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Les tubes sont placés dans l’étuve à 37°.

Les résultats sont très variables suivant le nombre et la nature des germes introduits.

Dans certains cas, aucun germe ne se développe, ce qui peut tenir ou bien à ce que le produit ensemencé était stérile ou contenait des microbes ne poussant pas sur ce milieu (gonocoque, bacille de la tuberculose, de la grippe, etc..….).

Mais d'une façon générale, tous les microbes qu'ils soient aérobies, anaérobies facultatifs ou anaérobies stricts, poussent sur ces tubes. Les facultatifs se développent jusqu’au fond du tube ; les aérobies obligés, seulement vers la surface jusqu’à une distance variable suivant l’agar, le microbe ensemencé, etc.

Quant aux anaérobies stricts, leurs colonies cessent de se déve lopper à un ou deux centimètres environ de la surface de l’agar à

“une distance également variable suivant l’espèce et le milieu. Chose remarquable, et que nous n'avons. pu encore expliquer, il arrive souvent que les colonies les plus près de la surface et qui constituent généralement un plan parallèle à celle-ci, acquièrent un développement plus considérable que les colonies situées au-dessous.

Les produits ensemencés contenant le plus souvent des espèces aérobies, on comprend que celles-ci lorsqu'elles sont facultativement anaérobies, génent beaucoup pour isoler les anaérobies stricts ; aussi quand les ensemencements ont été trop abondants, il est impossible de se rendre compte s’il existe ou non des espèces strictement anaérobies poussées au milieu des autres espèces.

Cependant l'examen attentif de toute la série des tubes ensemencés permet souvent de supposer que certaines colonies de la profondeur sont des colonies de microbes anaérobies stricts. En effet, les microbes aérobies forment des colonies ayant le même aspect sur toute la hauteur du tube. Les anaérobies s’arrétent à une certaine distance de la surface. Ce qui permet de se rendre compte de Ja proportion relative de chacune des espèces.

Les microbes aérobies se développent généralement plus vite que les microbes anaérobies dont beaucoup ne donnent de colonies visibles qu'après trois ou cinq jours.

EXAMEN DES COLONIES. — Dans les tubes où les colonies sont bien séparées, on peut facilement les examiner sous le microscope à un grossissement faible (obj. 0 ou obj. I) à travers le tube de verre couché sous l'objectif. Les colonies d’anaérobies ont quelquefois des aspects assez spéciaux ; mais le plus souvent rien ne les distingue des autres.

Pour faire des examens microscopiques, il faut puiser purement dans une colonie, Pour cela, on se sert de pipettes-effilées (1) avec

- lesquelles on va toucher une colonie bien isolée et en ayant soin de ne pas toucher aux colonies voisines pour obtenir une préparation pure et d'autre part ne pas infecter le reste de la culture. Les jours suivants en effet il sera nécessaire de faire des prises successives pour examiner ou ensemencer les colonies qui apparaissent tardivement. Cette pêche est parfois assez délicate ; elle doit quand les colonies sont très petites, être faite sous la loupe ; elle nécessite parfois l’emploi d’un aide qui aspire dans la pipette, pendant qu'on maintient son extrémité effilée sur la colonie à saisir.

IL'est d’autres difficultés qui ne sont pas spéciales à cette méthode, mais existent dans toutes les recherches de culture des anaérobies. La production de gaz est un fait des plus fâcheux pour l'isolement

. des espèces. Dans ce cas en effet, la gélose est fragmentée et dans les interstices comme à la surface s’amasse une certaine quantité de liquide exsudé du milieu sous l’effet de la pression. [l devient alors impossible d'aller cueillir une colonie sans qu’un peu de ce liquide qu’on est obligé de traverser, monte un peu dans l'effilure et vienne ainsi souiller la prise qu'on voulait faire. Mais si on a eu soin de faire des dilutions suffisantes de façon à obtenir des tubes ne contenant que très peu de colonies, la production gazeuse est incapable de fendre la gélose et on peut saisir purement les colonies.

COLORATION DES ESPÈCES ANAÉROBIES. — Les espèces anaérobies sont souvent assez difficiles à colorer sur lamelles. En effet en même

temps que la colonie, on étale une certaine quantité de gélose qui se

(1) Ce procédé a l’avantage de ne pas sacrifier le tube, et est supérieur à celui qui consiste à découper en tranches minces l'agar préalablement sorti du tube par chauffage de ses parois.

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laisse mal pénétrer par la couleur ou bien se colore trop forte ment et empêche de voir les microbes qu’elle contient. Mais en dehors de cette gêne causée par l’agar, les microbes anaérobies se colorent d'eux-mêmes parfois très mal ; quelques-uns même presque pas. Les couleurs qui nous ont le mieux réussi, sont encore le violet de gentiane, le Ziehl dilué, le bleu de Leœffler. 3

La manière dont les microbes anaérobies que nous avons rencontrés se sont comportés vis-à-vis de la méthode de Gram est à signaler. Cette méthode si précieuse pour la séparation grossière des espèces aérobies, perd ici un peu de son importance. Si beaucoup d'espèces réagissent d’une façon très nette, quelques-unes sont en quelque sorte indifférentes. =

CULTURE SUR AGAR ASCITE SUCRÉ EN TUBES PROFONDS. — Nous avons plusieurs fois ensemencé nos colonies anaérobies sur un mi- Jieu qui paraît souvent très favorable aux espèces délicates. Nous ajoutions à notre gélose sucrée fondue un quart de liquide d’ascite. Nous avons par ce moyen pu rajeunir des espèces que nous croyions mortes.

CULTURE SUR GÉLATINE SUCRÉE EN TUBES PROFONDS. — Ce milieu est très inférieur à l’agar ; il ne permet que le développement des espèces qui se développent à la température de la chambre.

CULTURE DES ANAÉROBIES SUR MILIEU LIQUIDE. — Les milieux liquides servent surtout pour les inoculations aux animaux. La manière de pousser des espèces anaérobies en milieu liquide, ne nous paraît pas un caractère différentiel important. Tous #ôs microbes se sont développés à peu près de la même façon. Il se forme d’abord de petits flocons nuageux dans la profondeur, flocons qui augmentent d'épaisseur, flottent dans le liquide, puis retombent au fond. Ra- rement le liquide est troublé uniformément ; quelquefois il se fait un très léger voile.

Nous avons employé comme milieu liquide le bouillon sucré alcalin, contenu dans des éprouvettes épaisses. Le vide était fait, aussi complètement que possible, à la machine pneumatique. Nous fer-

mions ensuite à la lampe. Nous ne décrirons pas la technique de cette méthode qui est classique.

CULTURE EN SURFACE. — Nous avons employé les tubes de Roux également classiques (1).

Inoculations aux animaux des espèces anaërobies. — Les inoculations ont été faites au lapin et au cobaye sous la peau et dans le sang du lapin par une veine de l'oreille.

Les cultures sur milieu liquide étant toujours longues et difficiles, nous nous sommes souvent servis, pour inoculer, de nos tubes de culture en milieu solide. Nous avons ainsi en même temps que les organismes, introduit sous la peau, un ou plusieurs centimètres cubes d’agar. Ces inoculations avec agar se font aisément avec la seringue de Roux, armée d’une forte canule.

Il y avait lieu de se demander pour contrôler les résultats, si l’agar introduit en même temps que les cultures ne faussait pas les recherches. A cet effet nous avons souvent introduit sous la peau du lapin ou du cobaye des quantités notables d’agar stérilisé sucré. Nous avons toujours observé une résorption très rapide du milieu sans effet nocif ; vingt-quatre heures suffisent parfois.

Du reste, nos expériences montrent la légitimité des résultats de notre méthode. En effet, tandis que certaines espèces anaérobies inoculées avec l’agar du tube donnent presque constamment des abcès, d’autres espèces inoculées n’ont jamais d'action pathogène.

Nous croyons cependant que l’agar facilite la formation des abcès. Les inoculations en milieu liquide ne donnent pas les mêmes résultats presque constants.

Nous n'avons inoculé que les espèces obtenues à l’état de pureté.

(1) Roux, Sur la culture des anaérobies. Annales de l'Institut Pasteur, n° 2, p. 49, 1887.