IV. — Procédé de Diénert et Guillerd. — Utilise la

même technique que précédemment, mais remplace leau peptonée par l'eau de levure autolysée.

Eau de levure (dilution normale) .. 20 cc.

Faui'stétile. se Eee 30 cc.

Rau d’ensemençcement .............. 50 cc.

qui nous donne une eau de levure au 1/5.

V. — Procédé de Péré. — Modification du procédé de Vincent primitif. Il permettait Fensemencement d'une grande quantité d’eau.

rs 17 er

Un bouillon est réparti dans des fioles de Vivien à raison de 50 cc. par récipient.

On stérilise et on ajoute à chaque fiole 8 ce. de solution phéniquée à 5 pour 100 et l’eau à analyser pour un volume total de 150 ec. On répète l'opération sur cinq à six fioles. On place à 41°5.

Dès qu'un trouble se produit (quinzième on vingtième heure), où ensemence avec le contenu des fioles des tubes de bouillon phéniqué à 1 pour 1.000. On replace à 41°5 et on termine comme dans le procédé de Vincent.

Ce procédé est évidemment sujet aux mêmes critiques que la méthode dont il dérive.

VI. — Procédé de Pouchet et Bonj jean. — Inspiré du procédé Vincent, sa technique est la suivante :

Dans des ballons contenant 100 cc. de Mt stérilisé, verser 159 çc. d’eau à analyser et5 cc. de soluiion phéniquée à 5 pour 100. Porter à lPétuve à 42°, puis ensemencer çn bouillon ordinaire.

Après huit jours de séjour à 36°, cette culture est inoculée à un cobaye à raison de 0 cc. 3 par 100 gr. d'animal. Si ke cobaye suçcombe, on fait des cultures avec le sang du cœur, la pulpe des viscères, etc.

H est évident qu’une telle méthode, en dehors &e toute critique théorique, ne peut être employée pratiquement pour une analyse d’eau. D'ailleurs elle ne

Li ARE

recherche de Colibacille que qualitativement et ne constitue pas, à proprement parler, un procédé üe

Colimétrie.

! $ IL — Procédé d'Elsner et ses dérivés I. — Procédé d'Elsner. — Il est basé sur le principe

d’un milieu sélectif; le Colibacille se développerait à l'exclusion de tout autre germe sur une gelée de pomme de terre additionnée d'iodure de potassium.

On pêle et on râpe avec soin 500 gr. de pommes de terre crues; la pulpe obtenue est mise à macérer quatre heures dans un litre d’eau; on tamise et on laisse déposer toute une nuit dans un endroit frais. Ensuite on décante et on additionne le liquide de 150 à 250 grammes de gélatine que l’on a fait dissoudre à feu doux. Avec une solution de bicarbonate de soude, on diminue l'acidité du milieu jusqu’à réaction faiblement acide au tournesol. On filtre et on stérilise après répartition par fractions de 100 grammes dans des matras.

Avant l'usage, on ajoute’ à chaque ballon 1 gramme d’iodure de potassium dissout et stérilisé dans une petite quantité d’eau; on mélange et on distribue cette gélatine iodurée à 1 p. 100 dans des tubes à éssai.

L’ensemencement se fera en ajoutant à la gélatine

fondue 0 cc. 5 à 1 cc. d’eau; le contenu des tubes est ensuite coulé sur boîtes de Pétri.

D’après Elsner, sur ce milieu, le Colibacille donnerait en 48 heures, à 22°, des colonies arrondies, opaques et légèrement brunâtres; le Bacille d’Eberth fournit après quatre jours des colonies plus petites, transparentes, presqu'invisibles. La différenciation serait facile, les autres bactéries ne se développeraient pas.

En réalité, divers germes — même des liquéfiants — se développent sur les plaques et les caractères des & lonies à Colibacilles et à Bacilles d’Eberth ne sont pas aussi différenciés que le dit l’auteur. La présence de Bactéries liquéfiantes rendra en outre la numéralion presqu’impossible ou au moins inexacte. Enfin il sera indispensable, pour être certain de l’identité des germes isolés, d’en rechercher les réactions biologiques habituelles.

II. — Procédé de Grimbert. — Attribuant les insuccès de la méthode d’Elsner à l'inconstance du milieu employé et à l’indétermination de son degré d’acidité, Grimbert préconise l’emploi d’une gélatine ordinaire à condition de maintenir une acidité telle que 10 cc. de milieu soient neutralisés par 5 cc. d’eau de chaux, . où mieux un milieu de composition cons-

tante :

1 NE SD PET ER OES 27 0 Erre LP AMAR ASE RE SE SA 7 at

+ ap Maltose --....... Lg. | Sulfate de ma- Amidon solube .. 2 gr. | gnégie Aa ee A nee on MER h PER ? 87: | Binmalate d'ammo- Phosphate neutre :

À Re FL HI EE fo ce AE SE

de potassium .. 2 gr.

Sulfate de potas- | Carbonate de ma-

ST 2 2 gr. FR gnésie 4... 1 gr.

que l’on dissout dans un litre d’eau. Au mélange, on ajoute 15 pour 100 de gélatine. Clarifier au blanc d'œuf, chauffer à 115°, puis filtrer.

Ce milieu s'emploie comme celui &d'Elsner; Fapparition des colonies y est plus lente; on ne voit

- les premières qu’à partir du troisième jour.

HI. — Procédé de Rémy. — Emploie un milieu plus nutritif et moins acide que celui de Grimbert.

La gélatine différentielle de Rémy est constituée par :

Asparagine 4 .:.......1. 40. 6 gr.

Acide oxalique,/!:2" Fetes Ô gr. 5 Acide laatique 1.70 2 OS Q gr. 15 Agide citrique .......:........: 0 gr. 15 Phosphate bisodique ....... MR VE Sulfate de potassium ........... 4 gr, 25 Chlorure de sodium LAIT à EN ne AE TES 2 gr.

Peptone A CE ERA EEE AS EE 30 gr.

dissouts dans un Htre d’eau avec chauffage de 15 minutes à 110°. Le liquide est ensuite versé dans un

— Hi —

ballon tontenant 150 grammes de gélatiné. On ajoute

une solution de soude jusqu’à alcalinisation légère. Porter quinze minutes à l’autoclavé, puis acidifier ävec liné solution décindrmale d'acide sulfurique, de façon que 10 cc. dé gélatine aient uñe acidité neuträlisée par 0 cc. 2 de solution demi-normäle de soûde. Ensuite, ôn fait dissoudre 2 gr. 50 dé sulfate de magnésie par litre dé gélatine; on répartit eu lubes par fractions de 10 eéc.; on stérilisé par trois Chauffages à 190°.

Avant l’'émbploi, {ntroduiré dans chaque tubé 1 éc. dé solution de lactose à 35 pour 100 et 0 ce. 1 de solution phéniquéé à 2,5 pour 100.

L£é milieu s’emploié comme la gélatine d’Eisner. On conseille dé préparer d’abord un mélange dé bouillon et d’eau suspecté, additionné de 0,5 pour 106 d’äcide sulfuriquue et d'acide phénique. Lie mélañge ést placé 24 heurés à 30°, puis il sért à énsemencér, par la méthode des dilutions succéssives, les plaqués de gélatine.

Les éplonies apparaissent au deuxième jour.

Pour lé Bacillé Coli, les colonies profondes sont arrondies, oYoïdes du fusiformes, colorées en brun jaunâtre avec parfois de finés bulles de $az. Lis colonies superficielles, transparentes et bleutées au début, déviénnent rapidement épaques; cértaiñes restent glo-

nn + Ver

buleuses, brun jaunâtre; d’autres sont étalées à contours irréguliers.

Pour le Bacille d’Eberth, les colonies profondes sont blanc bleuté, plus petites que les colonies coliennes et ne donnent pas de dégagement gazeux. Bien visibles seulement au troisième jour, les colonies superficielles rappellent au début l’aspect des moisissures; elles s’étalent ensuite, prennent une teinte bleutée et peuvent atteindre 2 à 3 cm. de diamètre.

Ce milieu, si long à préparer, n’est pas pius sélectif que celui d’EÉlsner; les divers germes y poussent, même les espèces liquéfiautes. Il soulève donc les mêmes critiques que le procédé d'Elsner.

IV::— Premier procédé de Besson. —— Dérive également de celui d’Elsner; il présente l’avantage d’ensemencer de notables quantités d’eau; s'adressant à des milieux liquides, les bactéries liquéfiantes, qui viennent arrêter la recherche dans les méthodes précédentes, sont peu gêneantes. Le procédé .éliminerait d’ailleurs la plupart des germes banaux. ;

1° Préparer iavec 30 grammes de peptone et 5.grammes de sel marin un litre d’eau peptonisée à 3 pour 100. Ne pas alcaliniser, porter à 115°, filtrer, répartir en tubes par 10 cc. et stériliser.

2° Au moment de l'emploi, on ajoute à chaque tube XX à XXX gouttes de solution de, Gram récem-

ment préparée, puis 10 cc. de l’éau suspecte. On répète l’opération sur une dizaine de tubes.

La quantité de liqueur de Gram à ajouter. varie un peu avec la composition du bouillon; les premières gouttes ajoutées se décolorent rapidement; puis vient un moment où le milieu garde une légère teinte brun rose qui disparaît en cinq à six minutes; c’est là qu’il faut arrêter l'addition de liqueur de Gram.

3° Porter à l’étuve à 37°.

Le Colibacille pousse vers la huitième ou la douzième heure. Le Bacille d’Eberth vers la quinzième ou vingtième heure, mais tous deux avant les autres microbes. ‘*':

4° Arrêter la culture‘vers la vingtième heure; f aire avec le contenu des tubes qui ont troublé un nouveau passage en bouillon Gram.

5° Vers la quinzième ou vingtième heure, retirer de l’étuve les tubes de deuxième passage; faire avec leur contenu dés isolements sur gélose lactosée tournesolée et des ensemencements en bouillon ordinaire. -. : 6° Les cultures sont examinées et les colonies identifiées par les procédés habituels.

Nous reprochons à ce procédé de pratiquer des ensemencements de milieux liquides à milieux liquides. Il est bien connu que les germes qui ont survécu en premier bouillon se sont habitués au milieu et se développent bien lors des passages suivants, Ces

ss Da =-

Passages äugméütent les chances d'éliminer le Golibacille; is Sont inutiles puisqu'on affive sans eux à isoler-le Baéille Coli sur milieu solide.

$ III. — Les procédés dits dé « Conténträtion ÿ

Lors de la production d’un précipité chimiqué au sein d’un liquide contenant des microbes, béaucoup de ceux-ci sont entraînés mécaniquement avec lé précipité. On possède, alors, sous un pétit volume, les germes que renfermait le liquide.

I. — Procédé de Vallet. — Dans un tube stérile, on ajoüte à 20 ce: d'eau suspecte IV gouttes de solution aqueuse saturée d’hyposulfite de soude et ensuite IV gouttes de solution saturée d’azotaté de plomb. li se produit un précipité qu’on centrifuge; le culot est dissous dans quelques gouttes de solution d’hyposulfite de soude et le liquide obtenu est énsemencé sur gélatine d'Esner.

Ce procédé à l'avantage sur eélui d’'Elsner d'ensemencer les germes contenus dans uné grande quantité déau. Il Ÿ 4jotte une maniquIation supplémentaire. Il présente évidemment les mêmes inconvéniéntss a éolimétrié proprémient dite est encôte plus incertaine par suite de l'ignorance du pourcentage de la concentration des gérines.

IL. — Procédé de Schueder. — Evite la centrifugation employée dans la méthode de Vallet.

Deux litres d’eau suspecte sont placés dans une haute éprouvette et additionnés de 20 cc. de solution d'hyposulfite de soude à 7,75 pour 100 et de 20 cc. de solution d’azotate de plomb à 10 pour 100. On agite, on laisse au repos 20 heures, puis on décante et on dissout le précipité dans 14 cc. de solution saturée d’hyposulfite de soude. Le liquide obtenu est ensuite ensemencé, à raison de 0 cc. 5, sur des boîtes de Pétri à la gélose lactosée tournesolée.

La méthode d'identification ne pourra donner qu'une première indication. Si les germes sont très nombreux, la fermentation du lactose se fait largement et l’on peut admettre dans la zone rouge des colonies qui ne contiennent pas de colibacilles: la colimétrie, pour cette seule raison, pourra être faussée largement.

TL. — Procédé de Ficker, — On obtient la précipitation au moyen de sulfate de fer.

Partant d’un volume de 2 litres d’eau à analyser, on y ajoute 8 cc. de solution de soude à 10 pour 100, puis 7 cc. de solution de sulfate de fer à 10 pour 100. Après trois heures de réaction, on centrifuge le dépôt et on le dissout dans la moitié de son volume de solu- . tion de tartrate neutre de potassium à 25 pour 100,

Le produit est ensemencé ensuite sûr milieu de Drisalski par la méthode des dilutions successives.

IV. — Procédé de O. Muller. — La précipitation a lieu au moyen de l’oxychlorure ferreux qui opère plus rapidement que le sulfate et n’exige pas l'alcani- Jisation de l’eau. à

A trois litres d’eau, on ajoute 6 cc. de solution d’oxychlorure ferreux. Après trente minutes, on recueille le précipité sur un filtre et on ensemence directement ie dépôt sur milieu de Drigalski ou des boîtes de gélose au vert malachite.

V. — Procédé de Federolf. — On précipite par le sulfate de fer; on ensemence ensuite trois à huit boîtes de Pétri, contenant de la gélose, pour un litre d’eau avec un demi cc. ou { cc. de précipité.

On compte lesicolonies présentant l'aspect macroscopique habituel des colonies coliennes sur gélose.

VI. — Procédé de Bordas. — Une bougie filtrante plonge dans le récipient d’une eau à étudier, la tétine en haut. On fait aspiration et lorsque toute l’eau a été filtrée, on lave la crasse de la bougie dans quelques centimètres cubes d’eau stérilisée.

On ensemence ensuite d’après l’une quelconque des méthodes connues. ae

VII. —— Procédé de Diénert et: Etrillard. — Les auteurs utilisent le milieu de Teague :

NS ee

Ladidisfhilée.s;les mes ds 1.000 ce.

Peptonei Dior era a 22 10 gr.

Phosphate dipotassique ......... 1 2 gr Gélose ou gélatine .........,.:., 15 gr.

ou une autre peptone en ajustant au pH 75.

Avant l’usage pour 100 cc., on ajoute :

Lactose à 20 pour 100 .......... PRIE DEA 2

Posine a 2pour 1002275430 d'A D ice:

Bleu de méthylène à 0,5 pour 100 .. 2 cc.

On coule en boîtes de Pétri à raison de 25 cc. par unité.

On concentre les germes de l’eau à l’aide, d'alumine neutre contenant 70 pour 100 d’eau et préparée en faisant agir de l’ammoniaque sur une solution de sulfate d'aluminium. Cette alumine est introduite à raison de 20 cc. de suspension pour un litre d’eau. On agite et on laisse déposer deux heures dans un endroit frais. Le liquide surnageant est siphoné et le précipité centrifugé. On obtient un culot qui contient 90 à 95 0/0 des germes de l’eau primitive.

Ce culot est ajouté, à une température de 30°, à un mélange d’un tiers de gélose et de deux tiers de gélatine de Teague; on agite et on répand le mélange sur des boîtes de Pétri contenant déjà 25 ec. de gélose de Teague. On ‘en utilise 2 cc. par plaque. On ‘obtient ainsi un ensemencement très superficiel ét à faïble: température. CAC TR RATS AT

On place à 37° et en 24 à 48 heures apparaissent des colonies.

Les colonies coliennes ont 2 à 3 mm.; par transparence, elles ont un centre bleu sombre, presque noir, couvrant plus des trois-quarts de la colonie; par réflexion au centre, une sorte de bouton surélevé, bleu noirâtre, entouré d’une rigole circulaire, la partie périphérique de la colonie prend un aspect gris métallique.

Les Bacilles du groupe lactisaérogènes ont des colonies plus larges (4 à 6 mm.), leur centre brun foncé vu par transparence est moins noir que pour le B. Coli. Par réflexion, elles apparaissent plus claires et on n’observe pas l'aspect métallique. |

Le Bacille d'Eberth (forme S) donne des colonies rouges sur ce milieu; la forme R donne des colonies bleu clair.

Toutes les autres colonies ont une coloration violette ou gris bleu.

La numération se fait, après 24 heures d’incubation à 37°, en comptant seulement les colonies présentant avec netteté les caractères précédents.

Les auteurs obtiennent de bons résultats de ce procédé. La manipulation de la concentration est longue et nécessite un appareillage supplémentaire: elle introduit pour le résultat un élément d'incertitude. Ce procédé a l'avantage de mettre le Colibacille dans

de bonnes conditions de culture et de ne pas nécessiter l'intervention d’actions exipêchantes : la chaleur, des antiseptiques. Il repose entièrement sur des carac- tères microscopiques de colonies; il ne pourra donc être pratique que si ces caractères sont nettement tranchés et permettent une lecture rapide et correcte.

& IV. — Procédé de Parietti

Se base sur cette idée qu’une forte dose de semence de Bacille typhique ou de Colibacille peut triompher d’ure solution phéniquée qui ne une petite quantité de culture.

On prépare des tubes de 10 cc, de bouillon dans lesquels on ajoute IIL, VI et IX gouttes (XXX DRE au cc.) de la solution :

Acide phénique .......... DE 5 gr.

Acide chlorhydrique ............. 4 gr.

RTE AES T 100 gr.

Ces tubes sont ensemencés par séries avec I, IE, IL etc. gouttes d’eau suspecte, Les eaux sans Bacille iyphique ou B. Coli ne troubleraient que les bouillons renfermant peu d’acide phénique et beaucoup d’eau. Si ces microbes existent, les autres bouillons préseñteraient après 24 heures un trouble.

PE PR le ie

Ds nes ie

$ V.— Procédé de Drigalski-Conradi

: Utilise comme antiseptique une solution de krystal violet dont le but est d'empêcher le développemént des germés associés, tout en permettant la pousse des Bacilles Coli et des Bacilles typhiques.

On fait macérer pendant vingt-quatre heures 1.500 grammes de viande de bœuf hachée dans deux litres d’eau; puis on fait bouillir la macération une heure, on filtre, on ramène à 2 litres par addition

d’eau et on ajoute :

Peptone de Witte ................ 20 gr.

NF GR st Bar er RNA RE 20 gr.

Sel MAIN 7 Nr RE et IQ 10 gr.

On reporte à l’ébullition, on ajoute 60 gr. d’agar, on chauffe jusqu’à dissolution et on alcalinise faiblement. Autoclave 1 heure à 120°, Filtrage à chaud et stérilisation. $

On a préparé d'autre part le mélange :

Téinture de tournesol .:......:..: 300 cc.

LaGlGBe: Line CL NE ER AE 30 gr.

On mélange à 75°, en veillant toujours à Falcalinité du milieu, en usant au besoin d’une solution de soude à 10 pour 100. On ajoute encore 4 cc. de cette solution chaude de soude et 20 cc. d’une solution

chaude et stérilisée de Krystal-violet (B. de Hôchst) à

0,1 pour 100.

La gélose obtenue est distribuée dans de grandes boîtes de Pétri; les ensemencements pratiqués en surface, les boîtes sont ensuite placées à l’étuve à 37°.

Sur ce milieu, le Colibacille donne des colonies opaques et rouges, le Bacille d’Eberth des colonies transparentes et bleues.

Milieu de Hagemann. — Hagemann a modifié le milieu de Drigalski de la façon suivante. Préparer : Patraitode Liebig 2, Pic CN 22 10 gr.

Fépiane WHEN LA. ce 2 10 gr.

Sean MN au Moon ane 3 ÿT.

RTENB AS he ne pe ARTE ANS 600 gr.

Porter à l’ébullition. Ajouter 500 cc. de lait. Faire bouillir et ensuite faire dissoudre dans le liquide chaud 20 grammes d’agar. Porter à l'autoclave une demi-heure à 120°, puis filtrer à chaud et répartir dans des fioles d’Erlenmeyer. Stériliser.

Avant usage, ajouter dans la gélose liquéfiée de la solution de soude pour obtenir une alcalinisation légère, puis quelques centimètres cubes de teinture de tournesol et IIT gouttes de solution alcoolique &e krystal-violet à 1 pour 100.

$ VI. — Procédé de Endo

La gélose nutritive, additionnée de fuchsine, est décolorée quand on y ajoute du sulfite de sodium. Si

l’on eñsemence du Colibacille sur cette gélose incolore, les acides produits par le microbe amènent une recoloration du milieu. Les colonies coliennes prennent une teinte rouge, les colonies typhiques restent incolores. |

Préparer un litre de bouillon peptoné, y dissoudre 30 grammes de gélose; filtrer à chaud; neutraliser exactement et ajouter 10 cc. de solution de bicarbonate de soude à 10 pour 100, puis 10 grammes de lactose et 5 cc. de solution alcoolique et saturée de fuchsine. Le milieu prend uné teinte rouge. On additionne de 25 ec. de solution ‘récente de sulfite de sodium à 10 pour 100; la décoloration commence immédiatement et est complète après une stérilisation faite après répartition dans des tubes par fractions dedôiéé.s1à :! |

Conserver à l’obscurité.

Au moment du besoin, on liquéfie le contenu des tubes pour le verser dans des boîtes de Pétri: puis on ensemence en surface. :

Après 15 heures à 37°, les colonies de Colibacilles rougissent au centre; après 24 heures, elles sont entiérement colorées avec un reflet verdâtre.

$ VIL — Procédés au vert malachite

D’après Loeffler, l'addition d’une certaine quantité de Vert malachite aux milieux de culture empêche

Etage

le développement du Colibacille et est sans action sur la pousse des Bacilles typhiques.

Kiralyfi a montré que cette propriété n’était pas exacte, mais que, dans un tel milieu, un grand nombre de germes (Streptocoque, Staphylocoque, Vibrion cholérique, etc...) ne poussent pas. Il a proposé d’employer de tels milieux pour lobtention de colonies pures de B. Coli et de de B. d'Eberth.