CHAPITRE PREMIER

Images ultra-violettes de fibres musculaires striées

IL. Considérations théoriques. — On sait tous les avantages que la microscopie peut retirer de l’emploi des radiations à courtes longueurs d’onde. D'après l'expression classique (Abbe, Lord Rayleigh) qui explicite le pouvoir séparateur d’un instrument d’optique en fonction des principales caractéristiques du système, on a :

e> Be mo2réin à e étant la distance limite de séparation de deux points, } la longueur d’onde, n l'indice de réfraction du milieu supposé homogène réunissant l'objectif à l'objet, et « le demi-angle d’ouverture de l'objectif, — quantité e qu'il ya évidemment intérêtà rendrela plus petite possible; cette condition aboutit à augmenter l'ouverture numérique (n sin «) de l'objectif, et à diminuer la longueur d'onde employée. Du premier point dérivent, comme on le sait, les objectifs à immersion homogène ‘entrés maintenant dans la pratique courante, du second proviennent les importantes recherches de Kôhler (1904) sur l'établissement d’une technique de microscopie ultra-violette.

Je n'insiste point sur ces faits, aujourd’hui classiques, et je me

contente de renvoyer le lecteur désireux de trouver une revue d’ensemble sur la question de la microscopie ultra-violette, aux mémoires de Kôhler et à l'ouvrage de Cotton et Mouton (1906).

Je me contenterai de faire remarquer-combien rares ont été jusqu'ici les applications histologiques de la méthode de Kôhler : le nombre des publications à ce sujet est excessivement, restreint. Cette rareté tient évidemment à des causes multiples : le prix élevé des appareils, du matériel de travail, et des frais courants, l'obligation d'utiliser la photographie pour les observations, technique dont les difficultés et les longueurs dans ce cas particulier n'encouragent peut-être point les histologistes. Probablement faut-il ajouter aussi les difficultés d'interprétations des résultats, difficultés qui, comme nous allons le voir, ne sont pas négligeables (1).

Dans le cas général d'un objet microscopique quelconque, l'emploi de l’ultra-violet a donc pour effet de reculer la limite inférieure de dimensions au delà de laquelle la forme et la structure de l'objet commencent à n'avoir plus de rapport avec les caractéristiques de l’image qu’on en obtient : en somme, de permettre de préciser à une approximation supérieure la structure géométrique de l'objet. Dans le sujet qui nous intéresse ici, la fibre musculaire striée, ces avantages prennent un intérêt très spécial : nous nous trouvons en effet dans un cas tout à fait particulier de la formation interférentielle des images, du fait que l’objet a une structure périodique ; la relation entre la structure réelle de l'objet et l’image devient alors particulièrement complexe. Il est à remarquer que la fibre musculaire striée possède à la fois une périodicité longitudinale (stries variées décrites par les auteurs) et une périodicité transversale (fibrillation), ce qui n’est pas fait pour simplifier le problème : c'est peut-être un des moins résolubles des matériaux Cytologiques, en ce sens que c’est un de ceux dont les conditions favorisent au maximum les phénomènes interférentiels. L'ultra-viotet reculant la limite, pourrait permettre jusqu’à un certain point de se rendre compte si certaines des grosses stries visibles en lumière ordinaire sont ou non immédiatement décomposables en groupes d’autres stries un peu plus fines, comme on a pu le penser & priori d’après les nombreux éléments

4. À titre d'indication de bibliographie générale pour l’histologie en lumière ultra-violette, je signalerai, outre les travaux de Kôhler lui-même (1904) (où sont indiqués et figurés divers points très intéressants), et nos propres notes préliminaires (1909), les travaux de Dieck (1906) sur le tissu osseux ; ceux de Grawitz et Gruneberg (1906) sur le sang ; enfin celui de

Meigs (1908) sur la fibre musculaire, mémoire sur lequel nous reviendrons tout à l'heure.

dits accessoires (N et ses composés, stries de Tourneux, M etc.) que les auteurs ont décrits dans divers types de muscles ; ét si d'autre part la périodicité transversale montre également des harmoniques de plus en plus petites, comme le suppose la théorie d'Héidenhain.

A un point de vue plus général, les radiations courtes pourraient donner en outre la possibilité de confirmer ou d'éliminer l'hypothèse que certains détails de la préparation n'ont pas d'existence figurée, mais sont de simples stries d’interférence : un contrôle de la réalité de ces détails dérivant évidemment du fait que dans des comparaisons du même objet en lumière ordinaire et en lumière ultra-violette, leurs images se montrent de dimensions indépendantes de la longueur d'onde employée. -

En dernier lieu, un point tout à fait intéressant résulte de ce que les radiations employées dans le dispositif Kühler (que nous avons utilisé) sont Cd 17 (275) ou Mg (280), raies qui coïncident avec les bandes générales d'absorption des albuminoïdes (292-262 Dhéré), il serait donc possible de retirer des résultats quelques renseignements complétant nos études précédentes sur l’absorption et sur la localisation de divers éléments de la fibre. Ces indications sont à notre point de vue beaucoup plus importantes que des différenciations de détails.

Malheureusement, comme nous le verrons, à côté de ces avantages incontestables se trouvent divers désavantages qui rendent l'interprétation des faits extrêmement délicate et empêchent peut-être de tirer de cette intéressante méthode tout le bénéfice qu’on en pourrait espérer.

II. Technique.— Nous avons eu l’heureuse chance de pouvoir utiliser au Collège de France l'installation complète de microscopie ultraviolette éditée par la maison Zeiss d’après Kühler et von Rohr, beau dispositif que M. le professeur F. Franck a eu la très grande complaisance de mettre à notre disposition dans son laboratoire; qu'il nous soit permis de lui en exprimer ici notre très sincère reconnaissance. Les documents de ce travail ont été recueillis en collaboration avec Mlle Chevroton, préparateur au Laboratoire, dont la compétence photographique est bien connue, et à l’extrème obligeance de qui Je me plais à rendre hommage.

L'appareil utilisé étant exactement celui déjà décrit par Kôhler, nous en résumerons très rapidement la description, et nous n'insisterons que sur les détails de technique nouveaux que nous avons été amenés à introduire dans les manipulations.

a) Source. — La source est l’étincelle d’un excitateur à électrodes de Mg ou de Cd, en dérivation sur une batterie de huit condensateurs

de capacité totale de0,016 Mfds. L'ensemble est alimenté par le circuit d’un transformateur fournissant de l’alternatif de 8.000 volts sur 2 à 5 ampères.

b) Sélection des radiations. — Les rayons issus de la source sont repris par un collimateur à lentille de quartz, qui les envoie sur un train de prismes, également en quartz, dispersant le faisceau : en somme cette partie de l'appareil est un monochromateur analogue à ceux utilisés usuellement, mais à pièces de quartz. Tout cet ensemble est disposé dans un plan horizontal. La radiation monochromatique choisie (Mg 280 ou Cd 275) et repérée au moyen d’un écran fluorescent, est reprise par une dernière lentille qui fournit une image réelle de la source pour ce ?, et finalement redressée verticalement par un prisme à réflexion totale qui l'envoie dans le condensateur du microscope.

c) Microscope. — Tous les systèmes optiques du microscope, bien entendu, sont en quartz. Nous avons employé le condensateur à trois lentilles, l'objectif à immersion ayant 2 mm. 5 de distance focale, d'ouverture numérique 0,85, ce qui fait un pouvoir résolvant, relativement à l’objectif à sec parfait, de 1,70; je rappelle que ce rapport est celui des valeurs-limites de séparation e& et ex de l'objectif à sec idéal d’une part, d'ouverture numérique NOÇ = 1 fonctionnant avec X = 576 environ, et d’autre part de l'objectif étudié fonctionnant à A et d'ouverture NO,, soit par conséquent :

€o X0N Êe Ex Æ XxNOo »

dans le cas présent — 1510

Pour les objectifs à immersion homogène ordinaire, d'ouverture 1,30, le même rapport serait par exemple :

En conséquence le rapport des valeurs-limites de séparation entre notre objectif à ultra-violet de 0,85 et un objectif à immersion homogène de 1,30 serait :

ce qui signifie que l'objectif en quartz pourrait théoriquement séparer

des détails 1,3 fois linéairement plus petits qu'un objectif à immersion ordinaire dans les conditions usuelles.

Le liquide à immersion est une solution à base de glycérine d’indice N5 = 1,456. D'autre part, le quartz fondu que l’on emploie pour les objectifs, les oculaires et les lames à préparation, a, d'après Trommsdorff, des indices N, — 1,458 et N,,, = 1,496 : la solution glycérinée préconisée par Kühler a probablement une dispersion sensiblement analogue. L’immersion est bien entendu, réalisée à la fois entre le condensateur et la préparation, celle-ci et l'objectif, et le même liquide à immersion est employé pour le montage de la préparation entre ses deux lamelles de quartz amorphe ou de verre UV.

Nous avons employé les deux oculaires à projection n° 7 et n° 10 qui donnent une image réelle de la préparation sur le châssis photographique à 25 em. environ du niveau de l'oculaire.

d) Technique photographique. — La mise au point photographique se fait comme on le sait avec le chercheur fluorescent de Soret. C’est une opération assez mal commode, étant donné le peu de précision des images obtenues de la sorte. On en est réduit à prendre une mise au point approximative. et à faire une série de clichés en déréglant la mise au point par petites quantités dans les deux sens et en comptant sur le hasard pour atteindre la mise au point exacte. Cependant les variations de mise au point sont suffisamment considérables pour un faible déplacement, par suite la petitesse du à, pour qu’il soit nécessaire de ne décaler la vis micrométrique que par très petites quantités avec une grande prudence ; bien souvent l’on constate à la fin de la série de clichés que la région de bonne mise au point est maliencontreusement tombée entre deux clichés successifs, voir mème en dehors de la série.

Nous avons pu souvent restreindre le champ de recherches en utilisant les franges de Becke, soit à l’oculaire fluorescent pour obtenir directement la mise au point plus exacte, soit sur les clichés euxmêmes pour calculer une rectification de cette mise au point; si en effet nous faisons un premier cliché légèrement au-dessus de la bonne mise au point, la vis micrométrique étant à une cote X;:, un second cliché légèrement au-dessous et de cote X,; et que dans ces clichés les largeur des franges de Becke supérieures et inférieures du détail inté-

a . 7 ressant soient dans un rapport no la mise au point exacte X»h sera 7) sensiblement voisine de la cote :

aXb + bXa a +b

cela résulte de la théorie que nous avons donnée dans la seconde partie, en y introduisant toutefois l'approximation de considérer les franges de Becke supérieures et inférieures comme très voisines de la symétrie par rapport au plan d'exacte mise au point. Il serait d’ailleurs possible d'introduire un coefficient de correction, si l’on connaissait approximativement la différence d'indices au voisinage de la limite, par un calcul d'asymétrie analogue à celui que nous avons donné dans la seconde partie. Cette différence d'indices pour des muscles, assez fortement déshydraté par l'hypertonie de la glycérine, est voisine de Nanusele — Nglycérine = 491 — 41,46 — 0,05 pour le spectre visible.

Ce procédé réduit en tout cas considérablement la zûne d’indécision. On pourrait également employer un châssis incliné sur l'axe optique pour déterminer la position d'exacte mise au point.

e) Préparations. — Les préparations étaient des dissociations montées dans la glycérine servant à l'immersion, et intercalées entre deux petites lamelles de quartz amorphe ou de verre UV. L'ensemble étant luté sur un porte-objet spécial à centre perforé imaginé par Mile Chevroton, permettant de transporter facilement tout le système et d'uiiliser la même préparation dans les diverses comparaisons avec la lumière ordinaire et la lumière polarisée. Nous avions préféré comme médium de montage la solution glycérinée Zeiss, fortement hypertonique, aux solutions aqueuses salines, dont l'indice beaucoup trop faible (1,34 environ) nous eût fait perdre une bonne part des bénéfices de notre ouverture numérique. Dans l'état actuel de nos connaissances l'inconvénient résultant de l’hypertonie du médium ne peut être évité : les liquides permettant d'obtenir une solution isotonique d'indice 4,46 n'étant guère transparents pour ces radiations.

XEE. Bibliographie. — Le premier travail où il est fait mention de l'emploi des radiations ultra-violettes pour la fibre musculaire est à notre connaissance, celui de Meigs (1908) sur les muscles alaires de la Mouche. Meigs a tenté une comparaison fort intéressante, entre des fibres fraîches et des fibres colorées par les procédés usuels, mettant en évidence diverses perturbations qui résultent de ceux-ci. Nous n'insisterons pas sur cette comparaison, qui est en dehors de notre sujet. et nous n’envisagerons du mémoire de Meigs que la partie relative à l'ultra-violet et aux images des fibres non colorées obtenues par cette technique. Malheureusement, Meigs est extrèmement sobre sur les procédés employés par lui pour ses photographies, et sur son dispositifd’ultra-violet : « In the observation of my specimen I have been

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very much helped by having photographs taken of them by ultraviolet light ». Aucune indication de longueur d'onde, ni même de radiations sélectionnées. La seule indication précise est la suivante : « the photographs, on wich all the details of the observations are based, are the work of D' Kühler, who devoted many hours of his valuable time and the facilities at the disposal of the Zeiss works to their production ». Il est donc probable que c’est le dispositif de Kühler lui-même qui a été employé, mais cette incertitude est regrettable, étant donné que certaines des photographies sont très remarquables et pourraient donner des interprétations intéressantes.

Les préparations non colorées de Meigs étaient montées, soit dans NaCI à 0,7 0/0, soit dans un mélange à parties égales de blanc d'œuf et de NaCI à 2 0/0. Les photographies les plus intéressantes à notre point de vue sont les figures 1 et 2 de la planche |, qui représentent des « sarcostyles » de Mouche étaiés au repos. Nous laissons en effet de côté pour le moment les aspects de contraction et leur théorie. Voici à peu près textuellement les passages de la description correspondant à ces figures :

Le sarcostyle est traversé à intervalles de 3 x par des lignes sombres bien marquées (1). Au milieu de l'intervalle de deux de ces lignes sombres, une ligne beaucoup plus faible est quelquefois perceptible (marquée [M + k] sur les photographies). Il est à noter que sur l'un ou l’autre eôté de la ligne la plus sombre, une ligne brillante apparait quelquefois, mais d'apparence irrégulière (2). Il y a des cas où elle est invisible, et elle est très variable d’étendue et d'éclat ; ces faits, en relation avec celui que la ligne brillante apparaît sur un côté seulement de la ligne sombre, justifient pleinement l'hypothèse que cette ligne brillante n'est pas l'indication d’une troisième substance du sarcostyle, mais probablement celle d’une réflexion à la surface de contact entre la substance de la ligne sombre et la substance du sarcostyle. Aux observations microscopiques directes (3) on met en évidence que si le tube du microscope est relevé progressivement au-dessus du point où le sarcostyle est au foyer, le sarcostyle’ apparaît ordinairement, d'abord comme un corps beaucoup plus brillant que le médium environnant, traversé par d'étroites lignes