MÉTHODE DE H. C. GRAM

Dans un certain nombre de méthodes, on détermine le temps de coagulation non plus sur le sang tel qu'il sort de l'organisme, mais sur du sang que l’on rend d’abord incoagulable par le citrate de soude ou l’oxalate. de potasse et que l’on fait ensuite coaguler par adjonction de sels de calcium. Ces procédés sont, à priori, séduisants car une fois le sang stabilisé, on a: tout le temps voulu pour faire son examen et on peut le répéter autant de fois que l’on veut. Nous avons donc été amené à étudier une des techniques basées sur ce principe et nous avons choisi une des plus simples, celle de Gram: c’est une modification de la méthode de Howell où l’oxalate est remplacé par le citrate, de manière à permettre l'énumération des hématoblastes, par le procédé de Thomsen, sur le même échantillon de sang.

On recueille par une ponction veineuse, 4 cm' 5 de sang dans un tube contenant 0 cm° 5 d’une solution

(1) "H°=C. GRAM : Détermination du temps de coagulation sur plasma citraté. Modification de la méthode de Howell. Réunion danoise de biologie, 25 juin 1920, in C. R. Soc. de biologie, 1920, p. 1163, -

LA ee

de citrate de soude à 3 %. On laisse sédimenter le mélange une ou deux heures. On prépare 4 tubes à hémolyse contenant respectivement : 9, 8, 7 et 6 gouttes de solution salée physiologique et 1, 2, 3 et 4 gouttes d’une solution de chlorure de calcium cristallisé à | %. Il importe que ces tubes restent à une température constante, car, si les variations minimes de température n'ont pas d'importance, les variations plus étendues modifient considérablement la durée de la coagulation. Gram place les tubes dans les ouvertures d’un bouchon coiffant un flacon de Dewar — c’est-à-dire un flacon à double parois entre lesquelles on a fait le vide — contenant de l'eau à 35°. On introduit ensuite dans chaque tube 1/10° de centimètre cube du plasma citraté spontanément sédimenté; on observe la coagulation en inclinant le flacon toutes les. 30”. Dans ces conditions, le plasma de sédimentation contient toutes les plaquettes et le temps de coagulation normal varie entre 3 et 6 minutes. Si l’on centrifuge | h. 1/2 à 3.000 tours, toutes les plaquettes sont précipitées et le plasma ne coagule plus qu’en 8 à 14 minutes.

Telle est la technique de Gram; personnellement nous avons remplacé le flacon de Dewar par le même dispositif que pour la détermination du temps de coagulation du sang total, c’est-à-dire, par un cristallisoir contenant de l’eau et placé sur une platine chauffante, dispositif qui permet de maintenir la température au degré voulu, avec la plus grande facilité.

Il est parfois difficile d'apprécier par ce procédé le moment exact où le plasma est coagulé: en effet, en raison de l'absence d'hématies, le caillot est peu visible et comme il se rétracte rapidement et énergiquement dès que la coagulation s’est effectuée, il risque de passer inaperçu; avec un peu d'habitude cependant, on est averti de l’imminence de la coagulation par une modification de la transparence du plasma, qu'on peut rendre plus objective en teintant l’eau du cristallisoir avec quelques gouttes d’un colorant tel que le bleu de méthylène. Tous nos temps de coagulation ont été déterminés au moins deux fois et tube par tube.

La sédimentation nous a paru plus lente que Gram ne l'indique, et souvent, au bout de deux heures, elle était insuffisante pour que nous puissions recueillir une quantité suffisante de plasma (1); aussi, dans un certain nombre de cas, nous avons centrifugé légèrement le sang citraté; en utilisant toujours la même centrifugeuse, il est facile d'obtenir par centrifugation des plasmas dont la teneur en cellules est sensiblement la même qu'après sédimentation. Nous avons vérifié, au cours de recherches comparatives, que, si l’on allongeait ainsi légèrement les temps de coagulation, on ne modifiait pas

(1) Cette lenteur de sédimentation n'est pas imputable à une différence d'âge, car nous l'avons observée aussi bien chez les adultes que chez les nourrissons; il est possible qu'elle tienne à une différence de diamètre des tubes utilisés : GRAM n'indique pas les dimensions des tubes où il recueille le sang; nous nous sommes servis de tubes à centrifuger ordinaires.

le sens de leurs variations de tube à tube, point qui, comme nous le verrons, est le plus important.

Voici un exemple qui montre l’action d’une centrifugation de courte durée :

A) Sujet normal. T. C. du sang : 5” 15”.

1° Méthode de Gram avec le plasma obtenu par sédimentation. Tube I (1) : 2745”. — Tube II : 3° — Tube III : 3° 20”. — Tube IV : 4 20.

2° Méthode de Gram avec le plasma obtenu par centrifugation. Tube I : 2° 30”. — Tube IT : 4° 45”. — Tube IL ::5° 30”. —— Tube IV :-7° 15”. La centrifugation de courte durée a donc allongé légèrement les temps de coagulation; on en trouvera un autre exemple dans l'expérience F.

Dans l’expérience suivante, nous avons examiné comparativement un plasma obtenu par courte centrifugation et un plasma centrifugé longuement et à grande vitesse; le premier était trouble et contenait de nombreuses plaquettes, quelques leucocytes et de rares hémates; le deuxième était limpide et l'examen microscopique n’y montrait que de très rares plaquettes. Plus la centnifugation est longue, plus les temps de coagulation sont prolongés.

B) Sujet normal. T. C. du sang : 4 30”.

1° Plasma soumis à une courte centrifugation :

(1) Le tube I est celui qui contient 9 gouttes de solution salée et une goutte de solution calcique; le tube Il, celui qui en

contient 8 ét 2, et ainsi de suite. Lorsque plusieurs déterminations ont donné des chiffres différents, nous les indiquons.

Tube I : 2° 20”, Tube II : 3° 45”. — Tube III : 5° 15”: Tube:1V::10° 30”: 11° 15”;

2° Plasma soumis à une centrifugation énergique : Hubel3:330".— Tube II : 4 45°: 5° 45, — Tube III No = Tube IV:: 33:35".

(Dans le tube IV, la coagulation ne s’est pas faite d'une manière « explosive » ; elle n’a guère été complète que 3° après l'apparition des premiers filaments de

fibrine).

Ces deux premières expériences nous mettent à même de constater que le temps de coagulation des plasmas citratés va en augmentant à mesure que ceux-ci sont plus riches en calcium; il s’agit 1à d’un fait indiscutable que . nous avons observé constamment, dans de multiples expériences, aussi bien avec le plasma de sédimentation qu'avec le plasma de centrifugation, toute question de degré mise à part. Il nous semble donc impossible d’employer ce procédé pour déterminer la coagulabilité car il n’y a aucune raison d'adopter le temps d’un tube plus que celui d’un autre. Il en serait tout autrement si le temps de coagulation minimum s’observait tantôt dans un tube, tantôt dans un autre, mais, répétons-le, le temps de coagulation le plus court est toujours celui du tube I, et les temps de coagulation vont en croissant régulièrement à partir de ce premier tube; le fait apparaît encore plus nettement lorsqu'on ajoute aux quatre tubes de Gram les tubes 5 et 6 contenant, le premier 5 gouttes de

ME

solution salée et 5 gouttes’ de solution calcique, le deuxième 4 et 6 gouttes des mêmes solutions.

C) Sujet atteint de Mal de Pott. T.C. du sang : 8’ Tube E :-1” 45”. — Tube II : 3° 15°’. — Tube III : 415”. — Tube IV : 5° 15”; 6° 50”; 7°. — Tube V : 19°; 25”. — Tube VI : Au bout d’une heure, il n'y a encore qu'un mince filament de fibrine; douze heu-

res après, la coagulation est complète.

D'autre part, lorsqu'on multiplie les mesures pour une même proportion de CaCÏ et de NaCI], on constate souvent des différences appréciables entre les chiffres obtenus; ceci est surtout net pour les temps de coagulation élevés des tubes riches en calcium, mais peut s’observer même dans le premier tube.

Enfin, une autre cause d'erreur peut provenir du temps que l’on met à stabiliser le sang; en effet, si on stabilise avec un certain intervalle deux parties d’un même sang, on voit que les plasmas coagulent parfois dans le même temps mais il arrive que le plasma provenant du sang citraté le dernier, coagule plus vite que l’autre ou inversement.

D) Sujet normal T. C. du sang : 5’.

1° Plasma du sang citraté immédiatement : Tube TERRA OA TS ST Fibres 6080 Tube 746104 10% = Puel" 525208

2° Plasma du sang citraté 2° plus tard : Tube I : 2:10”:2 10% Tube ES I0 ESS 0 Eee I: :420 50 be Ve 5607 652307