SACCHARIFICATION DE L'AMIDON PEPTONISATION DE LA CASÉINE

Le d'amidon + Amylo-coagulase Lait L Présure

es E pe Can + Amylase pp' dite \ Coagulum de caséine + Caséase pp! dite ( midon soluble et dextrines + Dextrinase ! |

Anylase

Caséine soluble et caséoses + Diastace peptonisante | laltose Caséone

Cette conception de la dislocation de la caséine par la caséase est très vraisemblable bien qu’encore hypothétique ; car elle n’a pas l'avantage d'être appuyée par des faits expérimentaux aussi décisifs que ceux qui ont permis de distinguer les différentes phases de la saccharification de l’amidon. Néanmoins, les faits que j'ai observés permettent de justifier dans une certaine mesure cette interprétation, et en tout cas peuvent servir à orienter des recherches plus importantes dans cette voie. Il appartient au chimiste de le faire, plutôt qu’au biologiste.

J'ai montré précédemment qu’il était utile de savoir si un filtrat de culture renfermant de la caséase contenait en même temps de la trypsine, afin d'envisager les analogies ou les différences que présentent ces deux enzymes, souvent considérés comme identiques. Pour cette recherche, les filtrats de culture sont déposés avec des fragments de fibrine fraîche ou d’ovalbumine coagulée au fond d’un matras ; puis, ce contenu est amené à l’alcalinité nécessaire au fonctionnement de tout ferment trypsique par l'addition de quelques gouttes d’une solution de carbonate de soude.

Là encore, l’asepsie est obtenue par un chauffage à 110° mais cette opération ayant pour effet de rendre la fibrine moins digestible, j'ai établi parallèlement une autre série d'expériences où une asepsie moins rigoureuse, mais suffisante cependant, était obtenue en adjoignant au milieu un cristal de thymol,

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Dans l’un et l’autre cas, j'ai toujours eu soin d'établir un témoin avec liquide diastasifère bouilli. Chaque matras ainsi préparé reçoit 15 du filtrat de culture du champignon à essayer, et est ensuite placé à la température de 37°. Voici les résultats qui se rapportent à chacune des espèces.

Aspergillus fumigatus. — La fibrine cuite est attaquée lentement ; elle se désagrège peu à peu, puis se dissout en partie; la fibrine fraîche, plus digestible, est entièrement dissoute en moins de 48 heures; le témoin ne présente au bout de ce temps, qu’une insignifiante désagrégation.

Le tube où s’est effectuée la digestion de fibrine, a son contenu parfaitement limpide ; ce qui exclut toute hypothèse de contamination. La chaleur y fait apparaître un léger précipité dû à de la fibrine solubilisée, mais non entièrement peptonisée. Après séparation de ce précipité, le liquide à nouveau limpide, précipite abondamment par le réactif de Tanret et par une solution de tannin ; il donne la coloration pourpre à la réaction biurétique ; enfin, la tyrosinase, suc du Russula delica, préconisée par Harlay (1) dans la recherche des digestions trypsiques, donne une coloration rouge qui noircit peu à peu. Ces réactions, dans leur ensemble, caractérisent la production de peptones par le processus d’une digestion trypsique.

J'ai, d'autre part, pour ces digestions, utilisé l’albumine de l’œuf sous forme de tubes de Mette ; cette méthode, déjà décrite au chapitre précédent, m'a permis de comparer entre eux les ponvoirs albuminolytiques des divers filtrats de culture. Pour l’Asperg. fumigatus, les résultats sont les suivants, la température étant de 30 : |

DURÉE DE L'ACTION LONGUEURS EN *” DE L'ALBUMINE DISPARUE DIASTASIQUE À CHAQUE EXTRÉMITÉ DU TUBE DE METTE

Le témoin, durant ce temps, n’accuse aucune trace de digestion. J'ai constaté que le filtrat glycériné peptonisé et le Raulin accusaient une

(1) Hartar : De l'application de ld tyrosindse à l'étude des ferments protéolytiques. Thèse de Doctorat, Paris 1900

puissance albuminolytique très voisine de celle du filtrat glucosé.

Rhizopus equinus. — La fibrine subit une très minime désagrégation ; lente et peu appréciable. Les tubes de Mette, au bout d’une dizaine de jours, ne présentent aux deux extrémités, qu’une très légère excavation n’atteignant pas 1/2 m/" de profondeur.

Rhizomucor parasiticus. — Après 15 jours, et au-delà, la fibrine cuite n’a éprouvé aucune désagrégation apparente ; la fibrine fraiche est légèrement gonflée ; les tubes d’ovalbumine sont absolument restés intacts après un mois.

Cette dernière espèce est assez digne de remarque, car son liquide de culture, capable de digérer la caséine, se montre dénué de pouvoir albuminolytique, ou tout au moins pourvu d’un pouvoir si faible, qu’il échappe à l’observation.

Tous nos champignons sont au total, de faibles producteurs de trypsine, surtout quand on les compare à certaines bactéries du sol ou de l'air qui ont si vite fait de décomposer les matières organiques azotées.

Ces observations concordent avec celles du chapitre précédent. Ce qu’il importe surtout de retenir ici, c’est que le Rhizopus equinus et le Rhizomucor parasiticus forment un groupe de champignons remarquables par leur sécrétion insignifiante ou nulle en trypsine, avec un milieu sur lequel ils produisent de la caséase. :

Je rappeilerai en outre, que dans le chapitre précédent, en envisageant l’hypothèse de Duclaux suivant laquelle la dislocation ultime de la caséine par les microbes pourrait être le fait d’une diastase tryptique, je m'étais posé la question de savoir quelle pourrait être la diastase associée à la caséase pour déterminer la dégradation profonde que subit la caséine sous l'influence directe des champignons parasites et sous l’action de leur liquide de culture. Le moment me semble convenable pour y répondre.

Dans ces cas particuliers présentés par le Rhizopus equinus et le Rhizomucor parasiticus, il apparaît assez nettement que la diastase en question est différente de la trypsine, puisque le même liquide diastasifère qui disloque profondément la caséine, laisse l’albumine intacte en milieu alcalin.

Quelle serait donc alors cette diastase ? Parmi les solutions qui peuvent se présenter, il en est deux que je me bornerai à proposer, laissant pour un autre moment le soin de leur vérification, afin de ne pas donner à ce travail une trop grande étendue,

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Il est possible que la diastase qui intervient à la suite de la caséase pour pousser la destruction de la caséine jusqu'aux termes leucine, tyrosine, produits ammoniacaux, soit la diastase « caséonisante » ellemême que j'ai distinguée précédemment; elle se comporterait ainsi comme une diastase tryptique. Il se pourrait aussi que ce soit une érepsine.

On sait que ce dernier enzyme découvert par Connheim dans la muqueuse intestinale des Mammifères, est incapable de dissoudre l’albumine ou la fibrine, mais transforme les albumoses et les peptones en produits cristallisés très simples, et attaque nettement la caséine du lait. On verra d’autre part, que l'identité de la caséase avec l’érepsine est fort soupçonnée. |

S 6. GÉLATINASE.

J'ai recherché aussi quelle était l’activité gélatinolytique des liquides de culture dont je viens d'examiner les pouvoirs caséinolytique et albuminolytique.

Pour cela, une solution de gélatine à 12 p. 100, neutralisée, est répartie par 10c dans des tubes à essai. Ceux-ci, et leur contenu sont ensuite stérilisés à la température de 110°. Avant que la gélatine ait perdu sa fluidité, et après refroidissement suffisant pour que l’action diastasique ne soit pas entravée, les filtrats de culture sont introduits à l’aide du matras-pipette. Aussitôt qu'après agitation, le mélange est intimement opéré, les tubes sont mis à refroidir dans un courant d’eau jusqu’à solidification de la masse gélatineuse, puis, placés définitivement à l’étuve à 22°.

Des tubes témoins, les uns sans filtrat de culture, les autres additionnés de 7 à 8* d'un liquide actif, préalablement bouilli, ne s’y liquéfient pas à cette température. Cette remarque a son importance, car elle permet d’écarter à la fois l'influence de la température et celle de la dilution dans la liquéfaction d’un tube de gélatine additionné de liquide diastasifère. Les résultats relatifs à chaque espèce cryptogamique sont exposés dans les tableaux ci-dessous ; la puissance de gélatinolyse est mesurée par le temps nécessaire à la liquéfaction complète et parfaite du tube de gélatine, |

Aspergillus fumigatus. — Culture de 1 mois et 45 jours.

VOLUME EN CENT. CUBES TEMPS NÉCESSAIRE POUR OPÉRER DE LA SOLUTION DIASTASIFÈRE LA LIQUÉFACTION Liquide glucosé Liquide glycériné | 3 ce 4 h. 1/2 28 heures 9 ce 5 heures 5 jours 4 ce 14 — 8 — 4/2 ce 25 — 14 —

Lorsque des tubes identiquement préparés sont exposés à une température moins élevée (16°), la liquéfaction s’effectue beaucoup plus lentement, ainsi qu’on doit s’y attendre. Les chiffres suivants témoignent de cette lenteur.

4 de filtrat glucosé produit la liquéfaction en 2 jours. ce — glycériné — 12 jours.

Aucun des tubes témoins ne s’est liquéfié. L’échelle de la température, facteur important dans toutes les actions de diastases, intervient ici d’une double facon : car une température peu élevée retarde l’action diastasique en même temps qu’elle rend la gélatine moins liquéfiable.

La gélatine ainsi liquéfiée par la gélatinase a perdu la faculté de se reprendre en gelée, dans les conditions où elle le faisait normalement. Plus on s’éloigne du moment où la liquéfaction s’est produite, et plus on observe de retard à la gélification, et moins la gelée reprend de consistance. Finalement, lorsque l’action diastasique s’est prolongée longtemps, la température du simple courant d’eau devient très insuffisante pour provoquer le retour de la prise en masse. Voici l'explication de ces phénomènes qui me semble la plus rationnelle.

L'action liquéfiante est très certainement doublée d’une action chimique ; ce que l’on vient d'observer est une solubilisation pure et simple, qui donne naissance à des produits complexes encore mal déterminés, et que pour cette raison on rassemble sous le nom de gélatoses, terme équivalent des albumoses et des caséoses, dont la caractéristique est d’avoir perdu la faculté de gélification. L'action chimique se poursuit alors pour aboutir au terme de gélatinopeptone,

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On retrouve en somme le schéma de ce qui se passe avec la caséine et l’albumine sous l’action de leurs diastases respectives.

Au fur et à mesure que s'effectue cette transformation chimique de la gélatine, le titre de la solution gélatineuse s’abaisse graduellement, et de ce fait, sa faculté de gélification diminue, de sorte qu’il devient nécessaire de produire de basses températures pour la provoquer.

D'autre part, l’action gélatinolytique engendre aux dépens de la gélatine même, une foule de composés grâce auxquels la solution gélatineuse en expérience doit se comporter finalement comme une solution saline. Sa concentration dépend nécessairement de l’action diastasique qui engendre les produits de destruction de la molécule de gélatine ; elle est d’autant plus élevée que l’action s’est poursuivie plus longtemps ou que le liquide diastasifère a été introduit en quantité plus considérable. Lorsqu'on abaisse suffisamment la température, on finit par être en présence d’une véritable congélation soumise aux mêmes lois que celle de toute solution saline. Le point de congélation s’abaisse à mesure que la concentration augmente. C’est en effet ce que j'ai dû constater.

Le thermomètre renseigne ainsi sur la continuité de l’action digestive qui se poursuit longtemps après la liquéfaction obtenue. A l’aide d’un cryoscope, j'ai noté les températures de la prise en masse de gélatine, aux divers moments de l’action gélatinolytique.

Pour l’Aspergillus fumigatus, les résultats sont les suivants :

VOLUME EN C-C- DE LA |TEMPS ÉCOULÉ DEPUIS TEMPÉRATURE SOLUTION DIASTASIFÈRE | LA LIQUÉFACTION |DE LA PRISE EN MASSE

4/2 ce 20 heures | + 5° 4/2 ce 24 — | + To 4 cc 24 — — 80 2 ce 2% — — 13°

J'ai tenté de substituer ia gélatine thymolée à la gélatine stérilisée par la chaleur, ce qui dispense alors de toute précaution aseptique dans les opérations. Mais, cette gélatine offre une plus grande résistance à l’action de la gélatinase ; son ramollissement est beaucoup plus lent ; et la méthode ne présente pas ainsi toute la sensibilité désirable dans certains cas.

Une autre méthode m’a servi à déceler le pouvoir gélatinolytique des liquides de culture ; c’est celle des tubes de Mette, modifiée pour

la circonstance. Les petits cylindres de verre sont remplis aü moment du besoin, avec une solution de 12 p. 170 de gélatine neutralisée, et colorée par un peu de fuschine. Ceite méthode n’est pas sans présenter quelques difficultés d'application. Si elle offre sur la précédente, l’avantage de donner des résultats où la dilution n’a pas exercé d'influence modificative, elle présente par contre l’inconvénient de ne pouvoir être réalisée qu'avec une asepsie restreinte ; car ici, il faut se borner pour opérer purement, à l'emploi d’un cristal de thymol. A la. rigueur, lorsque l’action ne doit pas trop se prolonger, les résultats présentent une exactitude suffisante ; mais, si l’action diastasique est lente, ils peuvent être entachés d’erreur par suite de l’ingérence des microbes.

Les tubes de gélatine ainsi préparés sont placés au fond de petits matras, avec 15° de liquide de culture, et le tout est porté à l’étuve à 22, Le pouvoir gélatinolytique est mesuré par les longueurs de gélatine disparues aux deux extrémités du tube. En ce qui concerne les filtrats de culture de l’Aspergillus fumigatus, les résultats sont les suivants :