DU DOSAGE DE L'HÉMOGLOBINE PAR LE PROCÉDÉ

DES TEINTES COLORIEES \

L'activité physiologique de Thémoglobine est trop connue, pour qu*il soit utile de montrer tout l'intérêt qui se rattache au dosage de cette substance dans un volume déterminé de sang.

A Tétat normal, chez Thomme ainsi que chez les animaux, la quantité d'hémoglobine est sensiblement proportionnelle au nombre des globules rouges, c'est-à-dire que chez les individus d'une même espèce, les globules rouges contiennent, en moyenne et à très-peu près, la même proportion, de matière colorante. Aussi a-t-on pensé que le dénombrement des hématies pourrait fournir une notion suffisamment exacte de la proportion d'hémoglobine, et inversement, Welcker, Mantegazza et d'autres auteurs ont-ils cherché à déduire du dosage de l'hémoglobine le nombre des globules rouges renfermés dans une unité de volume de sang.

Ce qui est vrai à l'état physiologique cesse de l'être dans un grand nombre de cas morbides, et en particulier dans l'anémie.

Lorsque j'entrepris des recherches anatomiques sur cette lésion du sang, je m'aperçus que, contrairement aux idées

i Extrait des Archives de physiologie normale et pathologique, n^ 6,

généralement admises, les globules rouges étaient des éléments très-altérables dont le contenu en hémoglobine variait à l'état pathologique dans des proportions extrêmement étendues \

Il était donc bien évident que, dans ces circonstances, le nombre des hématies ne pouvait donner Tindication de la quantité d'hémoglobine contenue dans le sang.

Pour pouvoir retirer un certain profit de la numération des globules rouges dans les maladies, il fallait pou'sjoir placer, à côté du chiffre des hématies, la dose d'hémoglobine.

La détermination de ces deux valeurs ne donne pas la solution complète du problème soulevé par l'examen clinique du sang; il faut encore tenir compte, ainsi que je l'ai indiqué dans mes travaux antérieurs, des altérations histologiques des hématies, en se rappelant, qu'avec des globules rouges très-altérés, le sang peut contenir une proportion relative, normale ou presque normale, d'hémoglobine.

De plus, comme, évidemment, dans certains états morbides cette dernière substance peut, sans être modifiée notablement dans son pouvoir colorant, subir des altérations chimiques plus ou moins profondes, il faudrait pouvoir pénétrer plus avant dans l'étude de la composition intime de ce produit et mesurer, par exemple, son pouvoir absorbant pour l'oxygène.

Quoi qu'il en soit de la complexité de cette question, le dosage de l'hémoglobine reste une des parties les plus importantes de l'examen du sang et je le considère, pour l'étude de l'anémie, comme le complément indispensable de la numération des globules et de la description des altérations de ces éléments. Gomment exécuter ce dosage d'une manière pratique?

Les procédés chimiques, spectroscopiques et chromométriques connus, présentaient l'inconvénient d'exiger une quantité de sang plus considérable que celle dont on peut priver les înalades sans leur faire une petite saignée. Comment, à l'aide de pareils procédés, aurait-on pu exa-

1 Des caractères anatomiques du sang dans les anémies. (Comptes reU' dus de TAcadémie des sciences t 3 notes, juillet 1876.) (FoiV plus loin, p. 43.)

miner tous les jours ou plusieurs fois par semaine le sang d'une même personne ? Il n'y fallait pas songer ; restait â imaginer un procédé véritablement clinique.

C'est alors que j'eus l'idée de chercher à apprécier d'une manière très-précise la teinte du mélange sanguin servant à la numération des globules, de façon à substituer, comme dans les autres procédés chromométriques, la détermination du pouvoir colorant du sang au dosage direct de la matière colorante.

Cette manière d'opérer, quoique fort simple, me fournit rapidement des résultats très-nets sur l'état du sang dans l'anémie, et, en multipliant mes observations, je pus me convaincre que cette lésion est caractérisée, quelle qu'en soit l'origine, par des altérations toujours analogues des hématies, altérations dont l'une des conséquences importantes est le défaut de proportionnalité entre le nombre des globules et le pouvoir colorant du sang.

En faisant connaître, dans les notes citées précédemment \ les notions générales que j'avais acquises sur les altérations anatomiques du sang dans les anémies, je décrivis succinctement le procédé chromométrique qui m'avait servi.

Depuis ^, à propos d'une communication sur le même sujet, faite à la Société de biologie par M. Malassez, je fis connaître ce procédé d'une manière plus complète, et en même temps j'indiquai quelques-uns des résultats qu'il m'avait permis d'obtenir, afin de rappeler que j'avais, antérieurement à cet observateur, entrepris des recherches chromométriques sur le sang ^

i Voir plus haut, p. 19.

a Comptes rendus de la Société de biologie, nov. 1876 {la Gaz. méd. a imprimé une épreuve non corrigée).

s L'idée de doser l'hémoglobine par la chromométrie, aussi bien à l'état sain qu'à Tétat morbide, n'appartient pas plus à M. Malassez qu'à moi, mais il me paraît inconstestable qu'au moment où j'ai publié mes premiers résultats sur le dosage de l'hémoglobine par un nouveau procédé clinique, on ne s'était occupé jusqu'alors, dans les nouvelles recherches sur le sang et l'anémie, que de la numération des globules.

Je crois avoir montré, le premier, à l'aide de mes observations, qu'il était indispensable de mesurer le rapport entre le nombre des globules et le pouvoir colorant du sang et de calculer ainsi la moyenne du contenu des globules en hémoglobine.

En poursuivant ces recherches je fus conduit à faire subir au procédé en question une légère modification dont je fis également part à la Société de biologie \ mais jusqu'à présent j 'ai négligé d'entrer à ce propos dans des détails suffisants.

Le petit appareil chromométrique dont je fais usage consiste simplement en une double cellule de verre et en une échelle de teintes coloriées.

La double cellule est formée par deux anneaux de verre de même diamètre, à surface extérieure dépolie, collés côte à côte sur une lame de verre. Ils ont été usés au niveau des points tangents, de façon à former deux petits réservoirs parfaitement semblables, séparés l'un de l'autre par une mince cloison. Chacun de ces petits réservoirs peut contenir un peu plus de 500 millimètres cubes d'eau. (Voir Sff. ci-dessous.)

Supposons que, après avoir placé la lame de verre portant ces deux cellules sur une feuille de papier blanc, on mette dans chaque cellule 500 millimètres cubes d'eau distillée, et qu'on ajoute, dans une seule des deux, 4 ou 5 milhmètres cubes de sang, on obtiendra ainsi une solution dont la cou-

leur, vue par lumière réfléchie, tranchera nettement sur l'état incolore de la couche liquide contiguë. L'intensité de la coloration de la solution sanguine variera, évidemment, à la fois suivant la proportion de sang utilisé et suivant la richesse de ce sang en matière colorante.

On a donc ainsi une coloration dont il faut mesurer les diverses fluctuations. Si, après avoir fait la dilution du sang soumis à l'étude, on pouvait ajouter peu à peu, dans le second réservoir d'eau, du sang dont on aurait calculé d'avance le contenu en hémoglobine, il arriverait un moment où le sang étalon serait mélangé avec l'eau en quantité suffisante pour

1 Comptes rendus de la Société de biologie, 16 juin 187'? {Gaz. méd,, n'26).

que la seconde solution ait exactement la même teinte que la première. On en conclurait que les deux quantités de sang employées respectivement renferment la même quantité de matière colorante.

Mais cette manière d'opérer n'est pas pratique ; elle n'est guère propre qu'à montrer le principe sur lequel repose ce procédé chromométrique.

Ce principe consiste à apprécier la coloration d'une solution sanguine, en la plaçant de façon à ce qu'elle soit éclairée par lumière réfléchie.

La solution de sang étalon est remplacée dans la pratique par unie série de teintes coloriées.

Les deux petits réservoirs étant remplis, l'un par une solution, à titre connu, du sang à essayer, l'autre, d'eau pure, si, au-dessous de ce dernier on fait passer successivement des rondelles de papier convenablement coloriées et de plus en plus foncées, il arrivera un moment où, vue à travers la couche de liquide, une de ces rondelles produira une coloration analogue et équivalente à celle de la solution sanguine. Ces rondelles coloriées, bien exécutées, produisent un véritable trompe-ï œil ; on croirait avoir, côte à côte, deux solutions colorées et les personnes qui examinent, pour la première fois, l'effet produit par cette double cellule, sont étonnées de ne pas pouvoir reconnaître le côté où se trouve le sang.

Chacune des teintes coloriées utilisées représentant une solution de sang titrée, dès qu'on a trouvé la rondelle qui correspond le mieux au mélange sanguin, le dosage de l'hémoglobine est opéré ^ .

Comme il est difficile de se procurer de l'hémoglobine pure, les rondelles coloriées de l'échelle des teintes ne correspondent pas à des solutions titrées d'hémoglobine ^.

1 Quand on a une certaine habitude de ce procédé, on peut, comme je le fais journellement, se servir d'une simple cuvette qu'on place à côté des rondelles coloriées. Cet^e manière d'opérer donne des résultats aussi exacts que l'emploi de la cuvette double ; mais celte dernière me paraît faciliter la .recherche de la teinte concordante et, grâce aux observations bienveillantes de M. le professeur Regnauld, je lui donne aujourd'hui la préférence.

* Je me propose de faire prochainement la détermination de la valeur de ces teintes avec de l'hémoglobine cristallisée, préparée par la méthode d'Hoppe- Seyler,

RECHElftCHES SUR L'ANATOMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG. âS

Après m'être assuré que cliez l'homme adulte et sain la quantité de matière colorante contenue dans le sang est proportionnelle au nombre des globules, j'ai pris comme étalon le globule rouge du sang humain ^

Chaque rondelle placée au-dessous de la couche d'eau pure fait prendre à cette couche liquide une teinte équivalente à celle que donnerait à l'eau un nombre déterminé de globules.

Pour exécuter l'échelle de ces teintes coloriées, j'ai fait des solutions, en proportions variables, d'un sang dont je connaissais aussi exactement que possible le contenu en globules, et j'ai fait choix des teintes représentant d'une manière précise chacune de ces dilutions ^ .

Dans l'échelle, dreg^ee pour l'emploi de la cuvette double, les teintes ont les va/feurs suivantes :

Teinte n^ 1 8 649 000 globules sains.

— nMO 18 379 125 —

Ces chiffres signifient que toute solution sanguine, correspondant à la teinte n"" 1 , contiendra une quantité d'hémoglobine égale à celle qui serait fournie par 8 649 000 globules sains, et ainsi de suite pour chaque teinte.

La manière d'employer cet appareil chromométrique est fort simple.

Le choix d'un éclairage convenable est, pour ainsi dire, Tunique condition à remplir.

i Les examens comparatifs de sang normal donnent, d'un individu à l'autre, des différences qui ne dépassent pas la moyenne des erreurs possibles.

s Ces teintes sont faites à l'aquarelle. Bien qu'elles soient d'une exécution facile, j'ai essayé de les faire fabriquer par un autre procédé plus sûr et plus commode, au point de vue d'une production en grand. J'espère qu'on y réussira à l'aide de la photochromie.

Nous aurons bientôt à insister sur ce point cl*une manière . toute particulière.

Il faut se placer de préférence dans une chambre éclairée par une seule fenêtre, tournée vers le nord ou vers Test. L'exposition au nord est préférable en ce qu'elle permet de travailler dès le matin. On se met directement en face de la fenêtre, et à quelques mètres de distance, de façon à ce que la lumière tombe obliquement d'en haut sur les deux cellules de verre, Tune d'elles ne devant pas produire d'ombre portée sur la voisine.

La lumière la plus favorable, pour ce genre de recherches, est celle que donne un ciel couvert de ^nuages blancs ou légèrement gris ; la plus fâcheuse est celfc qui émane d'un ciel bleu et sans nuages. -\

Après avoir, à l'aide de la grosse pipette, déposé dans chaque cellule 500 millimètres cubes d'eau distillée et aérée, ou même d'eau filtrée ordinaire , on ajoute dans Tune des deux quelques millimètres cubes du sang à examiner et on remue immédiatement et très^doucement le mélange, en se servant d'une petite baguette de verre et en prenant soin de ne pas projeter de liquide en dehors du petit réservoir.

Quand on fait le dosage d'un sang sain, on peut prendre de 2 à 4 miUimètres cubes de sang.

Dans les cas pathologiques, il faut nécessairement employer d'autant plus de sang que l'anémie est plus intense \ soit dans l'anémie légère, 4 millimètres cubes; dans l'anémie de moyenne intensité, de4 à 6 ; dans Tanémie intense (3* degré), de 8 à 12; dans l'anémie extrême (4* degré), de 10 à 15.

Comme souvent il est difficile de savoir d'avance dans quelle proportion doit être fait le mélange sanguin, puisque précisément il s*agit de déterminer le degré d'anémie, on prend tout d'abord une quantité insuffisante de sang, et après avoir rapidement séché la pipette, on en reprend un certain nombre de millimètres cubes. D'ailleurs, dans l'anémie un peu intense on est toujours obligé de faire plusieurs prises de sang, la pipette ne contenant que 5 millimètres cubes.

t Des degrés d'anémie. Note lue à la Société médicale des hôpitaux. Udîod médicale, 28 et 30 avril 1877.) {Voir plus loin, p. 55.)

Mais il faut avoir soin de ne pas laisser, entre ces prises de sang, un intervalle dépassant 5 à 10 minutes, la dilution sanguine s'évaporant peu à peu au contact de l'air, surtout par un temps sec et chaud.

Il est important, ainsi que nous Tavons déjà fait remarquer ailleurs à propos de la numération des globules, de se procurer le sang à l'aide d'une piqûre de lancette. J'ai toujours choisi chez l'homme la pulpe des doigts, et toutes les fois qu'il était nécessaire de reprendre du sang à la même personne, à des intervalles suffisants pour permettre au sang de se coaguler dans la petite plaie, j'ai pris la précaution de faire une piqûre fraîche au lieu de comprimer la première avec force pour la faire saigner de nouveau.

Faite convenablement, cette petite piqûre de lancette n'est nullement douloureuse ; il m'est arrivé de la pratiquer chez un enfant endormi sans le réveiller.

Dès que le mélange sanguin est effectué, on place la cellule contenant l'eau pure au-dessus de l'une des teintes de l'échelle, en choisissante peu près celle qu'on juge devoir donner le meilleur résultat. Puis on cherche la teinte concordante et, quand on croit Tavoir trouvée, pour s'assurer qu'il n'y a pas d'erreur, on examine avec soin si la teinte qui précède et si celle qui suit donnent un aussi bon résultat. Si l'une est trop faible et l'autre trop forte, celle qu'on a choisie est la plus juste.

Avec un peu d'habitude, quand la teinte de l'échelle n est pas exactement concordante, on apprécie facilement la valeur d'une demi-teinte.

L'opération est alors terminée. Elle indique immédiatement,

exprimée en globules sains, la richesse globulaire du sang examiné. Prenons un exemple. Supposons qu'on ait pris 6 millimètres cubes de sang et qu'on ait obtenu la teinte n° 4. Cette dernière représentant une dilution faite avec 11 892 375 globules sains {Voir le tableau, p. 23), la richesse globulaire sera par millimètre cube de

11892 375 ^^Qg^Qg^ o

Mais là ne se borne pas l'examen du sang et la numéra-

tion des globules vient compléter ordinairement le dosage de rhémoglobine.

Dans l'exemple précédent, admettons que cette numération ait fourni le chiffre de 4 774 000 globules. Le mélange sanguin ayant été fait avec 6 millimètres cubes, on devra en conclure que 4 774 000 X 6, soit 28 644 000 globules renferment la même quantité d'hémoglobine que 11 892 375 globules sains.

Un globule du sang examiné sera donc représenté en moyenne par

Dans le cas choisi on aura :

Nombre des glob. rouges par mm. c. c. N=4 774 000. Richesse globulaire,expriméeenglobulessains,R=l 982 062. Valeur individuelle, moyenne, d'un globule, G =0,414.

On peut simplifier ces chiffres en ne conservant que deux décimales à celui qui représente la valeur de G, et en remplaçant les 3 derniers chiffres de la valeur R, par des zéros. A l'aide de ces données on peut dresser chaque observation sous la forme d'un graphique comprenant trois courbes N — R — ;G, auxquelles on en ajoute, suivant les cas, une quatrième, la courbe B exprimant tes variations des globules blancs.

Le procédé chromométrique fort simple, qui vient d'être décrit, est suffisamment exact et sensible pour répondre aux besoins de la clinique et même aux exigences plus grandes de certaines recherches physiologiques.

C'est, certainement, lorsqu'on opère dans de bonnes conditions et avec des instruments éprouvés, le moins imparfait des procédés chromométriques, mais il ne faut pas chercher à lui faire donner plus qu'on ne peut obtenir par les méthodes de ce genre. Les résultats auxquels je suis arrivé, notamment dans l'étude de l'anémie, vérifiés un très-grand nombre de

fois, ont toujours été parfaitement précis et concordants, et, au point de vue clinique, j'attire surtout l'attention sur cette manière très-rigoureuse de suivre pas à pas les modifications que font subir au sang remploi de certains médicaments et en particulier celui du fer ^ .

Examinons d'ailleurs le degré de précision sur lequel on peut compter.

Quand on fait dans Tune des petites cellules de verre un mélange de sang normal en en prenants millimètres cubes sur 500 millimètres cubes d'eau et, qu'à l'aide de feuilles coloriées nn peu inégalement et non découpées en rondelles, on détermine, avec la plus grande précision, la teinte correspondant

à cette solution, on voit qu'il suffit d'y ajouter^ de millimètre

cube de sang pour qu'elle soit modifiée d'une manière appréciable.

Il en est de même pour toutes les dilutions de sang suffisamment étendues jusqu'à celle qui atteint environ la proportion de g^ millimètres cubes. On voit donc que des dilutions de sang normal ne différant entre elles que de ^ ^ peuvent, lorsqu'elles sont effectuées en proportions convenables, présenter des nuances suffisamment distinctes les unes des autres pour être appréciables.

Quand les solutions sanguines sont d'une coloration plus intense, c'est-à-dire lorsqu'elles sont faites dans la proportion de 4 à 6 millimètres cubes de sang, sur 500 d'eau, il devient nécessaire d'ajouter environ, à une première dilution de sang, 1/8 de millimètre cube pour, obtenir une teinte sensiblement différente de la précédente. Dans ces conditions,

les dilutions sanguines varient entre elles de •^.

Ces épreuves montrent que la sensibilité de ce procédé d'examen par lumière réfléchie est très-grande ^ ; mais dans

t De l'action du fer dans Vanémie, (Comptes rendus de l'Académie des sciences, nov. 1876.) (Voir plus loin, p. 69.)

t - = 0,0625, d ou ^:-gôô"*-8ÔÔÔ-"8ÔÔÔ

5 Ce résultat n'a rien qui doive surprendre. Quand, en effet, on regarde un objet coloré et transparent par lumière réfléchie on en voit la coloration

28 RECHERCHES SUR L'aNATOUIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG.

la pratique, la détermination de nuances très-délicates est à la fois difficile et inutile. Aussi nous sommes-nous contenté, pour dresser l'échelle des teintes coloriées, de rondelles correspondant à des dilutions ne variant entre elles que de ^.

Après avoir fait une première dilution avec 2 de sang pour 500 d*eau pour la teinte n° 1 , nous avons pris respectivement, pour les teintes suivantes et pour la même quantité d'eau (500), 2,25 de sang, puis 2,50, puis 2,75, etc.

De plus, pour ne pas atteindre des nuances trop foncées et par suite trop rapprochées les unes des autres, nous n'avons pas dépassé le n"" 10, bien qu'on puisse facilement se servir d'une échelle allant jusqu'à 15 et 16.

De cette façon, la distance entre 2 teintes est tellement grande qu'il est impossible de se tromper dans le dosage de l'hémoglobine, de la valeur d'une teinte. On arrive même rapidement à apprécier la valeur d'une demi-teinte.

Mais en supposant qu'on puisse se tromper de la valeur d'une teinte, quelle serait la conséquence de cette erreur, dans la détermination du pouvoir colorant du sang?

Nous venons de voir que les dilutions ayant servi à la fabrication de Téchelle des teintes diffèrent entre elles de ^ ;

mais cela n'indique pas les quantités différentes d'hémoglobine ou de globules qu'elles renferment. A cet égard le degré d'approximation est d'autant pliis grand que les teintes sont plus foncées, ce qui explique pourquoi ces dernières se ressemblent plus entre elles que les teintes faibles.

En effet, la première teinte ayant été obtenue avec J^, la seconde avec |^, il y a entre les 2 premiers degrés de l'échelle une différence s'élevant à 11,11 0/0 de la quantité de sang employée, c'est-à-dire de la quantité d'hémoglobine à doser ^ .

Entre la teinte n*" 2 et la teinte n*" 3 (l'une faite avec—-,

augmenter d'une manière considérable (elle est à peu près doublée). L'examen des solutions sanguines par lumière réfléchie permet donc d'utiliser des liquides très-peu colorés et d'apprécier des différences de nuancés trop faibles pour elro perçues quand les objets sont vus par transparence.

Tautre avec ^), la différence sera de 10 0/0 de la quantité

d'hémoglobine à doser.

Entre les autres teintes successives, les différences sont de plus en plus petites, soit :

. Entre les n*^ 3 et n" 4 9,09 0/0

— n° 4 et n** 5 8,33 —

— n" 5 et n° 6 7,69 —

— n° 6 et n" 7 7,14 —

— n" 7 et n° 8 6,66 —

— n° 8 et n° 9 6,25 —

— n« 9 et nMO 5,88 —

On voit donc qu'en se trompant d'une teinte (ce qui est certainement l'erreur maxima) on commettra dans la détermination du pouvoir colorant une erreur variant de 11,11 0/0 à 5,88 0/0 de la quantité d'hémoglobine à doser.

Comme nous représentons cette quantité d'hémoglobine en globules sains, il est bon d'exprimer ces écarts en richesse globulaire.Dans Téchelledes teintes, telle qu'elle est exécutée, l'écart d'un numéro à l'autre est représenté par l'addition, à la dilution primitive, de 1 081 125 globules sains.

L'erreur vraie et définitive que Ton commet dans chaque détermination chromométrique est représentée par ce nombre de globules, divisé par la quantité de sang employée. Ainsi, les 11 0/0 qui séparent dans nos précédentes appréciations la

teinte n** 2 de la teinte n"" 1, seront représentés pari^^^ si

nous avons employé 2 millimètres cubes de sang, par ^-^^^

si nous en avons employé 3, et ainsi de suite. De sorte que plus nous aurons employé de millimètres cubes de sang, plus Terreur exprimée en globules sains sera faible. C'est pourquoi elle est moins forte, comme nous l'avons déjà fait voir, lorsque les dilutions de sang se rapprochent des teintes foncées de l'échelle. Remarquons encore que, dans les cas d'anémie, la quantité de sang prise pour obtenir les mêmes teintes, étant 2, 3, 4 et 5 fois plus forte qu'avec du sang normal, il en résulte que l'erreur relative restant la même, l'erreur absolue, exprimée en globules sains, devient 2, 3, 4 et 5 fois plus faible qu'à Tétat sain.

SO RECHERCHES SUR L'aNATOMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG.

Exemple. — Avec un sang normal j'obtiens la teinte n**l en prenant 2 millimètres cubes desang.Si,commettant une erreur, je trouve la teinte n*» 2 (au lieu de 1) le chiffre représentant

cetteerreur en globules sains sera ^^^^ = 540 562. Avec un

sang pathologique, en prenant ^ millimètres cubes de sang

je devrais obtenir, je suppose, la teinte n'' 1 ; mais je fais la même erreur, je trouve la teinte n*" 2. L'écart dans ma détermination rapportée au millimètre cube se traduira par

Les erreurs absolues sont donc entre elles comme les quantités de sang prises, les erreurs relatives restant respectivement entre les n°' 1 et 2, de 11,11 0/0 de la quantité de globules à doser.

Le procédé donne donc la même approximation dans l'anémie qu*à l'état sain, ce qui est très-important au point de vue pratique.

Les erreurs supposées dans les exemples précédents sont grossières et certainement plus grandes que celles qui sont commises réellement lorsqu'on opère avec soin. Pour en diminuer l'importance, je conseille de faire des dilutions sanguines se rapprochant le plus possible des A derniers degrés de Téchelle, c'est-à-dire des n°' 7, 8, 9 et 10. — En procédant ainsi, lorsqu'on a pris l'habitude d'apprécier le pouvoir colorant à une demi-teinte près, ce qui est facile, les erreurs relatives n'atteignent plus que 3 0/0 environ de la richesse globulaire à déterminer. Ce degré d'exactitude est suffisant, et> en tout cas, ainsi que nous le montrerons bientôt, très-supérieur à celui que fournissent les autres procédés chromométriques utilisables en clinique.

La seule objection sérieuse qu'on puisse faire valoir contre l'emploi d'un tel procédé, objection qui d'ailleurs est la même pour tous les autres dosages chromométriques, c'est que les teintes des dilutions sanguines varient d'une manière trèsnotable avec l'éclairage. Mais il s'agit là plutôt d'une difficulté que d'une cause d'erreur.

Pour arriver à surmonter cette difficulté, il est utile de se

rendre un compte exact des effets produits par les variations de Téclairage.

Dans Timpression produite par un objet coloré, deux éléments principaux sont à considérer : le ton et la valeur.

Le ton correspond aux nuances infinies qui peuvent résulter de la combinaison des différentes couleurs ; la valeur est une question d'intensité.

Deux teintes d'un ton différent peuvent avoir la même valeur, si elles ont la même intensité. Mais le même objet coloré subit des modifications de ton et de valeur, suivant la manière dont il est éclairé.

En général, les solutions de sang dissous, faiblement et moyennement colorées, offrent une teinte orangé-rouge.

Lorsque le ciel est couvert, et que la lumière solaire est plus ou moins blanche, cette teinte tire sur le rouge, et le rouge est d'autant plus prédominant que la lumière est plus blanche.

Au contraire, quand avec un ciel sans nuages, la lumière devient bleue, la teinte des solutions sanguines est rendue d'autant plus jaune verdâtre que le bleu du ciel est plus intense ^ .

Mais les rondelles coloriées servant d'étalon ne subissent pas de modifications correspondantes. Certes, leur ton est influencé également par les variations de la lumière ambiante, mais dans une proportion infiniment moindre que celui des solutions sanguines. Aussi, lorsque l'échelle des teintes a été exécutée par un temps couvert, c'est-à-dire dans la gamme orangé-rouge, est-on obligé, lorsqu'on opère par un ciel bleu, de comparer du jaune avec du rouge. C'est alors que la seconde qualité de l'objet coloré devient prédominante; l'opération consiste à établir une concordance de valeur entre le mélange sanguin et les teintes coloriées.

J'ai cherché à remédier à cet inconvénient réel par l'emploi d'un diaphragme de verre dépoli; j'ai même fait construire une sorte de boîte destinée à renfermer l'appareil chromométrique et à ne laisser pénétrer que de la lumière tamisée par

1 Cet effet est dû au pouvoir absorbant que possède un liquide coloré pour certains rayons lumineux.

un verre dépoli. Ces dispositions sont restées à peu près infructueuses. Le verre dépoli affaiblit Téclairage sans en modifier la nature ; quand le ciel est bleu, il laisse passer de la lumière bleue, et par suite il ne corrige pas d'une manière sensible le ton jaune, du mélange sanguin.

On obtient un meilleur effet en se servant d'un store de tissu blanc léger ; mais ce moyen lui-même est quelquefois insuffisant. Aussi ai-je fabriqué pour mon usage deux échelles de teintes, Tune dans la gamme orangé-rouge, l'autre dans la gamme orangé-jaune, ce qui me permet de faire des dosages chromométriques quel que soit Tétat du ciel.

Le second facteur avec lequel il faut compter est l'intensité de l'éclairage. Tout le monde sait que lorsqu'on regarde un objet coloré quelconque en pleine lumière, sa valeur n'est pas la même que lorsqu'on l'examine à l'ombre. Plus obscur est l'endroit dans lequel il est placé et plus sa valeur parait accentuée. Il y a donc encore là une cause d'erreur à éviter.

On y parvient facilement en disposant la table de travail à une certaine distance de la fenêtre ou en se garantissant par un écran des rayons lumineux horizontaux.

D'ailleurs, les cuvettes de verre étant dépolies sur leur surface extérieure, les liquides qui y sont contenus ne sont traversés horizontalement que par une lumière d'une intensité modérée. De plus, l'intensité de l'éclairage fait varier dans le même sens la valeur de la teinte du sang dissous et celle delà rondelle coloriée vue à travers une couche de liquide. Aussi, lorsqu'on a soin de se tourner, le matin vers le nord, ou l'après-midi vers le nord ou l'est indifféremment, est-il facile de se mettre à l'abri des erreurs ressortissant à l'intensité variable de l'éclairage.

Les teintes que j'ai fait exécuter pour M. Nachet sont justes de ton par un ciel couvert et par un éclairage doux, d'intensité moyenne ; elles correspondent aux conditions le plus souvent réalisées à Paris ^ .

1 Nous attirerons encore l'altenlion sur un dernier point. La teinte des mélanges sanguins se modifie d'une façon très-sensible suivant la nature et la couleur de la surface réfléchissante. Quand on promène la petite cuvette remplie de sang dissous sur des papiers blancs de nature différente, on s'aperçoit très-bien de cette influence relativement considérable.

n est donc indispensable de se servir toujours, comme surface réfléchis*

RECHEBCHES SUR L'aNATOMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANÔ. ^

En résumé, on voit que cette méthode de dosage chroraométrique est loin d'être d'une certitude absolue et que son emploi nécessite un certain nombre de précautions. Nous ne nous faisons' sous ce rapport aucune illusion, et cependant nous attachons au procédé des teintes coloriées une réelle importance à cause de son extrême simplicité et de son application facile à la clinique.

Après avoir montré les petites difficultés de son maniement, il est juste de reconnaître ses avantages.

En se servant toujours des mêmes instruments, en opérant les examens successifs, relatifs à un même cas, dans des conditions aussi analogues que possible, les résultats qu'on obtient sont très-précis et parfaitement comparables entre eux.

Ajoutons qu'au point de vue clinique, le dosage chromométrique de l'hémoglobine est plus précieux à lui seul que la numération des globules, et que les renseignements qu'il fournit sur la richesse globulaire vraie sont d'une connaissance plus importante dans l'anémie que celle du chiffre des hématies.

En effet, ainsi que je l'ai dit ailleurs, certains malades anémiés ont un nombre de globules égal ou même supérieur à celui des individus sains, tandis que la proportion d'hémoglobine (richesse globulaire) est très-inférieure à la normale.

Si dans les cas de ce genre, cas d'ailleurs extrêmement communs, on voulait s'en tenir à Tune des deux méthodes d'examen du sang, c'est donc sans hésitation au procédé chromométrîque qu'il faudrait donner la préférence.

A lui seul il permet d'apprécier le degré d'anémie d'une manière très-suffisamment exacte.

Prenons comme exemple un fait fréquemment noté dans mes observations. L'échelle des teintes a été exécutée de telle sorte que le n° 9 correspond à 4 millimètres cubes d'un sang normal, mais peu riche en globules. Pour obtenir cette même teinte avec le sang d'une personne anémique ayant à peu près le même nombre de globules, ce n est pas 4 millimètres cubes de sang qu'il faudra prendre, mais bien 8, 10 et parfois

santé, du même papier. J'ai choisi à cet effet un Wathman moyennement fort i'un beau blanc, facile à remplacer dès qu'il est taché.

34 igecH^RGi^is SUR l'anatomie normale et pathologique du sang.

1â millimètres cubes. Voilà, je pensé, une bien grande différence.

. Eh bien, supposons que dans les examens ultérieurs on ne se préoccupa plus du nombre des globules, n'est-il pas évident qu'on sera certain de Texistence d'une amélioration sensible lorsque celle même teinte ti°9, réclamant d'abord l'emploi de 12 millimètres cubes, sera donnée successivement par 11 millimètres cubes, puis par 10, etc., et enfin par 4? Or, c'est là ce qui arrive lorsque les malades sont en voie de guérison, et à lui seul, le dosage chromométrique permet de suivre pas à pas ces importantes modifications.

. Ceux qui voudront se livrer à ces recherches pourront facilement vérifier les faits de cet ordre, et si j'insiste sur la portée pratique du procédé des teintes coloriées, c'est que, pialgré ses défauts, il me paraît plus sensible et plus correct que tous les autres procédés cliniques.

, Je me suis trop étendu sur les imperfections du petit appareil que je propose, pour qu'il ne me soit pas permis de faire l'examen critique des procédés analogues.

Je n'ai pas à m'occuper ici des méthodes de laboratoire qui exigent l'emploi d'un ou de plusieurs centimètres cubes de sang, ou l'intervention d'une substance difficile à obtenir et à conserver, telle que l'hémoglobine cristallisée, ou bien encore l'usage d'appareils coûteux et d'un maniement difficile (spec^ Iroscopes plus ou moins compliqués). Je tiens à rester ici sur le terrain de la clinique.

. - A ce point de vue, il y a lieu d'examiner l'avantage qu'on ^pourrait retirer des procédés de dosage du sang par transparence, en choisissant parmi ces procédés ceux qui n'exigent pour fonctionner que quelques millimètres cubes de sang ^

Lorsque j'ai commencé à m'occuper du dosage de l'hé- .moglobine, j'ai craque Tinslrument connu sous le nom de

1 Voir sur les diverses mélhodes de dosage de l'hémoglobine le mémoire' de M. Malassez dans lequel l'auleur n'a omis que les nouveaux essais d'analyse quantitative de cette substance à l'aide du spectrosçope. {Arch, de pbysiol no 1, p. 1, 1877.)

RECHERCHES SUR L*ANAT01IIE NORMALE ET. PATHOLOGIQUE DU SANG, 3q

colorimèlre et construit par M. Duboscq pourrait fendre quelques services. ' ♦

J'ai entrepris d'assez nombreux essais avec cet appareil dont le principe me paraissait assez ingénieux et, malgré mes efCbrts, les résultats que j'ai atteints ont été très-imparfaits. i

Il me semble utile cependant de rapporter brièvement ces essais, pour bien montrer les difficultés que Ton rencontre dans la détermination du pouvoir colorant des liquides exaininés par transparence.

Le colorimètre de M. Duboscq, particulièrement employé dans l'industrie des sucres, est destiné à doser la quantité de matière colorante contenue dans une solution par la mesure de l'épaisseur d'une couche de liquide, vue par transparence. • Dans cet instrument, on' compare entre eux deux liquides contenant la même matière colorante, mais dans des propor-r tions différentes; le liquide le plus riche donne sous une faible épaisseur la même valeur de teinte que le liquide le moins riche, vu sous une épaisseur plus grande. Le rapport entre les deux épaisseurs de liquide donnant la même teinte indique la dose de matière colorante contenue respectivement dans les liquides à essayer.

L'appareil se compose de deux réservoirs cylindriques de verre, destinés à recevoir les solutions colorées, solutions dont l'épaisseur est rendue variable par le jeu d'un cylindre mobile, plus petit, fermé à sa partie inférieure par un disque de verre. Au-dessous de ces cylindres, on a disposé un miroir qui éclaire les solutions colorées par lumière transmise. Au-dessus se trouve une sorte de lunette qui, par un jeu de prismes-, ramène les teintes fournies par les deux réservoirs dans le même oculaire, de façon à ce que chacune d'elles occupe respectivement la moitié de cet oculaire, divisé en deux par la ligne de contact des deux prismes.

Celte juxtaposition des deux images colorées dans lei même oculaire constitue la disposition principale de ce « colorimètre », et c'est à cause des garanties d'exactitude qu'elle présente que j'ai tenté avec insistance l'emploi de cet instrument.

Pour le dosage de Thémoglobine on peut adopter deux procédés principaux : 1° comparer une solution de §ang faite

dans des proportions convenables et connues avec un étalon dont les variations de valeur peuvent indiquer la dose d'hémpglobine ; 2°" comparer à un étalon invariable des dilutions de sang faites en proportions définies et dont les variations d'épaisseur pour atteindre la valeur de l'étalon indiquent les quantités respectives de matière colorant^.

1" procédé. — C'est celui qui exige le moins de sang et dont l'application aux recherches cliniques serait le plus facile.

Pour le mettre en œuvre, nous avons supprimé d'un côté le grand cylindre et mis la solution sanguine dans le petit.

De cette façon nous pouvions opérer avec des dilutions analogues à celles dont nous nous servons dans le procédé des teintes coloriées.

Comme liquide étalon, destiné à être placé dans le grand cylindre et dont les épaisseurs variables devaient indiquer la dose de l'hémoglobine, nous avons essayé plusieurs liquides différents.

Tout d'abord nous avons tenté l'emploi de solutions d'hémoglobine titrées, en nous servant d'hémoglobine Crinon (qui n'est tout simplement que de la poudre de sang desséché).

Nous avons employé le mélange suivant :

Glycérine, ) ^ Ann Eau distillée, i "" ^^ «^«™™^^- Carbonate de soude pur, 1.

Hémoglobine Crinon, 1 .

On obtient très-facilement de la sorle une solution transparente possédant un pouvoir colorant assez intense. Mais, vu dans le colorimètre, ce liquide offre une teinte très-manifestement plus jaune que celle de la solution de sang, et l'appréciation du pouvoir colorant du sang donne des résultats trèsincertains.

On réussirait sans doute beaucoup mieux en employant de l'hémoglobine aussi pure que possible, obtenue par cristallisation. Mais cette hémoglobine est d'une préparation difficile, ne réussissant, on le sait, qu'en hiver-, elle se conserve peu de temps et par conséquent elle ne pourrait servir qu'à établir une bonne graduation de l'instrument, si l'on parvenait, d'autre part, à fabriquer une solution colorée dont la valeur serait

très-exactement définie par comparaison avec une solution titrée de cette hémoglobine. Après avoir échoué avec Thémoglobine Crinon, j 'ai essayé comme liquide étalon le picro-carmin étendu d'eau et de glycérine avec ou sans addition d'éosine.

Il n'est pas impossible, à l'aide de tâtonnements, d'arriver à faire un liquide ayant presque exactement la même teinte que les solutions sanguines; mais alors la sensibilité de l'instrument n'est pas suffisante, car on peut ajouter une assez notable quantité de sang sans produire une différence dans les deux teintes qu'on compare.

D*autre part, quand on croit avoir obtenu une concordance aussi juste que possible entre les deux teintes vues dans l'oculaire, il suffit de modifier l'éclairage pour que cette concordance cesse d'exister. Je me suis aperçu ainsi que, dans cet instrument, la question du ton des teintes comparées avait une grande importance ; elle prime la question de valeur, cette dernière étant très-imparfaitement appréciée à cause de la disposition adoptée pour l'éclairage. Il suffit de déplacer l'instrument et de lui donner une obliquité plus ou moins grande pour changer immédiatement la concordance des .teintes, et lorsque, dans le cours d'une même observation, le ciel s'assombrit ou s'éclaircit, les degrés primitivement trouvés deviennent inexacts. Quelle confiance pourrait-on donc accorder à des examens successifs dans des conditions forcément variables ? L'interposition de verre dépoli entre le miroir et les cylindres de verre ne modifie pas ces variations dues à l'éclairage. Pour l'examen des liquides par transparence, le degré de transparence, et par suite la valeur de la teinte, dépendant en partie de l'intensité de la source lumineuse, il faudrait avoir un éclairage toujours le même et toujours égal des deux côtés.

2* procédé. — Pour mettre ce procédé en pratique, on fait varier les hauteurs de la solution sanguine jusqu'à ce que la teinte fournie par cette solution concorde avec celle que donne un étalon fixe dont la valeur est empiriquement déterminée. Afin d'employer le moins de sang possible, j'ai fait faire un cylindre aussi étroit que le permet la construction de l'appareil, et malgré cela il m'a fallu prendre jusqu'à 20 et 25 millimètres cubes de sang sain pour obtenir une teinte convenable.

Ce qui obligerait à prendre jusqu'à 200 millimètres cubes de sang dans certains cas d'anémie. C'est donc un procédé à peine clinique. ^

Gomme étalon j'ai essayé successivement un verre de couleur, une préparation faite avec du papier de soie trempé dans du picro-carmin, im quartz taillé convenablement et placé entre 2 prismes Nicol (procédé indiqué par M. Andrieux pour la recherche de la fuchsine dans les vins) ^ . ' Il me paraît inutile d'entrer dans le détail de ces expériences : les résultats obtenus ont été moins précis encore que ceux qui m'avaient été donnés par le premier procédé.

J'étais déjà familiarisé avec l'examen des solutions sanguines par transparence, lorsque M. Malassez^ fit connaître un nouveau chromomètfe dans lequel une solution sanguine est comparée avec un liquide étalon,'précisément comme dans la première des dispositions précédentes du colorimèlre de M. Duboscq.

L'appareil de M. Malassez mérite un examen attentif^ car, pouvant fonctionner avec une faible quantité de sang, il est parfaitement applicable à l'examen des malades.

On en pourria lire la description détaillée dans les Arch. de phys. {loc. cii,, p. 34). Contentons-nous de rappeler qu'il consiste essentiellement en un petit réservoir à faces parallèles, rempli de sang dilué, réservoir qu'on examine par transparence et dont on compare la teinte à celle que donne un prisme contenant une sorte de gelée colorée à l'aide de picro-carmin.

Après avoir percé un écran de deux trous de 5 millimètres de diamètre et peu distants l'un de l'autre, on a disposé derrière l'un des trous le réservoir contenant le sang, et derrière l'autre le prisme, qui, mû par une crémaillère, présente successivement au niveau du trou des épaisseurs différentes.

Toute la manœuvre consiste à trouver une position dans laquelle le prisme donne la même teinte que la dilution san-^ guine.

1 A. Gautier, la Sophistication des vins, Paris, 1877. s Loc, cit., p. 34.

RECREBCH-ES SUR L'aNATOMIE NORMALE ET PATHOLOGIQUE DU SANG. 39

- Nous ferons remarquer tout d'abord que,* malgré le soin ' avec lequel rauiéup a fabriqué le liquide • coloré renfermé dans le prisme, le mélange picro-cçirminé a toujours une couleur plus jaune que les solutions de sang. Il faut donc comparer un liquide jaune avec une solution tirant plus ou moins sur le rouge, etr s'habituer par conséquent dajis cette comparaison à tenir compte uniquement de la valeur des deux, teintes. Or Tune des couches liquides, celle du sang, a; toujours la mjâme épaisseur, les valeurs variables qu'elle présente correspondent à une proportion plus ou moins grande do man . tière colorante, tandis que Tautre couche de liquide, contenant une quantité de matière colorante invariable, ne change de valeur que suivant répaisseur sous laquelle elle est examinée. Il résulte de cette disposition que suivant Tintensité deréclairage, la même solution sanguine pourra correspondre à des épaisseurs variables du prisme. C'est déjà là une cause d'erreur, et cette cause d'erreur est loin d'être annulée par l'interposition d'un diaphragme de verre dépoli.

Mais cet inconvénient est le moindre de la méthode; le point qui laisse le plus à désirer nous paraît être, en effet, la graduation de l'instrument.

Pour obtenir les degrés de son échelle, M. Malassez a introduit dans son petit réservoir des solutions de sang de chien; variant entre elles d'un millième, soit,, pour le 1*' degré, une. solution composée en volume de 0,5 de sang pour 100 d'eau,, pour le second degré une solution de 0,6 de sang pour 100 d'eau, etc. ,

S'ensuit-il que les degrés du chromomètre ne diffèrent entre eux que de -j^ ?

Il est impossible de s'en tenir à cette appréciation.

On doit, comme nous l'avons fait pour le procédé des teintes coloriées, rapporter les écarts entre les diverses teintes aux diverses quantités de sang employées.

En procédant ainsi on obtient les chiffres suivants :

Entre le 1*' et le 2^ degrés, soit entre 5 et 6. 2* 3" — — — S' i' — — .4® 5® —

5 et 6. . .

entre le 5* et le 6* degrés, soit entre 9etl0. . . 10 0/0

Cela veut dire qu'en se trompant de 1 degré, par exemple entre le 7 et le 8, Terreur équivaudra aux 12,5 0/0 de la quantité d'hémoglobine à doser.

Mais quelle est la valeur de l'étalon d'où l'on déduit cette quantité d*hémoglobine à doser ?

Les degrés du chromomètre ne représentent que les teintes variables fournies par un sang plus ou moins dilué. M. Malassez a cru pouvoir traduire ces intensités de teintes en poids respectifs d'hémoglobine.

Pour cela- il a employé la méthode détournée que voici. Après avoir déterminé la capacité respiratoire du sang d'un chien, qui, mélangé au 100% donnait un certain degré du chromomètre, il a calculé la quantité d'hémoglobine que devait théoriquement contenir un pareil sang, et un simple calcul de proportion lui a fourni la valeur des autres degrés de son échelle.

Heureuse idée que ce calcul de proportion, car, quelque faux que soit le point de départ, on doit forcément obtenir ainsi une série de poids variant entre eux dans la même proportion que les volumes de sang.

Cependant, en dressant pour les poids donnés par M. Malassez un tableau analogue à celui que nous venons d'établir pour les volumes, nous obtenons le résultat suivant :

entre le 1*' et le 2^ degrés, soit entre 5 et 6 17,24 0/0

le 2'

et le

le 3»

et le

le 4«

et le

le 5'

et le

le 6'

et le

le 7'

et le

le 8'

et le

le 9'

et Je 10"

En comparant ce lableau au précédent on voit que par

malheur il s'est glissé des inexactitudes assez grandes dans ce calcul de proportion; mais c'est là une simple erreur de chiffres. Revenons au principe de cette graduation compliquée.

Si ce principe était exact, on devrait obtenir, en faisant fonctionner ce chromoniètre, des poids d'hémoglobine proportionnels aux quantités de sang employées.

Prenons donc l'instrument tel c^'il est gradué et mettons-le à l'épreuve.

Après avoir fait un premier mélange en prenant 1/2 de sang pour 100 d'eau, soit à ^, j'ai trouvé que cette dilution correspondait à la division 5, 5 du chromomètre. — Puis j'ai fait un second mélange en prenant 2 fois autant du même sang, c'est-à-dire à ^, et le degré obtenu a été 9. Or, la division 5, 5 correspond d'après l'échelle des poids à """<5-, 053 ; une quantité double de sang devrait donc donner un numéro correspondant à un poids double, c'est-à-dire à 0,106. Mais nous avons trouvé le n"* 9 et celui-ci ne représente en poids que 0,086. Il aurait fallu obtenir la teinte n° 11 pour trouver le poids de 0,106. L'écart qui s'est pro'duit entre nos deux déterminations pour le même sang est donc d'environ 23 0/0.

Cette expérience, plusieurs fois renouvelée, m'a toujours donné des résultats analogues, même lorsque je me suis servi de sang de chien .

Elle montre que la proportionnalité étabUe entre les poids d'hémoglobine ne correspond pas à celle des volumes de sang, par suite, probablement, de l'inexactitude du point de départ relatif aux poids ^ .

Mais comme nous ne savons pas de combien, les poids d'hémoglobine, empiriquement déterminés, diffèrent des poids réels, il est impossible d'apprécier l'importa nce des erreurs commises, et de calculer, même par à peu près, la valeur des résultais ainsi obtenus.

Que deviennent alors les prétentions de l'auteur relative-

\ Ce défaut de rapport ne serait pas sensiblement modifié si Ton corrigeait les erreurs, relativement faibles, commises dans le calcul de proportion relatif aux poids.

ment à la détermination en poids de la richesse des globules en hémoglobine, non-seulement chez l'homme, mais chez les animaux?

Nous laissons le soin de conclure à ceux qui, comme nous, se livreront à un examen attentif de cette méthode.

Nous ne pensons pas cependant que l'appareil de M. Malassez soit beaucoup plus défectueux que les autres chromométres, et il est probable qu'il pourrait donner des résultats meilleurs si sa graduation était fondée sur un principe moins attaquable ^

M. Malassez a pensé que la proportion moyenne d'hémoglobine contenue dans le globule humain était une unité trop arbitraire, et cependant, en Tabsence de dosage direct de l'hémoglobine, c'est la seule valeur qui ne nous paraisse pas trompeuse. Elle est de plus d'un emploi très-pratique, en liant forcément dans les observations la notion de qualité avec celle de nombre.

Quand on dit que des globules altérés ne valent plus que 0,60, 0,50, 0,40, etc., on sait que 100 globules du sang malade ne valent respectivement que 60, 50 ou 40 globules sains. Ces chiffres n'ont peut-être pas le même attrait que des millionièmes de millionièmes de grammes, ils n'en sont pas moins pour cela très-significatits.

i On pourrait d'ailleurs graduer ce chromomètre ainsi que le nôtre à l'aide de solutions titrées d'hémoglobine cristallisée, préparée par la méthode d^Hoppe- Seyler.