SUR LA NUMÉRATION DES GLOBULES DU SANG

La numération des globules du sang est un problème d'une importance considérable, tant au point de vue physiologique qu'au point de vue clinique. Déjà d'assez nombreuses recherches ont été faites sur ce sujet, mais avant de les passer en revue, rendons-nous compte des éléments du problème à résoudre.

Lorsqu'on examine au microscope une goutte de sang pur, les globules extraordinairement nombreux s'empilent, se superposent et forment des amas confus, de sorte qu'il est matériellement impossible de les distinguer tous les uns des autres et de les compter.

De là résulte la nécessité de diluer le sang, c'est-àdire d'augmenter en quelque sorte la proportion du plasma . On ajoute alors au sang un liquide étranger, et il faut que le mélange ainsi obtenu soit aussi homogène que possible, c'est-àdire que la répartition des globules y soit la même dans tous les points. De cette manière, en comptant les globules con-

* Fragment d'une leçon clinique publiée par M. Duperie. {Gazette hcbdomu' daire de médecine ot de chirurgie y n* 19, p. 291, 1875.)

â RECHERCHES SUR l'aNATùMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG,

tenus dans un volume connu du mélange, on peut, par un calcul de proportion, ramener le chiffre trouvé à 1 millimètre cube de sang pur.

Toutes les méthodes employées ont dû se soumettre à ces exigences. Le liquide qui sert à diluer doit altérer le moins possible les globules, et les proportions du mélange doivent être choisies de façon à faciliter les calculs. Il y a autant de formules de liquides que d'expérimentateurs, et les proportions adoptées pour les mélanges sont également trèsvariables. Cette partie du problème offre évidemment des difficultés; mais le point essentiel et le plus important, consiste à faire la numération des globules compris dans le mélange ou dans une de ses parties.

Plusieurs procédés ont été employés ; tous peuvent se rattacher à deux principaux^ suivant que le calcul de proportion se rapporte : l'^aux surfaces; 2'' aux volumes.

C'est à Vierordt (Arch, fur physiologische Heilkunde^ Bd. XI, 1852, et Bd. XIII, 1854) que revient l'honneur d'avoir le premier imaginé une méthode de numération. Nous ne la décrirons que très-sommairement. Le sang, recueilli à Taide d'un tube capillaire bien calibré, est étendu avec une quantité de sérum artificiel toujours la même (679,9 fois celle du sang). Le mélange ainsi obtenu est dilué avec un dixième de solution gommeuse, et repris avec une pipette pour être étalé sur un porte-objet en lignes étroites et. régulières. On le laisse sécher à Tair libre, puis on place la préparation sous le microscope et l'on compte les globules en s'aidant d'une lame micrométrique placée sur le sang desséché.

Welcker (Arch, des Vereins f. ffemein. Arbeiien zu Gôttingen, 1854, t. I, p. 161 et 195; Viertelj. f, prakt. Heilkunde, Prag., 1854, t. XLIV,p. 11) a essayé de perfectionner cette méthode, mais il n'a fait que la modifier sans la rendre plus exacte ni plus expéditive.

En 1865, Mantegazza imagina un procédé très-différent, mais fondé aussi sur un calcul de surfaces. Je crois inutile de le décrire à cause de ses imperfections.

La numération des globules dans un volume déterminé de la dilution fut mise en pratique pour la première fois par un médecin hollandais. Cramer {NederL Lancot, 1855), qui réa-

lisa ainsi un progrès important. L'appareil de Cramer se compose d'une lame porte-objet, sur les bords de laquelle sont collées deux bandes de verre très-minces et partout d'égale épaisseur. Sur ces deux lamelles est placée une autre lame semblable à la première. On a ainsi un espace capillaire de section rectangulaire, ayant pour hauteur l'épaisseur des lamelles. Après avoir déterminé, par une mensuration faite au microscope, le volume de ce capillaire artificiel, Cramer faisait une dilution du sang à l'aide d'eau salée à 1/200, et en se servant de tubes très-bien calibrés. Il faisait ensuite pénétrer par aspiration une partie du mélange dans le capillaire, et en s'aidant d'un oculaire dans lequel était une glace quadrillée il comptait les globules dans un espace d'une étendue déterminée et arrivait, à l'aide d'une formule calculée d'avance, à connaître le chiffre des globules contenus dans 1 millimètre cube de sang.

En 1867, M. Potain inventa un nouveau procédé, que M. Malassez nous a fait connaître récemment. Cet observateur se sert d'un mélangeur spécial qui se compose d'un tube capillaire de verre, présentant sur son trajet, au voisinage de Tune de ses extrémités, une dilatation ampuUaire, dans l'intérieur de laquelle a été placée une petite boule de verre.

Ce tube est gradué de façon à permettre de faire tout d'abord dans la partie dilatée un mélange de sang et de sérum artificiel à 1/100 ou à 1/200, puis, grâce à une manœuvre dont vous pourrez lire la description dans la thèse de M. Malassez, M. Potain fait sortir de son mélangeur de très-petites gouttelettes dont le volume total est déterminé à l'aide des subdivisions du tube capillaire. Ces subdivisions expriment des cinquantièmes de millimètre cube. En comptant alors les globules contenus dans les gouttelettes, on connaît le nombre des globules correspondant à un ou plusieurs cinquantièmes de millimètre cube, et par suite à 1 millimètre cube.

Enfin, M. Malassez (Comptes rendus de F Académie des sciences, décembre 1872, thèse de Paris, 1873) a eu l'idée de fabriquer un appareil ressemblant à un capillaire naturel, c'est-à-dire qu'au capillaire rectangulaire de Cramer il a substitué un capillaire à section elliptique.

Le mélange de sang et de sérum artificiel est fait à Taide

4 RECHEnCHES SUR L'aNATOMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG.

du tube de M. Potain, et une partie en est introduite par aspiration dans le capillaire. Le volume de ce dernier a été calculé d^avance, et à l'aide d'un oculaire quadrillé et d'une formule spéciale, il est facile de rapporter le nombre des globules contenus dans une section du tube au millimètre cube de sang.

Je mets sous vos yeux l'appareil de M. Malassez et le mélangeur de M. Potain, et il vous sera facile, connaissant bien maintenant les éléments du problème, de vous rendre compte de la manière dont il a été résolu par ces deux observateurs.

Messieurs, toutes ces méthodes ont soulevé des critiques.

Celle de Vierordt est d'une exécution très-difficile, de plus elle demande de deux à six heures par numération. Rien d'étonnant donc si elle ne s'est pas vulgarisée. Le procédé de M. Potain est supérieur, mais il exige, outre beaucoup de temps, une habitude et surtout une habileté de main qu'il n'est pas donné à tout le monde de posséder.

La méthode de Cramer paraît, au premier abord, plus simple et plus exacte; mais elle est restée peu connue et s'est peu répandue, probablement parce que la construction de l'appareil a paru compliquée et imparfaite, et que Cramer est mort avant d'avoir pu vulgariser son procédé et l'étudier suffisamment pour y apporter les modifications qu'il réclamait.

Aussi M. Malassez a-t-il rendu un véritable service en reprenant l'étude de cette question et en proposant un nouveau tube capillaire. Je ne crois pas cependant que le principe sur lequel reposent ces deux derniers procédés soit exact. Outre les difficultés que doit présenter le jaugeage précis d'un espace capillaire très-petit, je me suis assuré par des expériences comparatives que tout appareil se remplissant par capillarité conduit à des résultats erronés. Le mélange sanguin est composé d'une partie liquide et de corps solides en suspension dans ce liquide. Placé à l'extrémité d'un espace capillaire, il y pénètre inégalement, la partie liquide s'introduisant dans l'espace capillaire plus facilement que les parties solides. L'introduction d'une partie du mélange dans le tube détruit donc l'homogénéité de la repartition des globules.

REGHEHCHHs SUR l'aNATOMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG. 5

De plus, les parois elles-mêmes de Tespace capillaire repoussent les globules du sang, et il se forme une sorte de zone claire, analogue à celle qui existe dans les capillaires naturels. Il en résulte, qu'en calculant le nombre des globules d'après celui que contient un segment du capillaire, on ne peut arriver à un chiffre exact.

On peut donc dire que, malgré des essais fort ingénieux, la numération des globules du sang n'a pas encore été exécutée d'une manière pratique et correcte. Ces considérations nous ont déterminés, M. Nachetet moi, à reprendre l'étude de cette question ^ .

Le but que devait se proposer tout expérimentateur, et que nous avons essayé d'atteindre, était de trouver un appareil simple, facile à manier et fondé sur un principe exact.

Le mélange du sang étant fait d'une manière aussi homogène que possible, il fallait en circonscrire un volume mathématiquement déterminé sans modifier, par les manœuvres de la préparation, la répartition des globules.

A l'aide de la petite cellule que je vais vous présenter, nous croyons être arrivés d'une manière extrêmement simple à un résultat satisfaisanL

Notre cellule {fi(j. i ) est formée par une lamelle de verre

Fig. 1.

mince, perforée à son centre (de manière à présenter un trou d'environ 1 cent, de diamètre) et collée sur une lame de verre porte-objet parfaitement plane. Cette lamelle de verre ayant été amincie d'une quantité déterminée à l'aide du sphéromèlre, on a ainsi une cavité dont la hauteur est mathématiquement connue. La hauteur que nous avons choisie est celle de 1/5 de millimètre ^

i G. Hayem et A. Nachet, Sur un nouveau procédé pour compter les globules du sang. Comptes rendus de l' Académie des sciences, 26 avril 1875. 2 On peut utiliser cette cellule pour faire la numération des éléments figurés

T FATHOLOGrUL'B DU f*NG.

En déposant au centre de la- cellule une goutte du mélange sanguin et en la recouvrant immédiatement par une lamelle de verre très-plane qui vient reposer sur les bords de la cellule, on obtient ainsi une lame de liquide à surfaces parallèles, dont l'épaisseur est d'un cinquième de millimètre.

Si l'on a soin de placer la goutte de liquide à examiner au milieu de la cellule et de faire en sorte que celte goutte aplatie par la lamelle ne puisse remplir qu'une partie de la cavité cellulaire, on obtiendra une lame liquide, entourée d'un anneau d'air complet, et on n'aura pas à craindre le soulèvementde la petite lamelle par une quantité surabondante de liquide

Il ne reste plus qu'à compter les globules dans un certain espace mesure par un oculaire quadrillé.

Voici d'ailleurs la manière dont on opère. Pour faire le mélange, nous nous servons de deux pipettes graduées, une pour le sang, une autre pour le sérum; on pourlait également se servir du mélangeur de M. Potain. La pipette destinée au sérum porte des divisions qui pei mettent de prendre à volonté 100, 150, 200, 250, 300, 400 et 500 millimètres cubes de liquide.

On en prend par exemple 500 millimètres cubes (ftij. 2, A).

Le sérum dont on se sert est loin d'être indifférent. Il doit, avonsnous dit, conserver aux j

tenuâ en suspensions dans un liquide quelconque, el donner hauteur qui convient le mieux nu but que l'on poursuit. Api essais comparetifs avec des cellules de hauteurs diverses, not que la liauleur du 1/5 de mililiiiêtre est la plus commode po dos globules du sang. M. Bouchul a choisi, su contraire, . pourTosamen du lait [Comptes rendus de l'Acsdûaiie des 1877). et nous-mêmes nous nous servons d'une cellule numération dos hÉmsIoblestes de l'homme otdes anima

■ la numération

leur aspect physiologique et permettre, de plus, une dissémination des globules aussi parfaite que possible. Après avoir fait un grand nombre d'essais, j'ai été conduit à rejeter les diverses formules qui ont été proposées pour la fabrication des sérums artificiels, et je préfère les sérosités naturelles ou pathologiques.

Le sérum iodé de M. Schullze, qui est préparé, comme vous le savez, avec le liquide amniotique de la vache, permet de faire un mélange très-homogène; mais il altère un peu les globules et ne peut convenir que lorsqu'on ne tient pas à prendre en même temps le diamètre de ces éléments. Le liquide qui m'a donné les meilleurs résultats à cet égard est celui que j'ai obtenu par une ponction chez un malade atteint d'hydropneumothorax. C'est un liquide très-riche en albumine, ne contenant que des traces de fibrine et dont la densité est de 1019.

Je suis persuadé que la sérosité de l'ascite, que tout médecin peut se procurer facilement, fournirait également un excellent véhicule ^ .

Le sérum aspiré par la pipette, qui a été graduée de façon •à tenir compte du mouillage du verre, est déposé avec soin dans une petite éprouvette.

C'est alors qu'on prend le sang.

Quand on étudie le sang de Thommo à l'état physiologique ou dans les maladies, on l'emprunte à la pulpe de l'un des doigts, partie très-vasculaire, sur laquelle il est facile d'opérer. Mais la manière de prendre le sang mérite de fixer toute votre attention. On emploie communément un procédé qui consiste à piquer avec une aiguille l'extrémité du doigt préalablement entouré d'un lien enroulé à la base de la première phalange. On obtient ainsi un liquide qui diffère notablement du sang capillaire .physiologique et qui , dans des numérations successives faites chez la même personne donne des résultats non concordants. On évite cette cause d'erreur en faisant, à l'aide de la pointe d'une lancette, sur le doigt libre, une petite plaie suffisante pour laisser échapper quel-

* Le liquide de l'ascite ne donne pas de meilleurs résultats que le sérum iodé, et il à l'inconvénient de s'altérer très-rapidement.

8 RECHERCHES SUR l'aNATOMIE NORUALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG.

ques gouttes de sang dès qu'on exerce la plus légère pression sur la pulpe. Des recherches comparatives m*ont démontré rimportance de cette manière d'opérer. La petite plaie faite par la lancette est d'ailleurs tout aussi inoffensive que la piqûre d'une aiguille.

L'aspiration d'une quantité déterminée du sang se fait à l'aide d'une pipette parfaitement calibrée et graduée, qui ressemble à celle de M. Potain (%. 2, B).

Les divisions que porte le tube permettent de prendre 2 millimètres cubes, 2'""',5, 3, 4 ou 5 millimètres cubes de sang. Supposons qu'on en prenne 2 millimètres cubes. En les portant dans la petite éprouvette, qui contient 500 millimètres cubes de sérum, on aura un mélange au 251 \ On comprend qu'il est très-facile d'obtenir de même des mélanges au 201* ou au 101% soit en faisant varier la quantité de sérum, soit en prenant une proportion plus grande de sang. Il suffit de souffler dans le tube en caoutchouc que porte la pipette pour faire tomber le sang au fond de l'éprouvette, et en aspirant deux ou trois fois de suite un peu de sérum qu'on repousse aussitôt, on vide facilement tout le tube capillaire. On introduit

alors dans la petite cprouvetie contenant le sérum et le sang un agitateur terminé par une petite paleltc, et l'on imprime à cette baguette de verre un mouvement de va-etvient assez rapide {fhj. 3).

On doit agiter le mélange jusqu'à ce qu'il soit bien également fait et jusqu'au moment de s'en servir.

On dépose alors, à l'aide de l'agitateur, une goutte du mélange au centre de l'espace cellulaire, puis on place sur le tout une lamelle de verre parfaitement plane, en ayant soin de la poser doucement et directement sur la goutte.

Il reste à réunir ensemble la lamelle couvre-objet et la cellule. A cet effet, on se sert d'un peu de salive. Appliqué sur les bords de la lamelle, ce liquide visqueux s'infiltre par capillarité entre les deux plaques et s'oppose ainsi au glissement de la lamelle et à l'évaporation de la goutte. La prépa-

Fig. 3.

RECHBRCIIES SUK L ANATOUIE NORUjtLIi ET PATHOLOGIgUE DU SANS, 9

ration est alors terminée, et il ne reste plus qu'à compter les globules. Cette numération s'exécute à l'aide d'un procédé analogue à ceux de Cramer et de M. Malassez. On a disposé dans l'oculaire une glace sur laquelle est gravé un carré, et le tube rentrant du microscope est enfoncé dans sa monture jusqu'à un trait calculé de façon que le côlé du carré ait, avec l'objectif dont on se sert (n° 2, Nachet), une valeur d'un cinquième de millimètre, soit celle de la hauteur de la cellule. On a ainsi sous les yeux la projection d'un cube d'un cinquième de millimètre de côté. Do plus, ce carré de l'oculaire est divisé en seize carrés égaux, dans lesquels on a tracé des lignes réciproquement perpendiculaires qui n'arrivent pas jusqu*aux bords des petits carrés et qui sont destinées à faciliter la numération (ûff. 4).

Au bout de quelques minutes, les globules sont tombés par

leur propre poids au fond de la cellule. En comptant ceux qui sont compris dans les seize petits carrés, on a très-exactement le chiifre des globules contenus dans un cube d'un cinquième de millimètre de côté. Il suffira donc de multiplier ce chiffre par 125 pour savoir ce que renferme 1 millimètre cube du mélange, et pour connaitre la valeur de 1 millimètre cube de sang, de multiplier le dernier chiffre trouvé par le titre de ce mélange.

Dans l'exemple que nous avons choisi, c'est-à-dire avec un mélange au âBl"*, soit x, le nombre des globules comptés dans les seize carrés, il faudra multiplier x par 125, puis par 251, soit par 31 375. Si le mélange avait été fait au 201% on aurait à multiplier x par 25 125, et avec un mélange au 101 '^ par 12 625 ^

Pour obtenir le nombre x avec une exactitude suffisante, il est nécessaire de faire plusieurs numérations. Qn a ainsi 4, 5 ou 6 chiffres indiquant le nombre des globules compris dans des points plus ou moins éloignés de la même goutte de mélange. On en prend la moyenne^ qu'il reste à multiplier par un des chiffres précédents, suivant le titre de ce mélange.

Dans le cas où il est nécessaire de compter les globules blancs en même temps que les rouges, on doit faire le mélange sanguin au 101% à moins que les globules blancs ne soient très-abondants. On peut alors éprouver une certaine difficulté à compter les globules rouges à cause de leur grand nombre. Nous faisons, dans ce cas, deux préparations, une au 101** pour la numération des globules blancs, et une autre au 201^ ou au 251* pour celle des rouges. Mais dans les cas pathologiques où le nombre des globules blancs est augmenté, on peut le plus souvent faire, à Taide d'un seul mélange au 201* ou au 251* et dans la même préparation, la numération à la fois des globules blancs et des rouges.

Vous voyez, messieurs, que le petit appareil que je viens de mettre sous vos yeux et de vous décrire est d'une grande simplicité. Vous pouvez, de plus, vous convaincre que son maniement n'exige ni grande habileté ni une habitude spéciale du microscope ; je suis persuadé qu'il vous permettra d'entreprendre des recherches physiologiques exactes et de faire des observations pathologiques intéressantes.

Je me sers de cet appareil depuis trop peu de temps pour qu'il me soit possible de vous énoncer un grand nombre de résultats.

i Les pipettes actuellement fabriquées par le constructeur sont graduées à aide de pesées au mercure et sans qu'il soit tenu compte du mouillage, ce qui change un peu le calcul. {Voir ci-après l'inslrnction.)

Cependant, d'après les études que nous avons entreprises et pour lesquelles M. Duperie a bien voulu nous aider, je puis, en terminant, vous citer quelques chiffres qui vous don-

Tieront une idée des applications que doit trouver en clinique la numération des globules, notamment dans l'étude de la chlorose et des anémies.

Comme le médecin emprunte le sang qu'il examine à la pulpe du doigt, je me suis préoccupé tout d'abord de la détermination du chiffre que fournit le sang du doigt à Félat normal. En faisant, avec M. Duperie, un certain nombre de numérations chez des personnes adultes bien portantes, du sexe masculin, nous avons toujours trouvé un chiffre se rapprochant de 5 millions, en plus ou en moins. On peut donc considérer le nombre de 5 miUions comme représentant, d'après ces premiers essais , la moyenne physiologique du sang fourni par le doigt.

Quelques-uns des auteurs cités précédemment avaient d'ailleurs trouvé des chiffres se rapprochant beaucoup de cette moyenne.

Vierordt a compté dans son propre sang 5 174000 globules, mais ce qui montre bien les incertitudes dé son procédé, c'est que, pour le même sang, dans des numérations différentes, il a trouvé des chiffres variant de 4180000 à 5551 000.

D'après Welcker, le sang du doigt contiendrait 4600000 globules. Cramer a trouvé aussi un chiffre analogue, soit 4 726000.