À MON PRÉSIDENT DE THÈSE

MONSIEUR LE PROFESSEUR DEBRE Professeur à la Faculté de Médecine de Paris

Pour le grand honneur qu’il nous a fait en acceptant la présidence de cette thèse.

Hommage respectueux.

Je tiens à remercier ici le Docteur Ph. GONZALES, Professeur de Bactériologie à l’Université de Santiago du Chili, qui a bien voulu, pendant son séjour à l’Institut Pasteur, me faire bénéficier de ses conseils et de son excellente technique.

Je remercie aussi M. Paul Du- CREST, du Laboratoire du Docteur E. WoLLMAN, qui m'a beaucoup aidé dans l’exécution matérielle de ce travail.

RECHERCHES EXPERIMENTALES SUR LA VALEUR IMMUNISANTE DES LYSATS BACTERIOPHAGIQUES

L'idée de protéger l’homme et les animaux de certaines maladies infectieuses hantait les esprits depuis les époques les plus reculées. C’est ainsi que depuis les premiers siècles en Chine, au Japon, aux Indes on procédait à la variolisation, c’est-à-dire à l’inoculation de la variole dans le but d’obtenir une infection atténuée. On employait des croûtes de varioleux desséchées.

Cette méthode fut introduite au xvur siècle en Angleterre par Lady MonraGu. Elle fut pratiquée en Europe occidentale pendant un temps assez court. De même chez les animaux on pratiquait la clavelisation des moutons, l’inoculation du virus péri-pneumonique aux bovidés. Ces procédés, acceptables, à la rigueur, en temps d’épidémies graves, présentaient de sérieux inconvénients et étaient absolument inutilisables, surtout chez l’homme, en tant que méthodes préventives. Il pouvait se produire une généralisation et l’issue mortelle de l’infection ainsi provoquée était toujours possible, le produit n'étant ni dosé ni fixé. Une mé-

thode d’inoculation préventive ne pouvait entrer dans la pratique qu’à condition d’être inoffensive en méme temps qu’efficace. Le premier exemple en a été fourni par la vaccination jennerienne, dont l’agent ne détermine pas une infection mortelle même à dose élevée.

Lorsqu'on peut pour un agent donné déterminer la dose minima mortelle on a recours à une quantité qui produit encore un effet morbide. C’est ainsi que FERRAN (Espagnol) vaccine des cobayes avec du Vibrion cholérique vivant (en bouillon) en injection sous-cutanée et les protège contre une dose mortelle. Il étend sa méthode à l’homme en injectant des cultures vivantes de Vibrion cholérique additionnées de bile. Cette méthode a été perfectionnée par HAFFKINE chez l’homme également, en procédant suivant les méthodes de la vaccination pasteurienne, c’est-à-dire en employant comme premier vaccin un vibrion atténué.

Déjà en 1776, SUTTON et FEWSTER avaient observé que les gens ayant contracté au contact des lésions des bovidés, le cow-pox, maladie propre à ces ruminants, étaient devenus réfractaires à la variole.

Mais c’est à JENNER (1798), que l’on doit la preuve irréfutable de ce fait: Le cow-pox protège contre la variole.

C’est la naissance d’une méthode préventive importante, la vaccination. Toutefois cette méthode était purement empirique et ce n’est qu’avec l’ère pasteu-

rienne que les inoculations préventives au moyen de

virus atténués ont été établies sur une base scientifique.

L'exemple de la vaccine montre qu’il existe dans la nature des virus atténués dont l’inoculation protège contre la maladie grave ou même mortelle. Ne pourrait-on pas expérimentalement modifier la virulence d’autres agents de manière à conférer à l’homme et aux animaux une maladie atténuée qui leur permettrait ensuite de résister à l'infection grave ? Tel est le problème que s’est posé Pasteur. Il employa différentes méthodes d’atténuation :

Chaleur pour le charbon en faisant des cultures à une température de 42° à 43° ; vieillissement pour le choléra des poules; passages sur espèces animales différentes pour le bacille du rouget; dessiccation pour le virus rabique (dans ce cas il ne s’agissait probablement pas tant d’une modification de la virulence que de celle du nombre d’éléments virulents). Les agents les plus différents furent par la suite mis en jeu, dans les essais d’atténuation : l’alcool pour le vaccin antipesteux, les passages sur des milieux artificiels, tel que la pomme de terre glycérinée et biliée pour la préparation du BCG.

La méthode des virus atténués était une acquisition dont l'importance ne saurait être mesurée. C’est à elle que nous devons encore actuellement les moyens les plus efficaces de vaccination. Cependant appliquée à l’homme elle n’est pas sans inconvénients. Le virus atténué donc vivant encore, pouvait être réactivé. (Ce problème s’est posé récemment au sujet du BCG). Aussi Roux et CHAMBERLAND (Annales de l’Institut Pas-

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teur 1887-1888) ont recours aux bactéries mortes. Les germes sont tués soit par la chaleur (vaccination antityphique, antipesteuse (HAFFKINE), anticholérique (KOLLE et PFEIFFER) ; soit par des antiseptiques : alcool, éther, iode. Dans le cas du bacille typhique, PFEIFFER et KoLce inoculent des bacilles morts et voient apparaitre des agglutinines dans le sang des sujets inoculés.

Généralement on confère avec les microbes tués un degré d’immunité inférieur à celui atteint dans les conditions vaturelles, c’est-à-dire par la maladie spontanee, ou même par les vaccins vivants. Des expériences (PÉDRONE, SHOUKEVITCH) montrent que des animaux vaccinés avec des cultures vivantes (bacille typhique, suipesticus) produisent des anticorps plus abondants (bacille typhique) ou différents de ceux qu'on obtient avec des bacilles tués.

Aïnsi dans les expériences de SHOUKEVITCH le sérum des premiers était anti-infectieux, mais ne contenait pas d’anticorps décelables in vitro, tandis que l’inverse se produisait pour les animaux vaccinés avec des bacilles tués.

Quoi qu’il en soit, il découle de ces essais que l’introduction de corps microbiens vivants ou morts dans l'organisme déclanche chez celui-ci la production d'anticorps.

On pensa alors à utiliser, pour produire l’immunisation, non plus les corps microbiens eux-mêmes, mais des extraits bactériens. Ces essais eurent pour origine la constatation que dans de nombreux cas l’antigène immunisant semblait lié au protoplasme microbien. On ne le retrouvait pas dans les filtrats de cultures

jeunes en bouillon. D’où l’idée d’extraire le principe immunisant.

Ces expériences se sont heurtées à de nombreuses difficultés. Dans certains cas les extraits bactériens sont toxiques. Ils provoquent les lésions ou les troubles produits par les corps bactériens eux-mêmes et qu’on avait espéré éviter (bacille dysentérique Shiga). D’autre part, les antigènes actifs se sont souvent montré être très labiles, de sorte qu’ils étaient détruits lors de l'extraction.

On a eu recours à différents modes d’extraction, à partir de cultures jeunes, ainsi que de cultures âgées. I. par autolyse : extraction de substances toxiques des bacilles typhiques (VINCENT) et dysentériques (CONRADI), du vibrion cholérique (SALIMBENI). 2. Par l’action de substances chimiques, alcalis, acides, antiformine, savons, glycérine. Parmi les produits extraits par cette dernière méthode, il faut citer la tuberculine de Koch. — 3. Par l’action de diastases (GOLTSTEIN). On a pu ainsi obtenir des antigènes actifs à partir du bacille typhique et du vibrion cholérique. — 4, Par destruction mécanique : broyage, pression. Ainsi que nous l’avons rappelé plus haut, c’est l’introduction des corps microbiens qui déclanche une réaction de la part de l’organisme. N’y aurait-il pas avantage à introduire dans l’organisme non plus les corps microbiens entiers, mais sous une forme plus simple, à un certain stade de désintégration.

Déjà en 1932, ARLOING et Durour recherchèrent la variation du pouvoir vaccinant des protéines microbiennes suivant leur stade de dégradation. Ils con-

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cluaient après avoir expérimenté sur des cobayes avec du Pneumobacille et du B. coli, que le pouvoir immunisant des corps microbiens est surtout lié aux protéines constitutives et que ce pouvoir s'éteint graduellement à mesure que ces protéines se dégradent.

Parmi les procédés qu’on pouvait employer pour obtenir des produits bactériens, il nous avait paru intéressant d'étudier, sur la suggestion de E. WoLLMAN, la lyse bactériophagique. On doit la découverte de ce phénomène à TwWoRT et d'HÉRELLE. C’est en ensemençant de la lymphe vaccinale glycérinée sur de la gélose inclinée que TWORT remarqua l’apparition parmi les colonies de staphylocoques de plages vitreuses. Il suffit de toucher une jeune colonie de staphylocoques avec une aiguille ayant été en contact avec une de ces plages vitreuses pour qu’elle subisse la même transformation. Le phénomène se reproduit encore avec une suspension de substance vitreuse filtrée sur bougie. Le travail de TWoRT passa inaperçu et c’est d’HÉRELLE qui, en 1917, attira vraiment l’attention sur le phénomène de la bactériophagie. En ensemençant dans du bouillon des selles de convalescent de dysenterie et en filtrant la culture obtenue, il s’aperçoit qu’une goutte de ce filtrat lyse une culture fraiche de bacille Shiga. Pour d’'HÉRELLE, l’agent actif est un virus parasite des bactéries et qui en détermine la lyse. Il lui donna le nom de Bactériophage. (Protobios bacteriophagus, syn. Bacteriophagum intestinale, d'HÉRELLE.)

Depuis, de très nombreux travaux ont été consacrés à cette question. Il en découle que le bactério-

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phage présente une structure corpusculaire ou mieux discontinue (d'HÉRELLE), traverse les filtres bactériens (TwWorT, d'HÉRELLE) et les filtres de collodion (d’Hé- RELLE, WOLLMAN), ne se sédimente pas de façon notable (BORDET, WoLLMAN). Il est inactivé entre 60° et 75° (TWORT, d'HÉRELLE). Il est très résistant à certains antiseptiques, présente des fonctions antigéniques spécifiques, fonctions antigéniques qui ne préexistent pas chez les bactéries normales. Il présente les caractères de la substance vivante, assimilation, faculté d'adaptation, constance de caractères après passage sur des espèces microbiennes différentes.

Sous l’influene du bactériophage les bactéries subissent des modifications dont la principale est la lyse indéfiniment transmissible. Le bactériophage se reproduit aux dépens de bactéries vivantes en voie de multiplication. (BORDET, WOLLMAN).

Plusieurs théories ont été proposées quant à la nature du bactériophage. Aucune jusqu'ici ne peut être considérée comme définitivement acquise.

Pour d’'HÉRELLE, ce serait « un organisme vivant parasite obligé des bactéries : c’est un ultravirus parasite des bactéries ». Cependant, le bactériophage présente vis-à-vis de certains antiseptiques une résistance très supérieure à celle des virus. On peut le trouver dans des milieux septiques où la bactérie sensible est elle-même absente. D’autre part, la multiplication des bactériophages exige la présence de bactéries non seulement vivantes, mais en voie de multiplication. Ils peuvent apparaître dans des cultures qui pendant des générations paraissaient en être

exemptes.

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A côté de la théorie parasitaire prennent place les théories diastasiques, d’après lesquelles la bactériophagie serait une autolyse transmissible (Bor- DET et CIUCA, OTTO, GILDEMEISTER, etc.). On a assimilé ainsi les bactériophages à des diastases autolytiques ou autolysines. Cette façon de voir se heurte elle aussi à de graves difficultés. En effet : l’autolyse n’est pas inhibée par les sérums antibactériophages et pice versa la bactériophagie n’est pas inhibée par les sérums anti-autolysats (WoLLMAN et DURAN REYNALS). Les souches (de staphylocoques) rendues résistantes au bactériophage ne le sont pas à l’autolyse et même peuvent être plus facilement autolysables que les souches normales (WoLLMaAN). La théorie diastasique ne rend pas compte des propriétés de matières vivantes que possèdent les bactériophages. Elle ne peut expliquer pourquoi un ferment n’agirait que sur des bactéries en voie de multiplication (WoLLMaw). Enfin, des recherches récentes sur l’action des ultra-pressions (Mme WoLLMAN, BASSET et MACHEBŒUF) montrent que les bactériophages se comportent sous ce rapport tout autrement que les diastases.

Depuis les travaux de MENDEL, on sait que de nombreux caractères héréditaires sont transmis suivant un mode permettant de conclure qu’ils sont liés à des supports matériels. En admettant que les supports matériels de certains caractères sont d’une constitution physico-chimique assez simple et stable pour ne pas se détruire dans le milieu extérieur, on expliquerait très simplement et d’une façon satisfaisante les phénomènes qui se déroulent au cours de la bacté-

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riophagie (WoLLMAN). La variation héréditaire consisterait ici dans une rupture d’équilibre entre les activités anaboliques et cataboliques de la cellule, dans une « viciation nutritive » (BORDET et Ciuca) dont l’aboutissant est la lyse. Cette théorie a le grand avantage d’expliquer l’ensemble des faits qui ne pouvait l'être ni par les théories parasitaires, ni par les théories diastasiques à savoir : l'indépendance des propriétés des bactériophages de celles des bactéries de passage ; leur reproduction liée à celle des microbes, leur pouvoir antigénique propre, leur reproduction indéfinie en série.

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Les conceptions suggérées par les recherches sur la bactériophagie dépassent du reste le cadre de ce phénomène pour s’étendre à d’autres processus attribués jusqu'ici à des ultra virus.

Il nous faut retenir pour le moment que la découverte des bactériophages met à notre disposition un moyen nouveau et particulièrement efficace pour produire la lyse des bactéries jeunes.

Deux cas sont à envisager : 1) la culture se fait sur milieu solide. L’addition de bactériophage à une telle culture aura pour effet de produire dans la nappe bactérienne qui se développe autant de plages de lyse, de « taches » qu’il a été ajouté de corpuscules bactériophages. Lorsque le nombre de ceux-ci augmente, les plages de lyse deviennent confluentes et peuvent recouvrir toute la surface du milieu.

2) La culture se fait en milieu liquide : L’addition de bactériophages en petite quantité n’entrave pas tout d’abord le développement des bactéries. Ce développement peut même être plus intense que celui d’une culture témoin faite dans les mêmes conditions. Après un certain temps, variable avec les quantités de bactériophages ajoutées et, pour une même quantité avec le germe considéré, on voit le milieu s’éclair-

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cir plus ou moins complètement. Avec des bactériophages actifs, des cultures contenant plusieurs milliards de germes par cm3 peuvent devenir tout à fait limpides. L’étude microscopique de la lyse, faite sur le bacille dysentérique de Shiga, montre les faits suivants : Les bacilles d’abord isolés se réunissent en petits amas ; ces amas deviennent moins réfringents, prennent une forme ovoide, atteignent des dimensions énormes, 10 à 15 u ; leur contenu devient granuleux, les contours s’estompent. Après coloration, les bacilles en voie de lyse prennent mal les colorants au début, puis restent complètement incolores (WoLz- MAN). Ces manifestations microscopiques de la lyse bactérienne se traduisent sur l’échelle macroscopique par les plages sur des milieux solides et par l’éclaircissement des cultures en milieu liquide. Il est important de noter que tous ces phénomènes ne se produisent qu'avec des bactéries en voie de multiplication.

Quelle est la valeur antigénique et les propriétés vaccinantes des lysats obtenus au moyen de bactériophages ? Un certain nombre de travaux ont déjà été consacrés à cette question.

ARLOING, JOSSERAND et NABONNE (Société de Biologie Juillet 1930), étudient le pouvoir antigénique, chez le lapin, des lysats de bacille d’Eberth obtenus avec un bactériophage approprié. Ils obtiennent des sérums agglutinant aux taux de 1/3.000 à 1/10.000 8 jours après la dernière injection. De 21 jours à 30 jours après la dernière injection le pouvoir agglutinant a disparu.

Minau Toyopu (Centralbl. f. Bakt., T. CXIX, 1931)

étudiant la production d’anticorps (agglutinines) chez des animaux préparés par des injections de bacilles typhiques, paratyphiques et Gärtner intacts ou lysés par les bactériophages correspondants, arrive à la conclusion que la bactériophagie n’en modifie pas la constitution antigénique. M. Sardjito (1936) fait des travaux sur l’immunisation contre la dysenterie bacillaire par des bactériolysats de bacille de Shiga au moyen du bactériophage et trouve les réactions sérologiques du sang variables suivant les sujets.

G. G. Mocxa et S. M. K. Mazzicx (Indian Journ. Med. T. XIX, N° 2, 1931) trouvent que si l’on injecte sous la peau du lapin des vibrions cholériques lysés par le bactériophage anti-cholérique, l’animal ne présente aucun trouble et n’est pas immunisé contre l’inoculation ultérieure de vibrion cholérique. D’autre part, l’addition au vaccin de lysat bactériophagique n’en augmente pas le pouvoir antigénique.

Dans ce travail, nous nous sommes proposé de comparer, pour un même germe, les propriétés vaccinantes des lysats bactériens obtenus à partir d’une culture d’une richesse donnée, à celles de suspensions de corps microbiens de même densité. Pour cela, on ensemence avec le germe étudié, dans des conditions rigoureusement identiques, un certain nombre de tubes de bouillon de même contenance. On porte à l’étuve à. 37°. Lorsque l’émulsion présente un certain trouble (variable avec le germe étudié) on additionne la moitié des tubes de bactériophage correspondant, on remet à l’étuve et on suit de près la marche de la lyse dans les tubes additionnés de bactériophage. Dès que