B) RÉSULTATS ET OBSERVATIONS CYTOLOGIQUES

Pour mieux étudier la cytologie des corynébactéries et leurs corpuscules métachromatiques, c'est en préparations fraîches que nous avons cherché à mettre en évidence toutes les formations de la cellule bactérienne.

Concurremment à la méthode de coloration vitale, décrite plus loin, nous avons utilisé des frottis témoins pour contrôler les résultats obtenus.

A. — TECHNIQUES EMPLOYEEK

4° Colorations sur frottis

Ces frottis ont été traités par le procédé de la double coloration, habituellement pratiqué en bactériologique clinique. |

La fixation au formol a retenu nos préférences ; cette substance chimique immobilise l’état protoplasmique; son rôle de mordant pour aider à la coloration est des plus utiles. On s’en est servi pour mettre en évidence

les granulations contenues à l'intérieur du bacille de Koch (1).

A. Mayer (2) remarque que la « volutine traitée par le formol pendant trente minutes ne se dissout plus dans l’eau bouillante ». Cet avantage est done précieux à cause de l'emploi à chaud du bleu de méthylène.

Des expériences nombreuses et comparatives nous ont confirmé ces indications.

Nos frottis ont done été fixés par le formol pur eommercial à 40 0/0 pendant 20 ou 30 minutes.

Au lieu de la solution acide de bleu de méthylène, nous avons adopté la solution alcaline (3) à 1 % que nous laissons agir immédiatement après le formol et assez longuement après un chauffage léger, Il faut noter que les colorations lentes sont en effet particulièrement propices pour déceler les détails eytologiques,

La vésuvine en solution à 2 %, selon les indications de Debré et Letulle (4), donne une excellente recoloration faisant ressortir la nuance bleu-noir des granulations et la striation zébrée fréquente des bacilles diphtériques.

Pour éprouver la valeur de ce procédé nous l'avons appliqué systématiquement à tous nos frottis et les résultats en ont toujours été concordants et fidèles, soit pour les granulations des Corynébactéries, soit pour les

(4) G. Bior. Assoc. anatomistes, Congrès de Lyon, 1901. — F, ARLOING et R. Bior. Bulletin Société études scientif. sur la tuberculose, juin 1913.

(2) A. MEYER, loc. cit., p. 118.

(3) VAN RovaarT. Zur neisserchen Farbung der Dipht. bacillus, 1901, Centralbl. f. Bakt., t. XXINX.

(4) DEBRÉ et LETULLE, loc, cit. Sp.

2e" TR

corpuscules métachromatiques des levures, du cryptocoque de Rivolta, du bacillus alvei, etc.

Par surcroît, nous avons souvent employé des colorants à composition complexe tel le bleu polychrome.

Toujours après fixation par le formol on laisse agir ce colorant pur pendant deux à trois heures : le temps délicat est la différenciation par l’éther glycérique (3) étendu de 70 à 80 % d'eau distillée. Cette différenciation peut être plus ou moins poussée,

Les granulations se voient en rouge où en mauve, tandis que les bacilles sont incolores; quelquefois on distingue les stries transversales en bleu.

Nous avons déjà dit que les granulations sont suscep-

tibles d'être décelées dans les cellules de levures par la méthode de la double coloration.

D'autre part, en déposant des levures dans une goutte d'eau entre lame et lamelle et en ajoutant une trace de colorant métachromatique (bleu de méthylène, bleu de Nil), on voit apparaître, en rouge, dans la vacuole de ces levures des corpuscules métachromatiques animés de mouvements browniens (1).

On pouvait penser que l’on aurait des résultats analogues avec des bacilles diphtériques traités par la coloration vitale.

Avant d'exposer les résultats obtenus, il nous semble utile de donner quelques indications sur la métachromasie afin d'en mieux étudier les phénomènes.

(3) Voir dans le précis de microscopie, M. LANGERON, 1916, p. 442, les indications techniques de ce réactif,

(1) GUILLIERMOND. Les levures. O. DoIN, p. 74.

Ÿ Métachromasie à

Lorsque, pour colorer des éléments eellulaires où des microbes, on se sert de certaines Substances chimiques, °n constate que toutes les parties de ces éléments n'apparaissent pas avec la même teinte : par exemple, les unes seront rouges avec un colorant bleu, les autres jaune-orange avec un colorant rouge,

On dit alors qu'il y à métachromasie.

Ce changement de couleur se manifeste au contact de substances que l'on appelle chromotropes ou plus ondinairement métachromatiques (2).

Prenant (3) définit la meétachromeasie comme le pro priété de se colorer dans un lon différent de celui que donne habituellement le réactif calorant.

Pour Ehrlich. la métachromesie consiste dans le fait qu'un corps chimiquement défini colere différents &smenis avec des nuances différentes. ,

Parmi les colorants métachromatiques que l'on eppose aux colorants orthochromatiques On peut eîter : le rouge neutre, les bleus de méthyriène, de tolukiine. de Nil, la thionine et le violet de méthyle.

S Substances chimiques sont des Si solubles dans l'eau et facilement dissociables, d'une Part en une base de nuance différente insoluble dans l'eau mais Roluble dans les graisses et leurs Solvants, d'autre Part en un acide incolore.

Aussi, d'après Hensen. la métachromasie serait expli-

@) M. Lancenox, doe. cütat.

B) Prexanr. Néthoëes et TMS & kR mire. DR TA de landiomie et &e le Dhysiol. SR Le ;

quée chimiquement par la mise en liberté des molécules de la couleur basique et ces molécules seraient fixés par certaines substances, parmi lesquelles il est intéressant pour nous de noter les lipoïdes et les acides gras.

Prenons l'exemple du bleu de Nil : œtte matière colorante forme une solution aqueuse bleue; la teinte rouge de la base est alors masquée. Mais, si une substance alcaline déplace cette base, on peut aussitôt la mettre en évidence par un solvant approprié.

Dans trois tubes, A, B, C, on met une solution aqueuse de bleu de Nil et, après avoir alcalinisé très légèrement avec une trace de soude, on ajoute en A de l’éther, en B du chloroforme, en C, de l'huile végétale,

On obtient, après agitation : à la surface du premier tube une couche d’éther en rouge; au fond du deuxième tube le chloroforme aussi en rouge; enfin, l'huile du troisième tube reste encore rouge, au-dessus de la solution aqueuse demeurée bleue, là comme dans les autres tubes.

Nous avons pu réaliser d’une autre manière l'expérience précédente due à Giemsa.

Un sac de collodion (pareil à ceux qu'on utilise pour les cultures intrapéritonéales), est rempli de chloroforme; on le met dans une solution de bleu de Nil Jégérement alcalinisée, ou inversement, une éprouvette pleine de chloroforme reçoit un sac de collodion contenant du bleu de Nil.

* Le colorant imprègne d’abord la membrane cellulosique et, suivant la rapidité de l’osmose, le chloroforme se teinte en rose, puis en rouge.

Ces exemples permettent de voir in vitro l'action des colorants métachromatiques, dont les propriétés (virage, dissociation par base ou acide, solubilité plus où moins grande dans divers liquides) rendent très étendue et très variée la gamme des teintes possibles.

On conçoit alors comment ces colorants peuvent servir de réactifs, de détecteurs optiques, des détails cytoplasmiques de la cellule bactérienne vivante, détails qui, sans eux, passeraient inaperçus.

3° Colorations vitales

Nakanishi (1) et, avant lui, Bizzozero, avaient employé du bleu de méthylène dilué en traces très faibles dans du liquide d’ascite, du sérum sanguin, ou même le propre milieu où le microbe s'était développé.

D'après l’auteur japonais, la coloration, d’abord un peu diffuse, se différencie graduellement. Nakanishi ne semble pas avoir noté d'une manière aussi précise que Rowland (2) la teinte rouge feu des granulations.

Le phénomène de la métachromasie a un intérêt particulier chez la cellule vivante, mais, avant de pouvoir appliquer la coloration vitale aux bacilles diphtériques, il était nécessaire d'adapter la technique à des conditions physiologiques et, pour cela

a) de régler la tonicité de la solution colorante sur celle du milieu de culture ;

b) de s'assurer de l'innocuité de la substance chimique vis-à-vis de la cellule bactérienne.

(4) Nakxanisn1, loc. cit.

(2) RowLanD. Transactions of the Jenner Institute of preventiv medicine, 1899, 2me série.

Re.

a) Conditions de tonicité relatives

1° On met en suspension une parcelle de culture de bacilles diphtériques dans divers liquides : soit dans du sérum physiologique à 9 0/00du sérum sanguin de cheval normal, du bouillon ordinaire peptoné, soit dans les mêmes liquides étendus plus ou moins d'eau distillée, soit encore dans de l’eau de condensation des cultures solides, ou simplement de l’eau distillée.

On réalise la coloration vitale en ajoutant à la lamelle qui doit recouvrir la goutte de liquide, des traces de solution étendue et alcaline de bleu de Nil, traces si faibles que, par transparence, la teinte du milieu soit à peine perceptible. Après un temps variant de deux à dix minutes, les bacilles apparaissent colorés en bleu très clair, tandis que les granulations ont déjà pris la teinte rose, rouge, mauve ou violette. — Ces colorations dans les conditions optima, persistent assez longtemps, une heure environ.

2 Culture de vingt-quatre heures, en bouillon (bacilles diphtériques vrais), mise en suspension dans l'eau distillée.

Coloration longue à apparaître (10°), teinte rose élective des granulations, tandis que le corps bacillaire reste diaphane ou légèrement teint en bleu; les granulations semblent se gonfler et leurs dimensions débordent celles des bacilles.

3 Culture de vingt-quatre heures, en bouillon, mise en suspension dans de l’eau salée à 9 0/00 .… Coloration rapide, élective et presque immédiate des granula-

RE en

tions qui semblent se contracter; leur teinte rouge s'accentue et vire bientôt au rouge Bordeaux.

4° Culture en milieu solide (milieu Costa saccharosé), en suspension dans l’eau de condensation qu tube, -— Les granulations apparaissent en une où deux minutes au plus, avec leur teinte métachromatique : si l'on a fait en sorte que les bacilles soient adhérents à la lame de verre, on peut spécialement bien étudier leur cytoplasme.

Il résulte de ces observations que, pour les cultures solides, le meilleur milieu de coloration est l’eau de condensation du tube de culture, liquide qui offre entre autres l'avantage d'être à la même température que les bacilles sortant de l'étuve.

Pour les cultures liquides, il est préférable de diluer du sérum physiologique avec 50 0/0 d’eau distillée.

B. -— Action du colorant sur la vitalité des bacilles.

La durée des observations faites en coloration vitale permettait de penser que les substances chimiques employées, même à l'état de traces, ne pouvaient pas être nocives pour la vitalité des bacilles.

Les expériences suivantes ont vérifié cette hypothèse:

1° Une culture en bouillon ordinaire, teinté faiblement de bleu de Nil, se développe normalement; après treize jours, un repiquage en bouillon donne au bout de vingt-quatre heures un trouble homogène et des bacilles normaux.

2 Une goutte de sérum physiologique dilué et additionné de bouillon, est teintée par des traces de bleu de

Um CPR TE

Nil : on y dépose des bacilles diphtériques et on met le tout en suspension dans une cellule de Bôttcher. Après avoir vérifié au microscope la métachromasie des granulations, on met à l’étuve la cellule de Bôttcher pendant cinq heures.

Au bout de ce temps, on fait des ensemencements avec la goutte sur du sérum coagulé.

Les résultats ne sont positifs qu'au bout de quarantehuit heures, mais, dès lors, le développement des cultures est régulier et les colonies sont composées de bacilles dont la forme, les dispositions, les affinités tinctoriales sont normales.

Nous verrons plus loin comment l’on pourrait commenter ces phénomènes de coloration vitale : nous devons maintenant esquisser différents {ypes observés à l’aide de cette méthode, et analyser divers détails cytologiques des corynebactéries diphtériques.

B. — Résultats et observations cytologiques

On sait que sur les frottis, les corpuscules métachromatiques des bacilles diphtériques se présentent sous la forme de masses ovalaires ou rondes, situées habituellement aux extrémités du microbe (granulations polaires), quelquefois au milieu et même, chez certains individus, elles forment comme une théorie dans le cytoplasme.

En coloration vitale, on retrouve ces dispositions classiques, mais avec la teinte métachromatiqu# dont la nuance peut se modifier plus ou moins au cours de

l'examen.

Alors que, dans les cellules de levures, on voit ces corpuscules métachromatiques animés de mouvements browniens, grossir, se fusionner, puis changer de teinte en s'accolant comme une coiffe à la paroi de la vaeuole, on ne remarque, chez les baeilles diphtériques, que la couleur, la disposition et la forme spéciale de ces granulations, le plus ordinairement immobiles.

Cependant, il est possible de surprendre, chez certaines formes d'involution, des mouvements browniens des granulations, situées alors dans des renflements en spatule : mais ce sont là, pour ainsi dire, des trouvailles de micrographie, et le plus souvent on ne distingue, dans ces crosses terminales, que des zûnes bieues figurant comme un accent cireonflexe contre les parois.

Ces formes d'involution sont celles qui se prêtent le mieux à l'observation cytologique. On les trouve faeilement dans les cultures de bacilles diphtériques vrais, développés sur un milieu dysgénésique, comme le milieu Costa saccharosé (1). On peut alors rencontrer les aspects les plus polymorphes, des formes en raquette, en battant de eloche, des masses rondes, des filaments ramifiés avec des renflements el des appendices plus ou moins longs et grèles, des éléments contournés et paraissant aplatis. Chez la plupart, on retrouve des granulations, mais elles présentent des dimensions relativement grandes (0 & 7) dans les crosses terminales (1 « de diamètre environ), ces crosses semblent avoir une paroi assez épaisse et, laté-

(4) Voir microphotographie, pl, I, 1.

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ralement, elles offrent quelquefois un ou deux prolongements assez courts et minces.

Nous verrons plus lard la capacité de résistance de ces formations.

On voit parfois aussi les bacilles en spatules s'articuler avec d'autres éléments moins larges el ramifiés cet aspect rappelle celui d’un mycélium.

Une culture de B. culis commune développée en voile, nous a permis de voir, en coloration vilale, des bacilles assez larges el de dimensions moyennes. Un des bacilles observés avait à un pôle une granulation ronde, teintée en bleu, tandis qu'au milieu, on distinguait des formations discoïdes en rouge. .

Au bout de quelques minutes, ces dernières se fusionnaient et confluaient à l’autre pôle en une masse ovalaire bleue.

Chez d'autres éléments, en forme de massue très large, on voyait de petites granulations se réunir peu à peu.

Chez les bacilles diphtériques de formes typiques, les corpuscules mélachromatiques donnent des teintes métachromatiques très nettes et l’on peut ainsi voir très clairement leur disposition, mais on ne note chez ces formes aucune autre particularité.

D'autres bacilles que les Corynébactéries donnent des colorations semblables, avec les mêmes procédés.

Le bacille de la Loque({)(Bacillus alvei) présente les mêmes réactions tinctoriales que les bacilles diphté-

riques, mais on n'observe pas chez lui des formes aussi

(4) Maladie des abeilles.

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