TECHNIQUE

11 m'apparaît comme de toute importance, au début de ce chapitre, de dire quelques mots de la technique un peu spéciale que j'ai dû employer dans la conduite de cette seconde série d'expériences. Il était nécessaire d'opérer purement afin de se mettre à l'abri des contaminations dont les effets, en favorisant ou en contrariant ceux que Ton attend, entachent les résultats d'erreur. Dans ce but, je me suis entouré de toutes les précautions habituelles usitées en bactériologie. Les procédés d'ensemencements stériles, de cultures pures, etc. ont été mis en pratique avec une grande rigueur.

Lorsque les cultures sont arrivées à leur complet développement, et que les matériaux destinés à leur nutrition sont entièrement consommés, les liquides de culture sont filtrés à la bougie Berkefeld stérile ; puis répartis dans les vases (matras, ballons, tubes à essai) où l'on veut étudier leur action sur des substances déterminées. Ces substances sont elles-mêmes stérilisées, soit par la chaleur, soit par l'emploi d'antiseptiques lorsque la stérilisation par la chaleur est impossible.

La répartition du liquide diastasifère est une opération délicate, car elle-même doit être faite stérilement. Pour cela, j'ai imaginé le dispositif ci-contre. C'est un appareil de construction assez simple, qui permet d'introduire, sans opérations longues et compliquées, les filtrats de culture dans les matras ou autres vases destinés à les recevoir. La pratique des pipettes graduées stériles, est ici d'application difficile, et même à rejeter, à cause des prélèvements nombreux et répétés que Ton est obligé de faire, et qui sont autant de causes de contaminations.

L'appareil consiste en un matras Pasteur, de 200 ^^ environ, auquel est adapté, par Tintermédiaire d'un raccord en caoutchouc ligaturé à ses extrémités, un tube gradué d'une dizaine de cent, cubes. A la partie supérieure de ce tube gradué, est soudé sur le côté, un tube recourbé bourré de coton, et destiné à assurer la rentrée de l'air pour rendre possible l'écoulement du contenu de la pipette une fois la communication interrompue avec le réservoir supérieur. L'air qui rentre dans

l'appareil est ainsi stérile. Un tube effilé fermé à la lampe, est adapté par un raccord en caoutchouc à la partie inférieure du tube gradué; il est destiné à être introduit dans l'ouverture des vases où le filtrat doit s'écouler. Une pince de Mohr, placée sur chaque raccord en A et en B, sert à régler l'écoulement du liquide, soit du réservoir dans la pipette, soit de la pipette dans les matras.

L'entrée libre du matras Pasteur est obturée par un tampon de coton et ne laisse rentrer qu'un air stérile.

L'appareil forme ainsi un tout qui peut être aisément stérilisé à l'autoclave et qui devient alors prêt à recevoir le filtrat au sortir de la bougie.

Le fonctionnement de l'appareil est des plus simples* Une fois rempli, .il est placé sur un support. On appuie sur la pince A, la pipette se remplit d'ellemême entièrement; on ferme alors A, et Ton ouvre B, pour que le tube effilé dont on brise la pointe, se remplisse également. On peut alors laisser l'écoulement se poursuivre jusqu'à ce que le niveau du liquide dans la pipette soit en regard de la division voulue. On introduit maintenant, après l'avoir flambée, la pointe effilée de la pipette dans Touverture du vase qui doit recevoir un volume déterminé de la solution diastasifère ; puis, en ouvrant et fermant 6^ on laiBse échapper

le liquide, dopt on règle l'écoulement en suivant le niveau dans le tubef gradué. Dès que ce niveau est arrivé à o, la division inférieure, on ferme B et Ton ouvre A, la pipette se trouve remplie à nouveau.

Pour que Técoulement soit plus rapide, on peut encore, comme la figure ci-contre le représente, adapter au tube recourbé qui sert à la rentrée de Tair un tube de caoutchouc d'une certaine longueur, qui permet à l'opérateur de produire à son gré une augmentation ou une diminution de pression à l'intérieur de la pipette, et de faciliter ainsi l'arrivée du liquide ou son expulsion.

Comme on le voit, le fonctionnement de ce matras-pipette n'offre aucune difficulté, pas plus que sa construction, et il présente l'avantage appréciable de pouvoir introduire une quantité assez considérable de liquide, en une seule fois, ou de la fractionner à son gré.

§ 2. CHOIX d'un MILItU DE CULTURE.

Il convient de faire choix du milieu de culture le mieux approprié au but proposé. Ce milieu devra donner en un minimum de temps une végétation facile et une culture abondante, afin que la sécrétion des principes diastasiques se fasse vite et bien. Il devra aussi ne plus contenir au moment de l'essai, de produits fournissant des réactions analogues à celles qui serviront à caractériser l'action diastasique. Ainsi, le lait ne m'a pas semblé réunir les conditions exigées, car après avoir servi d'aliment aux microphytes, il renferme des principes albuminoïdes et sucrés qui fausseraient les réactions ultérieures. De plus, c'est un liquide peu maniable, se prêtant mal à des opérations de filtration.

J'ai d'abord essayé deux liquides de composition minérale : le liquide de Cohn et le liquide de Raulin.

Liquide de C4ohn. — Ce liquide convient mal aux espèces étudiées* Seul, VAspergillus fumigatus s'y développe un peu, mais mal ; sa culture au bout d'un mois à 30o, ne consiste qu'en un léger voile poudreux, grisâtre. Les autres espèces ne se développent pas.

Liquide de Raulin. — C'est un liquide de choix pour VA. niger^ il convient bien aussi à VAsjp. fumigatus probablement à cause de sa parenté avec VA. niger. Le champignon s'y développe avec aisance, prend un aspect blanc grisâtre, puis fumé, comme sur la plupart des milieux usuels ; quelquefois cependant la couleur reste uniformément bjanche.

lihizopUs equinus et Rhizomacor parasilicus y croissent mal, donnent des cultures souffreteuses, sans vigueur, prenant Taspect d'un mince voile ; elles n'atteignent au maximum qu'un très faible développement, bien insuffisant pour le but recherché.

Achorion Shœnleinif Trichophyton gypseum et Microsporum canis paraissent ne pas trouver sur ce milieu les conditions d'un développement facile et normal. Ils y végètent à peine.

Les milieux faits de substances organiques, dans la proportion de 3^/0 d'hydrate de carbone et de l^/o de matières azotées, sous forme de peptones, m'ont toujours donné des cultures luxuriantes, quelle que soit l'espèce ensemencée. Le maltose, le saccharose, la dextrine, le moût de bière, la glycérine, peuvent être substitués au glucose dans les mêmes proportions. Associées à i^jo de peptones, chacune de ces substances assure à toutes les espèces étudiées ici, un développement rapide et également vigoureux.

Le glucose, aliment ternaire directement assimilable, m'a semblé le meilleur hydrate de carbone ; la peptone employée est la peptone Chassaing. La composition du milieu nutritif qui m'a servi pour toutes les expériences de ce travail est la suivante :

Eau 100 parties.

Glucose 3 —

Peptone 1 —

C'est le milieu employé avec succès par Mi\f . Sabouraud et Bodin pour cultiver les champignons des teignes.

Les six champignons précédemment décrits, sont mis à cultiver sur ce liquide, au fond de ballons à large surface placés à l'étuve à 28**. Après une période végétative variant de trois semaines à un mois et demi, les liquides sont filtrés à la bougie Berkefeld. Cette opération n'est faite cependant, qu'après m'être assuré de la disparition du glucose et des peptones dans le milieu de culture, précaution indispensable, car le filtrat sera précisément essayé plus tard en vue d'une production de peptones et même de glucose. La disparition de ces substances a lieu plus ou moins rapidement selon les espèces ; particulièrement rapide avec VAspergillus fumigatus où elle est complète entre le 10^ et le 14^ jour, elle est plus lente pour les autres espèces.

A partir de ce moment les opérations sont conduites aseptiquement comme il est indiqué dans le précédent paragraphe.

Les substances soumises à l'action des filtrats de cultures^ pour déceler les diastases protéolytiques qu'ils renferment, sont les suivantes:

i" Lait, poui* déceler la présence de présure et de Caséase. 2o Fibriney ou albumine, en milieu alcalin, pour déceler la présence

de trypsine.

S'* Gélatine, pour déceler la présence de gélatinase.