TÉMOIN

Formiamide: . . 0 9,6 0,2340 15,40 6,58 89 Acétamide-s .::. 10,53 4,4 0,1107 6,25 5,08 103 Propionamide . . 14,69 4,0 0,1363 6,75 4,95 97 Butyramide. . . 10,35 4,2 0,1334 6,50 4,87 95

Les rendements en levure sont faibles, ce qui est dû en partie sans doute à une aération insuffisante, la couche de liquide ayant au moins 2 centimètres d'épaisseur dans les ballons employés. Les résultats n’en sont pas moins comparables et permettent de conclure que la propionamide et la butyramide ne sont pas de meilleurs aliments azotés que l’acétamide. La formiamide semble posséder une action spéciale ; mais ne faut-il pas l’attribuer, soit à sa très facile décomposition en ammoniaque, soit à ce que le produit employé était déjà un mélange d'amide avec un peu d'ammoniaque, l'action excitatrice de cette dernière intervenant alors ?

Ce qu'il faut ajouter, c’est que dans les cultures obtenues avec ces diverses amides, il se fait de l’acide formique, comme en présence d’acétamide.

Recherche de la diastase hydrolysant les amides

Nous sommes maintenant en possession d'un certain nombre de faits à l'aide desquels nous pouvons essayer d'interpréter le. phénomène de l’utilisation des amides par la levure.

La première hypothèse qui se présente à l'esprit est celle d'une simple hydratation destinée à fournir de l’ammoniaque. L'hydrolyse diastasique des amides, de l’urée: en particulier, est un phénomène fréquent chez les végétaux : elle peut être provoquée par les cellules de nombreuses graines, entre autres celles des Papilionacées, comme l’a montré G. ZempLén (1) ; par

{D G. ZEWPLÉN, Zeits. physiol. Chemie, 1.19, p. 229 (1912).

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des champignons inférieurs, tels que l'Aspergillus niger, d'après SBiBaTA (1); enfin, par de nombreuses espèces bactériennes. Il suffit de rappeler que la fermentation ammoniacale de l’urée par le Micrococcus ureæ a été d’abord étudiée par Van Tis- GHEM (2) ; Miquez a isolé un grand nombre de microorganismées fermentant l’urée et montré que l’hydrolyse est due à la présence d’une diastase, l'uréase (3).

On pouvait donc supposer que la levure ne se comporte pas autrement et que, cultivée en présence d’urée, elle fournit aussi de l’uréase.

Pour vérifier cette hypothèse, je me suis servi de cultures faites en présence d'urée, qui ont été filtrées après des temps variables, additionnées d'une quantité d’urée correspondant à 2 0/0 environ, et filtrées ensuite à la bougie. Ces solutions, abandonnées pendant plusieurs heures à l’étuve à 50°, n'ont jamais montré une trace d'ammoniaque.

Comme les milieux de culture sont toujours un peu acides, et que l’uréase est très sensible à l'acidité, on peut craindre que la diastase ne soit détruite dans le liquide dans ces conditions. J'ai alors fait des cultures dans le milieu à urée, en présence de carbonate de calcium en léger excès, en agitant assez fréquemment, de manière à saturer les acides produits par Ja levure et à maintenir la neutralité. Le résultat a été le même.

Il faut donc en conclure que, si la levure sécrète de l’'uréase, cette diastase ne diffuse pas dans le milieu. Ce résultat était d'ailleurs à prévoir, puisque les cultures faites en présence d'urée, même très âgées, contiennent toujours un excès d urée et ne montrent pas la présence d’ ammoniaque.

On pouvait espérer que la levure tuée par un antiseptique laisserait diffuser la diastase si celle-ci est présente dans les cellules. Afin de le vérifier, j'ai pris deux ballons Fernrach contenant du milieu minéral glucosé et je Les ai stérilisés par

(1) Saiara, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol., t. 5, p. 384 (1904).

(2) Van TizGnem, Thèse, Paris 1862.

(3) Miquez, C. R. Acad. Stciences, t. 111, p 397 (1890); Ann. de He graphie, 1. 5, pb. 371 (1893).

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chauffage après avoir introduit dans l’un 5 grammes de carbonate de calcium et dans l’autre 0 gr. 30 d'acide tartrique (soit 0,1 0/0). Les deux ballons ont reçu après refroidissement la même quantité d'une solution d’urée stérilisée par filtration et ont été ensemencés, puis abandonnés à l’étuve. On agite chaque jour et on fait de temps à autre des prélèvements en prenant toutes les précautions d’asepsie nécessaires. À aucun moment le liquide ne donne de réaction positive au Nessier. Au bout de 30 jours, on verse dans chaque ballon 1 cc. de solution alcoolique de thymol à 10 0/0; les ballons sont conservés à l’étuve à 25°, à l’obscurité, et on continue à effectuer des prélèvements de temps à autre. Le résultat est toujours négatif : c'est à peine si, après plusieurs semaines, le liquide prélevé donne après distillation une légère coloration jaune avec le réactif de Nssszer. [l n’y a donc pas eu de dédoublement de l’urée présente.

Ces essais ont été renouvelés avec diverses levures, de vin, de bière-haute et basse, ensemencées dans des milieux à urée : on a essayé d'ajouter le thymol après des temps variables, sans jamais obtenir un seul résultat positif.

Il semble donc que la diastase cherchée, si elle existe dans la levure, ne diffuse pas dans le milieu. Il ne restait plus qu'à la chercher dans le suc cellulaire lui-même, en employant la méthode de Bucaxer-Haë.

Dans ce but, jai cherché à préparer une certaine quantité de levure développée sur un milieu à urée. M. A. Fenvpaca a bien voulu mettre à ma disposition deux des appareils dans lesquels il prépare en grand les levures pures (1).

Un pied de cuve a d’abord été préparé dans des vases de cuivre étamés contenant chacun :

S'ACCNATOSO EAN RE eur 800 gr.

Phosphate monopotassique . . 9 gr.

Sulfate de magnésium. . . . 1 gr. 80 TNT NS PEUT E TDR OS RE EE 4 litres

(4) Décrit dans Ducaux, Traité de Microbiologie, t. 8, p. 726 (1900).

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Après stérilisation à 120°, on refroidit et on ajoute 20 cc. de solution d’urée à 20 0/0 stérilisée par filtration, puis on ensemence. La fermentation se poursuit activement. Au bout de 5 jours, on introduit aseptiquement le contenu de chacun de ces vases dans deux cuves de Ferngacx renfermant chacune :

Saccharose . . . He 16.000 grammes

Phosphate monopotassique . . 180 »

Sulfate de magnésium . . . . 36 »

Liberia es ANT 80 »

AU rer Le M RU PPS 80 litres

L'urée avait été ajoutée après refroidissement, en solution aqueuse préalablement stérilisée par filtration. Le liquide a été aéré d’une manière continue. L

La fermentation étant à peu près achevée au bout de 12 jours, la levure déposée à été soutirée après décantation du liquide surnageant. La quantité obtenue, rapidement égouttée sur une chausse, représentait environ 150 grammes de-levure en pâte épaisse. On y ajoute un poids égal de levure fraiche de brasserie tamisée et lavée, on exprime fortement et on mélange la levure pulvérulente avec 200 grammes de sable quartzeux et 40 grammes de terre d'infusoires, selon la méthode indiquée par Bucaxer (1). On broie longuement dans un mortier et on exprime la masse pâteuse au moyen de la presse de Bucuxer.

On obtient, en élevant la pression jusqu'à 100 kgr., un volume de 45 cc. de liquide ; en allant Jusqu'à 300 kgr., il s’écoule encore 25 cc. de suc, soit en tout 70 ce. Ce liquide à une réaction très légèrement acide au papier de tournesol.

On prépare deux portions de 5 cc. qui sont portées à l’ébullition et servent de témoins : le premier tube reçoit après refroidissement 5 ce. d'eau, le second 5 ce. de solution d'urée à 10 0/0. Däns deux autres tubes contenant chacun 5 cc. de suc de levure, on ajoute 5 cc. de solution d’urée à 10 0/0 ; l’un d’euxrecoit de plus 0 gr. 2 de carbonate de calcium précipité destiné à rendre la réaction parfaitement neutre au début de l'expérience. On

(1) E. Bucuxer, Ber. deut. chem. Gesell., 1. 30, p. 117 (1897). -

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opère de même avec deux nouveaux tubes dans lesquels on ajoute une solution d'acétamide au lieu d’urée, Le second recevant en plus 0 gr. 2 de carbonate de calcium.

Ces tubes sont laissés à la température ordinaire (17°). Une seconde expérience, disposée identiquement, est faite à l’étuve à la température de 30°. Enfin, le reste du liquide est additionné de 20 0/0 de saccharose en poudre, pour vérifier l’activité zymasique du suc. Ce dernier tube, laissé à la température ordinaire, donne seulement au bout d’une demi-heure un très faible dégagement de gaz, qui suffit pour prouver l’existence de la zymase.

Quant aux autres tubes, leur réaction n’a pas changé : elle est restée neutre ou très légèrement acide, pendant la durée de l’expérience, qui a été prolongée 13 heures. Il n’y a donc pas eu hydrolyse de l’urée. Les tubes additionnés d’acétamide ne : donnaient pas non plus trace d’ammoniaque par chauffage avec la magnésie.

- On peut conclure, semble-t-il, de cette expérience, que la levure employée ne contient pas d’uréase ni de ferment hydrolysant les amides et que ces diastases ne s’y développent pas par culture dans un milieu où l'azote est fourni sous forme d'urée.

Depuis j'ai eu à plusieurs reprises entre les mains des préparations de levures différentes, faites suivant la méthode de Lesenew (1) et susceptibles de fournir des macérations contenant une zymase très active ; je n'ai jamais pu y déceler la présence d'uréase.

Discussion des résultats expérimentaux précédents

De toutes ces expériences résulte à l'évidence la conclusion que les amides employées, urée et acétamide en particulier, peuvent servir à la levure pour édifier son protoplasma

vivant.

(1) Lesenew, C. R. Acad, Sciences, t. 452, p. 49 (1911).

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Quel est le mécanisme de cette utilisation? S'agit-il d'un simple dédoublement hydrolytique avec formation de sel ammoniacal ? Dans ce cas, il semble que nous devrions trouver, en regard de chaque amide employée, l'acide correspondant et lui seul; or, comme nous l'avons vu, il se fait toujours de l'acide: formique en quantité notable, et nous aurons d'ailleurs à revenir sur ce point (1). Nous devrions également, dans cette hypothèse, déceler le ferment hydrolysant, en particulier l'uréase, ce qui n’est pas le cas.

Mais avant d'aller plus loin, il me faut examiner un travail très considérable, dû à H. Prinesnem et paru cinq années après la publication de mes premiers résultats (2).

Ce travail comprend trois parties. Dans une première partie, l’auteur étudie les diverses sources d’azote convenables pour la levure et l'influence de leur constitution chimique sur le pouvoir ferment de cette dernière ; dans la seconde, les substances qui agissent sur le pouvoir ferment, la. multiplication et les échanges azotés de la levure ; enfin, la troisième partie a trait à l'influence exercée sur la formation des produits secondaires.

Pour Pricsaelm, la levure peut bien bâtir son protoplasma avec diverses sources d'azote, mais elle ne peut faire fermenter le sucre que si on lui donne des substances azotées contenant le groupement :

Rene A ou - NH - C- CO l £

Il définit sa proposition : « ce n’est pas une condition géné-

« rale pour la formation de protéiques par la levure que la

« source d'azote contienne - NH - CH - CO -, Mais seulement une | « condition pour que Le plasma ait la capacité de faire la zymase

« ou de permettre l'activation de la zymase formée » (3). Cette. hypothèse est née dans l'esprit de l’auteur à la suite des tra-

(1) Voir plus loin, p. 63.

(2). H. PrincsneIm, Ber. deut. chem. Gesell., 1. 39, p. 4048 (1906) : voir . pour l'ensemble du travail, Biochem. Zeitsch., t.'3, p. 121 (4967). (3) H. PrinGsneïm, loc. cit., p. 195. rà