sur les phénomènes de

réflexion totale.

Une partie des rayons convergents envoyés par le condensateur sur la

surface de séparation OB (fig.

| | 3 4 d Fig. 23.

Répartition des divers pinceaux lumineux 1, 2, 3... atteignant sous des

incidents variables, la limite de deux milieux d'indices différents (ni >> n).

23) subit la réflexion totale sur cette sur-

face; or, l'angle AOB qui contientles pinceaux lumineux réfléchistotalement (et qui représente le complément de la limite de réflexion totale pour le corps considéré) est situé entièrement du côté le plus réfringent de la limite, les rayons ayant pénétré par le corps le moins réfringent ne subissant pas de réflexion totale sur la surface OB. L'angle AOB contiendra donc, outre les pinceaux qui lui parviennent directement du condensateur, tous ceux tels que 2 et # (fig. 23) qui n'auront pas pu pénétrer dans le milieu », ; l'intensité

lumineuse de cette région AOB sera donc supérieure à celle du reste de la préparation, et en particulier, comme il est facile de le montrer en étudiant la répartition des divers faisceaux lumineux composant le cène de lumière convergente, le bord OA sera la région la plus lumineuse : c’est à ce niveau qu'arrivent également les rayons tels que Z ayant atteint la limite OB dans le corps », sous l'incidence rasante.

En relevant la mise au point du microscope, le plan focal de celui-ci découpe dans le dièdre AOB des sections de plus en plus grandes : d’où l'élargissement asymétrique de la frange à l’intérieur du corps le plus réfringent.

Il ressort de la théorie élémentaire qu'au lieu de lumière centrée, on peut employer pour le phénomène de Becke de la lumière oblique (Dupare et Pearce) tout comme pour le Schræder ; la frange y gagne en netteté dans beaucoup de cas; à ce propos, toutes les considérations indiquées plus haut pour le Schrœder peuvent être répétées ici : emploi du diagramme mobile sous la platine ou à la pupille d'émergence ; rapports entre le côté de la frange lumineuse et le côté d’introduction du diaphragme (fig. 24), etc.

En tenant compte du renversement des images, on déduit facilement de la théorie une indication analogue à celle du cas précédent :

É n,)1 “Es n; La

Fig. 24. — Frange de Becke en lumière oblique.

F, frange ; D, diaphragme ; »,, n,, indices des corps en présence.

L'objet est plus réfringent que le liquide si la frange de Becke supérieure apparait au côté de l'objet opposé à celui où l'on introduit le diaphragme, et inversement.

Mesures d'indices de quelques fibres musculaires par la méthode d'immersion (1).

1° Liquide d'immersion : solution de blanc d’œuf ramenée à A — 2,08 d'indice maximum »#, = 1,402. Les indices inférieurs à #, sont obtenus par mélange avec de l’eau de mer.

a) Portion striée de l'adducteur de Pecten maximus :

Indice mesuré : 1, 40 (2) > n > 1,40 (6).

Un fragment du même muscle, examiné au réfractomètre Abbe, donne :

22 Pibres /fradinlan d'incidence, , 5% n' = 13 = 12! Fibres Lau plan d'incidence. ., , #"— 1,372 L'indice par immersion est donc nettement supérieur : l'indice élémentaire de la fibre, comme nous l'avons dit plus haut, n’est donc pas seul à intervenir dans l'indice global du bloc musculaire. b) Portion lisse du même adducteur : les fibres, par immersion, se montrent nettement supérieures à l’indice maximum 1,402 du liquide.

1. Les liquides d'immersion ont été composés d'après les considérations théoriques établies dans le chapitre suivant. Les mesures d'indices des liquides ont été prises à l’'Abbe pour Nan — 589 ; celles des muscles, en lumière blanche (arc au charbon) simultanément au moyen des phénomènes Schræder et Becke.