CHAPITRE PREMIER

Technique.

Dans les recherches qui ont été entreprises sur la bactériologie du conduit génital, nous croyons que la différence des résultats obtenus tient surtout à la variété des techniques employées. Aussi pensonsnous indispensable de dire longuement comment nous avons procédé. Dans les chapitres suivants nous reviendrons sur les moyens dont nous nous sommes servi pour recueillir les sécrétions normales ou pathologiques examinées ; mais dans ce chapitre nous traiterons d’une façon générale des examens microscopiques des sécrétions étudiées, des cultures, et des inoculations pratiquées.

Toutes nos recherches ont été commencées le plus tôt possible après avoir recueilli la semence; le fait de laisser pendant 12 ou 24 heures un produit à examiner dans une pipette faussant parfois beaucoup les résultats et rendant impossible la culture des espèces

peu vivaces.

Examen microscopique. — Pour l'examen microscopique, les produits étaient étalés en couche mince sur lamelles, desséchés et fixés par les moyens usuels : chaleur, alcool ou sublimé en solution saturée. Les colorations ont été faites par le violet de gentiane en solution hydro-alcoolique, par le bleu de Læffler et par la méthode de Gram.

Nous croyons qu'il est souvent utile de laisser les lamelles se colorer longtemps dans certains liquides. Certains organismes se colorent, en effet, très difficilement, et nous n’avons pu colorer convenablement certaines espèces. L'expérience nous a montré que souvent dans ces cas, il s'était agi d’organismes anaérobies, et dans les examens ultérieurs, en poussant la coloration, nous avons pu aper-

cevoir des organismes qu'une préparation rapide ne nous avait pas

montrés et que cependant les cultures anaérobies avaient permis d'isoler.

Cultures. — Tous les auteurs qui se sont occupés de la bactériologie des organes génitaux de la femme et en général tous ceux qui: se sont occupés de la bactériologie des muqueuses ont été frappés de la richesse extrême des espèces bactériennes que l’examen direct permet de constater, et de la difficulté de retrouver en culture pure toutes les formes vues au microscope sur lamelles. Le plus souvent les auteurs se sont contentés d’ensemencer sur un seul milieu de culture, l’agar par exemple, qui permet à beaucoup d’espèces de se développer et les conclusions qu’ils ont tirées ne sont vraies que visà-vis de ce milieu.Cette manière de faire est insuffisante. Aussi avonsnous cherché dans chaque cas par la culture systématique sur des milieux très variés, à isoler toutes les espèces microbiennes même les plus fragiles, pour pouvoir les identifier. :

Dans les premiers temps , nous ensemencions sur plusieurs milieux en culture aérobie, faisant chaque fois pour chaque milieu un assez grand nombre de tubes. Plus tard nous avons vu que cette technique était absolument insuffisante ; qu’il fallait pour chaque cas entreprendre une recherche aussi complète que possible des espèces anaérobies qui pouvaient se trouver dans les sécrétions examinées.

Les résultats de ces recherches ainsi pratiquées sont encore. très incomplets. Quand on s’est occupé de la recherche des organismes anaérobies, on se rend compte, en effet, que souvent bien des espèces peuvent échapper, soit qu’elles meurent très rapidement, soit qu’il soit impossible de les obtenir à l’état de pureté. Aussi croyons-nous n'avoir que dans un nombre de cas restreints pu cultiver et isoler toutes les espèces contenues dans les produits examinés.

Un des grands défauts de notre méthode d’étude, aussi complète que possible, de chaque cas particulier, est la lenteur même du travail. Le grand nombre de tubes employés, la variété des milieux de cultures, la vérification des colonies, la séparation des espèces anaérobies n’autorisent que l'étude de quelques faits ; mais nous croyons

que quelques cas examinés aussi complètement que possible valent

Rue

plus que les longs tableaux d'examens bactériologiques donnés dans les littératures étrangères ; tableaux qui portent souvent sur des centaines de cas étudiés fatalement d’une façon incomplète,

CULTURES DES MICROBES AÉROBIES. — Nous avons toujours ensemencé sur un grand nombre de milieux différents, pour nous mettre dans des conditions capables de révéler les espèces aérobies les plus variées.

Ces milieux ont été : la gélose (1) au bouillon ordinaire peptonisé, le sérum de bœuf solidifié, la gélatine, de la gélose sur la surface de laquelle on avait répandu quelques gouttes de sang humain, la gélose sérum de Wertheim au sérum de sang de lapin. au sérum de sang de bœuf, et enfin la gélose mélangée avec un tiers du liquide d’ascite de provenance humaine (2).

L'expérience nous a montré que, pour l'isolement, la gélatine ne donnait aucun bon résultat, et que le meilleur moyen était d’employer concurremment la gélose ordinaire alcaline, le milieu de Wertheim, le sérum de bœuf solidifié, et l’agar avec lesang humain.

Les ensemencements étaient faits, soit en plaques dans des boîtes de Petri, soit en stries, soit enfin par le procédé que Veillon (3) préconise dans sa thèse, pour isoler les microbes des angines.

Les boîtes de Petri sont incommodes ; la dessiccation s’y fait très rapidement, les colonies dans l’épaisseur de la gélose ne se différencient pas assez facilement. Ce qui nous a le mieux réussi est, comme nous le disions, l’ensemencement, en surface, sur les milieux contenus dans des tubes assez larges, après dissociation préalable dans le liquide exsudé au fond du tube. On étale ainsi avec soin le pus sur le milieu nutritif, et on a de véritables plaques en surface. Les colonies sont en milieu humide, à l'abri des impuretés, et peuvent être facilement différenciées par leur aspect macroscopique et microsco-

pique.

(1) Notre gélose est à 1 1/2 0/0, de sorte que la surface en est très humide, et qu’il reste toujours un peu d’eau au fond du tube.

(2) L'expérience nous a montré que le liquide -ascitique des néphrites aiguës était le meilleur liquide organique à employer,

(8) A. VeicLon, Recherches sur l'éliologie et la pathogénie des angines aiguës non diphtériques. Thèse Paris, 1894.

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I faut avoir soin, pour chaque milieu employé, de faire plusieurs tubes avec des quantités inégales de pus et de faire des dilutions de plus en plus étendues.

Toutes les cultures ont été portées à la température de l’étuve.

Après vingt-quatre heures, quarante-huit heures, etc..., nous prenions le signalement des colonies développées et par des réensemencements successifs, nous obtenions des cultures pures de tous les organismes qu’il était alors facile d'identifier. La pluralité des milieux employés nous mettait dans les meilleures conditions pour obtenir tous les microbes existants dans chaque cas.

CULTURES DES MICROBES ANAÉROBIES. — Dans un grand nombre de cas nous avons fait des ensemencements pour la recherche des anaérobies.Au début nous ne faisions pas systématiquement cette recherche, mais nous avons pu nous assurer par les résultats obtenus qu’il était indispensable pour les cas même les plus simples de se préoccuper de ces microbes, si on voulait se faire une idée complète du contenu bactérien d’un pus ou d’une sécrétion.

La technique que nous avons employée est un des procédés indiqués par Liborius (1), un peu modifiée et surtout appliquée à un but différent. Elle nous paraît la meilleure et nous croyons indispensable de la donner en détail.

Nous nous sommes servi pour ensemencer de gros tubes à essai que l’on remplissait jusqu'aux deux tiers au moins d’agar sucré. Notre agar était ainsi composé :

Viande de bœufs Hi, 0, 0e 2e Obs DA DATA PA LEUR ARS HAT LEE Baie 1 litre A BAT EH RTE ER ES SRE IR AS EE Sel Marin TUE SRE SRE ù gr.

Pépiône ‘SRE MMM ET ASE Giyoose PESTE SERA EL

Nous nous arrangions pour que l’agar eut toujours une réaction alcaline,

On arrive en procédant le plus rapidement possible à obtenir un

(1) LiBorivus, Beiträge zur Kenniniss der pi ee der Bake- * rien. Zeitsch. f. Hyg., Bd I, 188.

AS à ir

milieu extrêmement transparent, indispensable pour bien distinguer les colonies de la profondeur du tube.

Il ne faut pas laisser le sucre se caraméliser, sans cela le milieu devient brunâtre et opaque ; aussi est-il bon de n’ajouter la glycose fondue qu'au moment où on colle l’agar avec l’albumine de l'œuf. 1] ne faut pas porter le mélange au delà de 120°.

Il est préférable de préparer à la fois 2 kilogr. d'agar, la recherche des anaérobies par cette méthode usant une grande quantité de milieu nutritif.

ENSEMENCEMENT ET ISOLEMENT. — Les auteurs qui ont employé les tubes d’agar sucré ont souvent procédé par piqüre. Cette méthode qui permet la culture des microbes, rend à peu près impos- Sible la séparation des espèces ; aussi nous servons-nous de la méthode suivante qui permet de séparer des colonies poussées dans la profondeur d’un milieu transparent.

On fait fondre les tubes au bain-marie, on attend l’ébullition de l’eau, puis on laisse refroidir les tubes, et au moment où ils vont se solidifier (38°-40°), on introduit la semence avec une pipette et on agite le mélange. Sans recharger la pipette, on la plonge successivement dans une série de tubes semblables pour obtenir des dilutions de plus en plus étendues. Après l’ensemencement, on met immédiatement les tubes dans l'eau froide pour solidifier rapidement le milieu.

Chaque organisme se trouve ainsi, à l’état isolé, disséminé dans l'épaisseur même de la gélose. La colonie à laquelle il donnera naissance sera donc pure et séparée. Selon le degré de dilution les colonies seront plus ou moins éloignées, et, si on a eu soin de faire - des ensemencements en nombre suffisant, on obtiendra des tubes contenant une dizaine de colonies au plus. Il sera facile de saisir avec une pipette à longue effilure une colonie isolée sans toucher

les autres (1).

(1) La technique que nous venons d'exposer rapidement a été donnée en détail par MM. VæiLLon et ZUBER dans un mémoire récent (Archives de médecine expérimentale, juillet 1898). On trouvera dans ce travail un exposé critique des différentes méthodes de culture des microbes anaérobies et les raisons qui nous ont fait choisir le procédé que nous avons employé.