ACTION DE LA CHALEUR SUR LA TOXICITÉ DES LIQUIDES

DK CULTURE.

En étudiant quelques-unes des propriétés du poison produit par VAspergillus fumigalus et en particulier sa façon de se comporter vis à vis de la chaleur, des précipitants, etc., il sera possible de connaître les affinités du principe toxique.

On a déjà vu, au cours de ce chapitre, que la chaleur exerce sur la toxine de VAspergillus fumigatus une action entravante; mais pour être définitivement fixé sur la résistance du poison aux températuresélevées, il est nécessaire d'avoir recours à des expériences plus concluantes. A cet effet, les liquides reconnus toxiques et destinés à recevoir l'action de la chaleur, ont été soumis, soit à des températures variées pendant des temps égaux, soit à une température constante pendant des temps de chauffe différents. Les liquides sont ensuite inoculés au lapin ou au cobaye à des doses qui les tuaient sûrement, avant que le liquide ait subi Taction de la chaieur. Les résultats obtenus sont consignés dans les expériences qui suivent ;

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ËxpÉR. XL. — Un liquide d'une culture de 20 jours est chauffé à soixante degrés au B. M. pendant trois quarts d'heure. On en injecte 10 ce à un cobaye; au bout de 15 minutes environ l'animal est atteint ; il présente les accidents graves habituels. Le tremblement général prédomine surtout, ainsi que la paialysie du train postérieur ; il y a quelques convullions, mais elles semblent moins violentes qu'avec la toxine non chauffée. Le lendemain le cobaye est rétabli.

ExpÉR. XLL — Un cobaye reçoit 12 ce 5 du môme liquide chauffé à foixanie-dix degrés pendant 3/ i d'heure; les accidents classiques se manifestent encore, et avec autant d'intensité que pour le cobaye précédent. Lo lendemain, l'animal est revenu à son état normal.

ExpÉR. XLIL — Un cobaye reçoit 10 ce. 7 du même liquide chauffé à quatre-vingts degrés pendant 3/4 d'heure. Il est atteint au bout de 25 minutes de la même façon, et avec autant d'énergie que les précédents.

ExpÊR. XLIIL — Un autre cobaye reçoit 12 ce 5 du liquide précédent, chauffé à quatre^eingt dix degrés, pendant 314 d'heure. Durant la première heure, l'animal a le poil un peu hérissé, maison n'observe pas de tremblements ; il reste ensuite blotti dans un coin de sa cage sans présenter aucun phénomène convulsif.

Ces expériences semblent indiquer que le poison est nettement altéré par 3/4 d*heure de chaulTe à quatre-vingt dix degrés. Est-il complètement détruit ? On ne saurait raîfirmer, car le cobaye de l'expérience précédente (XLIII) n'est pas absolument normal à la suite de l'inoculation; avec une dose plus élevée, il est permis de penser que d'autres accidents se seraient produits. Tout ce qu'il est possible d'affirmer ici, c'est que dans les conditions de Vexpérience XLIII, le poison de VAspergillus fumigatus n'a plus d'action tétanisante ou paralytique sur le cobaye.

Voici maintenant des expériences qui prouvent qu'à des températures plus élevées que précédemment, le liquide perd assez peu de sa toxicité lorsque le temps de chauffe est réduit.

ExpÉR. XLIV. — Un liquide d'une culture de 20 jours est chauffé à 100* pendant cinq minutes; inoculé à un cobaye à la dose de 10 ce, il détermine chez cet animal, au bout de trente minutes, des accidents violents.

ExpÉR. XLV. — Un cobaye riçoit 20 ce du môme )iquide chauffé à HO* pendant dix minutes. Dans les deux heures qui suivent l'injection, on observe un peu de tremblement, mais pas de tétanos ni de convulsions ; le lendemain ranimai est parfaitement normal.

ExpÉR. XLVI. — Un cobaye de 380 gr, reçoit 20 ce du môme liquide chauffé pendant trente minutes à la température de 120*. L'animal ne manifeste aucun tremblement, ni soubr 'ssauts^ ni mâchonnements : il est aussi alerte qu'avant rinoculationi

Ces dernières expériences établissent que le temps de chauffe est un facteur important dans Tatténuation de la toxicité des liquides de culture ; il a autant d'influence que l'échelle de la température. C'est ainsi qu'un liquide toxique chauffé trois quarts d'heure à 9Jo est aussi inoffensif que s'il avait été chauffé 30 minutes à 120".

L'inoculation intra-veineuseau lapin, de toxine chauffée, permet de constater mieux encore, l'action entravante de la chaleur sur le poison, car l'animal ainsi que le mode d'inoculation choisis donnent plus de sensibilité à l'expérience.

ExpÉR. XLVII. — Un lapin de 2 kil. 780 rrçoit dans les veines 24 c.c 5 du liquide d'une culture de 20 jours, chauffé à 100' durant 20 minutes. On n'observe chez l'animal ni tremblements ni parésie, ni contractures ou convulsions ; seulement un peu d'anxiété et d'hyperexcitabilité ; peu à peu, il redevient absolument normal ; cependant qu'un témoin inoculé avec une dose comparable de liquide non chauffé meurt dans la nuit, après avoir présenté tous les accidents habituels.

ExpÉR. XLVIII. — Un lapin de 2714 gr. reçoit 14 c.c. du même liquide chauffé 45 minutes à 90". On ne constate, après rinoculation, qu'un peu d'hyperexcitabilité, de la fréquence de la respiration et de l'anxiété, mais pas de tremblements. Au bout d'une heure, l'animal est revenu à son état normal.

ExpÉR. XLIX. — Un lapin de 2700 gr. reçoit dans les veines 14 c.c. de liquide chauffé à 85* pendant 45 minutes, et provenant d'une culture de 20 jours. Au bout de 5 minutes, on remarque un peu de tremblement et d'hyperexcitjabilité musculaire ; puis, ces symptômes s'atténuent et s'effacent ; quatre heures après l'inoculation, l'animal est revenu à son état normaL

Ainsi, les températures de 100^ 90° et même 85% quand le temps de chauffe a été suffisamment prolongé, atténuent considérablement la toxicité des liquides de culture ; cependant, il persiste encore quelques légers troubles qui sont l'indice de traces du poison non entièrement détruit.

ExpÉR. L. — Enfin, lé liquide chauffé à cent vingts degrés pondant 30 minutes a été inoculé à un lapin de 11)50 gr. qui en a reçu la dose considérable de quatre-mngt'dtx c.c, en une seule fois. Au début, et pendant une demi-heure, il présente un peu d'anxiété et de très légers tremblements, puis l'animal se remet, et l'on n'observe plus chez lui qu'une légère fréquence de la respiration qui ne tarde pas d'ailleurs à disparaître.

A la température de 120® et avec un temps de chauffe de 30 minutes, il semblait que le poison était détruit ; le cobaye de Texpérience XLVJ n'avait présenté aucun symptôme avec 20 c.c. inoculés dans les mêmes conditions. On vient de voir que le même liquide inoculé à haute dose, produit des troubles nets et bien perceptibles chez le lapin, espèce animale plus sensible^

U résulte donc de cet ensemble d'expériences que le poison de VAspergillus fumigalus est d'une nature telle, qu'il oppose à Taetion destructive de la chaleur une résistance considérable. Cependant, îl paraît à peu près complètement détruit après 30 minutes de rfiautTe à 120", et Ton a vu qu'au voisinage de 85*» le chauffage suffisanimeiit prolongé altère singulièrement la substance toxique au point de la rendre aussi inerte qu'un chauffage à 120», mais de durée moindre.

La destruction de la toxine me semble réalisée ici, bien plus par le lait d'un chauffage prolongé que par celui d'une température élevée ; elle paraît, en cela, d'un ordre tout différent de celui des toxines proprement dites.

Le tableau suivant, résume en les comparant, les résultats obtenus dans les expériences précédentes.

l'eiptrlence

Um iBOCoUe et poids

Dosa de uiiQide loocolie

Tecpératnre

du chanllage

Temps

de

cttaiffe

symptooes mtmî

1830 gr. lapin

lOrc

llOo

15 niantes

un peu d'atuiiHt*

280 gr. cobaye

q.q. convul. el paralysie

347 gr. -

id.

300 gr. —

SOo

id.

348 gr. -

un peu d'anïîiHé

300 gr. —

accidents graves

300 gr. —

un peu de temtUemcDts

330 gr. -

rien en apparence

2780 gr. lapin

un peu d'hyperexi^itabilité

2714 gr. —

id.

2700 gr. —

un peu d'excitabilité

1950 gr. —

anxiété et très légei's tremblements

Cette façon de se comporter vis-à-vis de la chaleur, éloigne sensiblement la toxine aspergillienne des toxines vraies ; et ce que l'on vient d'observer suffirait déjà, semble-t-il, à l'éloigner définitivement du groupe des toxines proprement dites, si l'on ne savait que la réslBiance à de hautes températures est partagée par quelques-unes de ces dernières. Cela m*a conduit à examiner si le pois3n aspergillien ne partage pas quelque autre propriété des toxines vraies ; par exemplâ

celle d'adhérer fortement aux précipités colloïdaux provoqués dans leur solution; ce qui revient à tenter Tisolement du principe toxique, qui n'a jusqu'ici été étudié qu'en solution.

§ 6. — ESSAIS d'isolement du principe toxique.

On a vu que les toxines proprement dites, sont comme les diastases, entraînées par les précipités de colloïdes que détermine l'alcool au sein des liquides qui les renferment. Elles sont entraînées de même par un précipité de phosphate calcique, et ces caractères entrent en ligne de compte dans la définition des toxines vraies. Il est naturel de chercher à voir si la toxine de VAspergillus fumigatus possède cette propriété.

J'ai d'abord essayé la précipitation par l'alcool.

ExpÉR. LI. — Une pulture de 31 jours sur liquide peptonisé glucose, exposée à l'étuve à 30% est filtrée au papier. Cinquante cr nt. cubes du liquide de culture sont traités par trois fois leur volume d'alcool absolu. Il se fait alors un précipité blanchâtre peu abondant, que l'on recueille sur un filtre. On le dessèche à basse température dans le vide, et il est injecté en solution dans de l'eau, à un cobaye. Ce dernier ne se montre nullement incommodé et reste parfaitement normal.

ExpÉR. LU. — Cent cent. cub. de liquide d'une cullure d'un mois et 20 jours, sont traités par 300 c c. d'alcool absolu puis filtré à la bougie Garros, de l'extérieur à l'intérieur. Le précipité retenu sur les parois de la bougie est repris par l'eau et inoculé^ à un cobaye ; l'animal ne présente pas le moindre trouble.

Ce procédé d'obtention du principe toxique a donc totalement échoué; le précipité recueilli est totalement dépourvu de- nocivité. Je me suis alors adressé à une autre méthode qui sert encore à la préparation des diastases et qui consiste à former un précipité de phosphate de calcium au sein du liquide de culture.

ExpÉR. LUI. - J'ai prélevé 60 ce. de liquide d'une culture dé 25 jours; et, à l'aide de solutions titrées de phosphate de soude et de chlorure de calcium, j*ai déterminé dans le liquide la formation d'un précipité abondant de phosphate calcique. Le précipité est séparé par filtration, puis mis à macérer un quart d'heure dans 10 ce. d'eau distillée ; on filtre à nouveau, et le filtrat est injecté dans les veines d'un lapin. Ce dernier ne présente aucun accident, môme léger.

ExpÉR. LIV. — Cent trente cent, cubes du liquide de culture précédent sont soumis au môme traitement. Cette fois, le précipité de phosphate de chaux obtenu est trituré avec un peu d'eau, et inoculé sous la peau d'un cobaye. Aucun accidentée se produit ; on n'observe qu'un très léger tremblemement, à peine perceptible.

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ExpÉR. LV. — Le liquide dans lequel s'est effectué le précipité calcique de l'expérience précédente, est repris, filtré, et inoculé sous la peau d'un cobaye à la dose de 2 ) ce. Au bout d'une demi- heure, l'animal présente les symptômes d'une intoxication violente ; les accidents apparaissent avec la même netteté, avec la môme violance, que s'ils étaient produits par le liquide non préalablement soumis à la prrcipitation. Au bout de trois heures, l'animal est couché, complètement paralysé. // meurt dans la nuit.

ExpÉR. LVI. — Ce même liquide, encore pleinement toxique malgré une première précipitation, est repris encore une fois, et l'on y détermine un second précijâté de phosphate.de chaux. Le précipité inoculé an cobaye ne détermine aucun accident, même léger. Au contraire, le liquide cl^ir surnageant, inoculé à un nouveau cobaye à la dose de 20 ce, détermine chez cet animal des accidents tout aussi violents que la première fois, et en moins d'une demi-heure. Le cobaye succombe dans la nuit, après avoir manifesté les crises tétaniques et paralytiques bien connues.

Ces expériences me semblent des plus concluantes : toute tentative d'isolement partiel, ou de purification de la toxine à l'aide des procédés couramment employés pour les diastases, reste infructueuse. Non seulement les précipités n*ont entraîné aucun produit toxique ; mais le liquide résiduel garde toute sa toxicité première. Le poison reste en solution ; loin d'être précipité par l'alcool absolu, il y est soluble. C'est là, je pense, une indication fort précieuse pour des recherches ultérieureF. Du liquide primitif, pas une parcelle de toxique ne semble avoir été distraite par les opérations de précipitation ; et, si dans l'expérience LIV, on a pu observer un léger symptôme, il est plutôt attribuable à une imbibition par le liquide toxique, du précipité non lavé.

Ces caractères négatifs sont d'un grand poids pour déterminer la nature du poison aspergillien. Il ne pourra certes pas se placer à côté des toxines diphtérique ou tétanique. L'action de la chaleur l'avait déjà fait pressentir ; les procédés d'extraction que je viens d'exposer, et qui ont échoué, achèvent de le démontrer.

Un autre fait vient s'ajouter à cette manière de voir. J'ai observé di^ns quelques expériences que le poison de V Aspergillus fumigatus dialyse notablement. Dans l'eau distillée où baigne le dialyseur, on retrouve le principe toxique du liquide de culture, mais dilué, et p.ir conséquent, apte seulement à reproduire des troubles légers ; en tout cas, ces troubles sont identiques à ceux que produisent l'injection de faibles doses de filtrats de culture. Or, l'on sait que les toxines proprement dites, comme les diastases, ne dialysent que très faiblement.

Faut-il maintenant ranger le poison de VAspergillus fumigatus à côté des ptomaïnes alcaloïdiques de A. Gautier ? Tout le fait supposer.

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Cependant les documents me paraissent encore insuffisants pour permettre une affirmation catégorique ; des recherches d'ordre chimique me paraissent nécessaires. Elles sont entreprises, d'ailleurs. Toutefois, il est possible d'affirmer que ce poison n'est pas de nature complexe, en ce sens qu'il n'est pas doublé, comme beaucoup de produits microbiens, d'un principe toxique à allure de toxalbumine ; les essais qui précèdent l'auraient révélé, et auraient même permis d'en faire la séparation.

En résumé, si les caractères qui précèdent sont trop peu nombreux pour déterminer avec une rigueur absolue, les affinités chimiques du poison de VAspergillus fumigaius^ ils indiquent suffisamment qu'on doit l'éloigner des toxines proprement dites, et le rapprocher du groupe des poisons chimiques. Un nouveau travail s'impose à la suite de celui-là, mais il appartient plutôt au chimiste de l'entreprendre ; l'œuvre du biologiste s'arrête ici.

Un autre caractère qu'il est possible de préciser bien nettement, et qui a sa place dans ce chapitre, c'est le degré de diffusibilité ou de solubilité du poison, lequel passe malaisément dans le liquide de culture, ainsi qu'il résulte de l'expérience suivante :

ExpÉR. LVII. — Une culture de 50 jours, bien sporuîée, est séparée du liquide sous-jacent, puis lavée à plusieurs reprises à l'ean distillée. Elle ea^ dilacérée à l'aide du broyeur Borrel, et mise à macérer 24 heures dans de l'eau distillée, de façon à ce que les produits intra-cellulaires puissent passer des cellules dilacérées dans le liquide de macération. Trente cent, cubes de ce liquide sont inoculés à un lapin de poids moyen. L'animal est pris immédiatement de tremblements, puis de parésie, mais non de convulsions. Le lendemain il est revenu à la normale.

Les accidents obtenus ainsi, ne sont pas comparables en gravité à ceux que détermine le filtrat de culture lui-même. Néanmoins ils indiquent nettement que des substances nocives intra-cellulaires, très probablement de même nature que les produits extra-cellulaires, ont émigré en partie dans le liquide de macération. Normalement, ils sont peut-être loin d'y émigrer en totalité ; en tout cas, l'on ne peut songer à extraire intégralement le poison, des liquides de culture seulement.

Il reste encore un point à élucider. Ce poison est-il identique à celui que MM. Ceni etBesta ont extrait du même champignon ?

Les analogies entre les deux substances sont frappantes, notamment en ce qui concerne la résistance à la chaleur, les etTets sur certains animaux, etc. Mais il existe des dilTérences assez nettes dans la

sensibilité de quelques espèces animales. Ainsi, Ceni et Besta ont noté que le cobaye est assez réfractaire au poison qu'ils extraient du champignon par Féther; tandis qu'en utilisant seulement le filtrat de culture, j'ai constamment observé Tincontestable sensibilité du cobaye à l'égard de ce liquide.

Quoi qu'il en soit, on peut penser que c'est aux effets de ce poison que succombent certains animaux dans le cas d'aspergillose expérimentale à évolution rapide, et dans lesquelles le mécanisme de la mort restait très obscur, malgré les hypothèses de Kotliar, Lucet et Rénon.

La découverte de la toxine aspergillienne vient donc éclairer d'un jour nouveau cette partie de l'histoire de la mycose ; mais son intérêt n'est pas limité à ce fait particulier : elle semble avoir une portée beaucoup pins grande, en établissant l'étroite analogie du mécanisme infectieux des mycoses internes, avec celui des maladies bactériennes. Enfin, le poisqn de VAsperg'dlm fumigatus permet de chercher dans une voie nouvelle, l'immunisation des animaux contre la mycose aspergillaire : c'est ce que j'ai tenté dans le chapitre qui suit.

CHAI^ITRE m

Tentatives d'immunisation contre la mycose aspergillaire.