RECHERCHES BIOLOGIQUES SUR LA BILIRUBINE
Elles comprennent :
1° L'emploi de ce pigment comme colorant histologique ; 2° L'étude de sa toxicité;
3° Ses relations avec le pigment sanguin, l’hématine.
[. Bilirubine colorant de tissus. — Nous ne dirons que quelques mots : il s’agit d'ailleurs plutôt d’une curiosité de laboratoire.
En solution chloroformique la bilirubine possède un pouvoir colorant très intense : « à r pour 40.000 elle colore encore les tissus » (DasrRe et FLoREsco).
En solution alcoolique elle se comporte vis-à-vis des éléments histologiques comme l’aurantia.
Les coupes après coloration des noyaux par l’hématéine ou l’'hématoxyline sont lavées à l’eau, puis déshydratées et traitées par la solution alcoolique de bilirubine jusqu’à teinte nettement jaunâtre. On les lave très rapidement à l'alcool, puis à l’essence de girofle et on monte au baume.
Le pigment se fixe sur les protoplasmes et de préférence sur les globules rouges, les fibres conjonctives ou musculaires qu'il teint en jaune.
IT. Toxicité de la bilirubine. — Comme toutes les questions relatives à la bile, celle-ci a été particulièrement étudiée. Les premiers auteurs s'étaient bornés à constater la toxicité de la bile totale, ‘par injections intraveineuses ou sous-cutanées. Puis dès que les progrès de la chimie eurent permis d'isoler
les sels ou les acides biliaires on observa que ces sels introduits dans l’organisme possédaient une toxicité différente de la bile (V. Duscn, Leyoen, Fecrz et Rirrer). Plus tard'la séparation des divers sels biliaires conduisit à rechercher la toxicité de chacun d’eux (Boucuarp). La question de la nocivité des substances pigmentaires de la bile fut soulevée pour la première fois par ce dernier auteur qui établit que la bile perd une grande partie de sa toxicité (66 0/0) lorsqu’on la prive de ses pigments par un traitement au noir animal, Ces résultats furent confirmés depuis par pe BruIN et Srocvis, et complétés par les recherches de CHarix et CaRNoT qui montrèrent que les effets hypothermisants de la bile doivent être attribués aux pigments biliaires.
Boucarp (1), Taprer et°De BRuIN (2) fixent à o gr. 05 par kilogramme d'animal la dose toxique de la bilirubine.
Nous avons repris les mêmes recherches en faisant remarquer, comme Rywoscx, les imperfections de leur technique. Ils utilisaient en effet comme solvant du pigment biliaire la lessive de soude étendue. Or on sait et nous avons vérifié que des quantités mêmes très faibles de soude caustique intro-
duites sous la peau provoquent des lésions graves, locales et générales ; lorsqu’elles sont faites en péritoine les animaux succombent avec des symptômes de péritonite exsudative.
Nos premiers efforts ont porté sur une solubilisation non toxique par elle-même du pigment.
La bilirubine bien pulvérisée est dissoute dans le plus faible volume possible de lessive de soude, puis additionnée d’eau distillée. On neutralise exactement au tournesol l’alcali par HCI, puis on ajoute du carbonate de soude en solution étendue. On filtre et on fait un volume connu.
La liqueur contient en solution du pigment, du chlorure de sodium et du carbonate de soude. Elle possède une belle
{1) Boucran», Les auto-intoxications.
(2) Boucnanp et Tapret, J. pe Brun, Akadem. proefschr. Amsterdam. 1889. |
coloration orangée : la réaction est légèrement alcaline, et Ja sayeur à peine saline.
Il est indispensable d'employer d'abord la soude pour dissoudre la bilirubine; le carbonate de soude impuissant à remplir ce rôle de solvant peut lui être substitué après cette première dépolymérisation ou.hydratation du pigment.
Les quantités de carbonate de soude pouvant être employées sans danger avaient été déterminées par des expériences préliminaires,
Nous avons d’abord injecté dans ce but à 5 cobayes, sous la peau ou en péritoine des volumes connus d’une solution contenant 2 gr. 64 o/o de carbonate de soude pur et sec.
Cobaye n° 1 (poids= 425), cobaye n° 2 (poids = 480), reçoivent 5 centimètres cubes de cette solution en péritoine.
Cobaye n° 3 (poids = 340), cobaye n° 4 (poids = 405), reçoivent 5 centimètres cubes en péritoine et 5 centimètres cubes sous la peau.
Cobaye n° 5 (poids =420), cobaye n° 6 (poids =380), reçoivent 10 centimètres cubes sous la peau.
Quatre de ces animaux ont succombé en moins de 24 heures ayec des lésions graves de péritonite exsudative et d'infiltration au niveau des inoculations hypodermiques.
Deux seulement ont résisté, les n°* 4 et 5, après être restés pendant 3 jours très malades, sans force, sans appétit.
Dans une deuxième série d'expériences, nous avons injecté une solution renfermant seulement 1 gr. 32 de carbonate pur et sec.
Cobaye n° 7 (poids = 308), reçoit 10 centimètres cubes en péritoine.
Cobaye n° 8 (poids=405), » » » »
Cobaye n° 9 (poids —450), reçoit ro centimètres cubes sous la peau. Cobaye n° 10 (poids=41o), » » » »
Cobaye n° 11 (poids —480), reçoit 10 centimètres cubes en péritoine et 3 centimètres cubes sous la peau.
Aucun de ces sujets n'a succombé, 48 heures après l'injection ils avaient retrouvé leur vigueur primitive.
La dose toxique de carbonate de soude est donc comprise entre ces deux chiffres : 2,64 et 1,32.
Dans les recherches suivantes faites avec la bilirubine, nous sommes toujours restés au-dessous de la limite inférieure, c’est-à-dire au-dessous de 1 gr. 32 0/0.
Première série d'expériences, — o gr. 4596 de bilirubine sont dissous
dans 2 centimètres cubes de lessive de soude que l’on étend d'eau à 25 centimètres cubes ; on neutralise exactement par l'acide chlorhydrique dilué et aussitôt on aïoute 4 centimètres cubes d'une solution de CO%Na?
à 13,33 0/0. On filtre et on fait un volume de 125 ce. contenant par conséquent o gr. b28 de sel sec.
14 février. On inocule 5 cobayes avec cetté solution.
Cobaye n° 1 (poids=545), reçoit 2 centimètres cubes sous fa peau, cuisse droite, 3 en péritoine.
Cobaye n° 2 (poids —470), reçoit 4 em® 1/2 en péritoine.
Cobaye n° 3 (poids —59o), reçoit & centimètres cubes sous la peau de la cuisse. :
Cobaye n° 4 (poids =455), reçoit 5 centimètres cubes sous la peau de la cuisse.
Cobaye n° 5 (poids=—330), reçoit 5 centimètres cubes en arrière de l'épaule droite.
Le 15, les animaux paraissent un peu gênés dans leur mouvement.
Le 16, ils ont repris leur aspect normal.
Le 17, on les inocule à nouveau avec des quantités plus grandes de liqueur, tous reçoivent 10 centimètres cubes, 5 centimètres cubes en péritoine, et 5 sous la peau.
Le lendemain et les jours suivants les animaux sont affaiblis, indolents, ne mangent pas ou très peu ; l’abdomen est volumineux, tendu, sensible, puis assez vite ces phénomènes aigus s’atténuent et disparaissent.
L'urine n’a jamais paru pigmentée d’une façon anormale.
Les inoculations sous-cutanées ont provoqué des lésions locales, œdémateuses, douloureuses, qui très rapidement ont évolué vers la cicatrisation fibreuse ou bien souvent ont abouti à des nécroses plus ou moins étendues.
Le pigment luismême a parcouru le cycle classique de ses transformations. Dès que les phénomènes aigus se sont atténués on constate au niveau des injections hypodermiques que le tégument devient jaune orange, puis jaune pâle, vire au vert et enfin disparaît en l’espace de 10 jours environ.
Ces animaux ont été sacrifiés en pleine santé pour suivre l’évolution progressive du pigment biliaire.
Le 24 février on tue le cobaye n° 1 (poids=h10, perte de poids 35 gr.) qui a reçu 7 centimètres cubes sous la peau et 8 centimètres cubes en péritoine.
Autopsie : Au niveau de l'injection sous l'abdomen il existe un dépôt fibrineux de la grosseur d’une petite noisette, de coloration légèrement orangée, et entourant ce noyau en voie d'organisation fibreuse, une légère infiltration jaunâtre.
Dans le péritoine, présence de traces de pigment, mais ayec des localisations assez spéciales ; le feuillet pariétal est normal sauf au niveau des gaines vaginales qui sont fortement teintées en jaune safran.
Le tissu adipeux contenu entre les deux lames du feuillet mésentérique présente une coloration générale jaune serin mais beaucoup plus net-
tement accentuée le long des vaiseaux lymphatiques ; les ganglions situés sur leur parcours sont vivement colorés et attirent de suite l'attention.
La localisation pigmentaire est surtout abondante dans toute l’étendue du grand épiploon qui offre l'aspect d'une fine dentelle jaune d’or avec des ponctuations de teinte plus foncée qui sont constituées par des granulations lymphoïdes.
Les viscères abdominaux et thoraciques ne présentent rien d’anormal. Urine et bile de la vésicule sans coloration ictérique.
28 février. Le cobaye n° 3 est tué (poids=570, perte 20 gr.), reçu 5 centimètres cubes sous la peau de la cuisse et 10 centimètres cubes en péritoine.
Autopsie : Au niveau de la peau petit foyer de nécrose, fortement pigmenté, sans teinture périphérique ; le ganglion inguinal englobé dans la lésion est fortement hypodermique mais à pee coloré.
Dans la cavité abdominale la bilirubine est uniquement localisée aux gaines vaginales, aux granulations lymphatiques du mésentère et surtout à la partie du grand épiploon voisine du foie.
3 mars. Cobaye n° 2 (poids= oo, perte 70 gr.).
On lui a injecté 10 centimètres cubes sous la peau en deux régions et 5 centimètres cubes en péritoine.
Autopsie : Il ne subsiste sous la peau que deux petits foyers fibreux presque décolorés, le tissu conjonctif périphérique à sa coloration blanche habituelle.
L’ absorption de la bilirubine au niveau de la peau est donc totale au bout de 20 jours environ.
Dans le péritone les seules traces de pigméntation se trouvent le long de la chaîne ganglionnaire mésentérique et sur toute l'étendue de l’épiploon.
3 mars. Cobaye n° 4 (poids = 350, perte 105 gr.).
Les lésions de la peau sont totalement décolorées ; il ne subsiste qu’un faible épaississement fibreux.
Dans le péritoine : rares granulations jaune- -orangées dans toute l’étendue de l’épiploon et le long du bord mésentérique de l'intestin. On saisit sur le vif la disparition progressive du pigment ; en effet certains ganglions possèdent encore une teinte jaune extrêmement pâle, d’autres ont déjà une partie de leur substance complètement incolore.
5 mars. Cobaye n° 5 (poids= 340, augmentation 10 gr.) .
On ne retrouve aucune trace des injections hypodermiques.
Le grand épiploon est seul coloré.
2e série d'inoculations, avec la même solution de bilirubine.
14 mars. Cobaye n° 6 (poids —6925), reçoit 10 en périloine, 5 centimètres cubes sous la peau du flanc:
Cobaye n° 7 (poids=/28), reçoit 10 en péritoine, 6 centimètres cubes sous la peau du flanc.
Cobaye n 10 (poids =518), reçoit 10 en péritoine, 8 centimètres cubes en deux injections à la cuisse.
Cobaye n° g (poids = 395), reçoit 8 en péritoine, 4 centimètres cubes sous la peau.
Le 15 mars le cobaye n° 8 est trouvé mort dans sa cage.
Autopsie : Au niveau des points d’inoculation, sous la peau, larges foyers œdémateux, avec au centre des traînées nettement verdâtres ; sur la coupe s'écoule une petite quantité de solution injectée la veille et qui n'a pu être résorbée.
Dans la cavité abdominale, exsudat abondant, fortement coloré en orangé ; tous les organes sont imprégnés de pigment.
Les autres animaux après quelques jours d’ ‘abattement guérissent el sont sacrifiés à des dates difiérentes.
23 mars. Le cobaye n° 6 (poids —560, perte 65 gr.) est tué.
Noyau fibreux sous-cutané jaune pâle, même coloration du üssu conjoncui périphérique.
Localisation du pigment aux ganglions mésentériques et à l’épiploon.
Ce qui frappe le plus à l'examen de ce cadavre c'est une teinte jaune clair de lous les tissus sauf les cartilages, les os et les muqueuses externes et internes.
C’est là le caractère des ictères chroniques.
4 avril cobaye n° 7 (poids — 380).
Même répartition du pigment ; ictère chronique avec en plus ici coloralion jaune des cartilages du cercle de l’hypochondre.
Le contenu de la vésicule biliaire est d'un très beau jaune safran ; c'est le seul exemple où nous ayons constaté si nettement le passage de la bilirubine dans la vésicule et par conséquent son élimination par le foie.
13 avril. Cobaye n° 9 (poids= 380).
Lésions sous-cutanées totalement guéries.
Dans l’abdomen rares localisations pigmentaires au système Iymphatique intestinal ; mais la coloration n’est plus ni orangée, ni jaune, mais tend vers une teinte brunâtre, indice de l’évolution sur place du pigment.
Dans ces expériences, nous n'avons eu qu'un cas de mort, la dose toxique n’a donc pas été atteinte ; mais nous avons pu suivre l’évolution de la bilirubine dans l'organisme, son absorption, sa répartition et la durée d'’élimination.
Après son introduction sous la peau, la bilirubine subit sur place l'évolulon classique difficile d’ailleurs à observer à cause de la pigmentation de la peau chez le cobaye.
Dès le deuxième jour le tégument commence à se teindre très discrètement en jaune, puis dans les jours suivants au centre de cette zone devient visible par transparence une teinte verdâtre qui imprègne les couches profondes du derme. Bientôt toute trace apparente de pigmentation disparaît. L'élimination du pigment demande un temps relativement long qui dépend surtout des lésions locales qui accompagnent l’inoculation. Lorsqu'il se fait un foyer de nécrose, la bilirubine qui l’imprègne ne subit aucune modification ; au contraire lorsqu'il s’agit d'une simple sclérose du tissu conjonctif, l'absorption se poursuit RS et devient complète après 25 à 30 jours. L'évolution intra-péritonéale se fait parallèlement à
la précédente, il se produit d’abord une imprégnation de tous les orgañies viscéraux comme on l’a constaté sur le cobaye (n° 8). Puis la résorption s'opère rapidement sur toute la surface péritonéale ; dès le g° jour (cobaye n° 1) on ne retrouve plus que des localisations dans les gaînes vaginales, dans les vaisseaux et les ganglions lymphaetiques du mésentère et sur toute l'étendue du grand épiploon ; au bout de 25 à 3o jours l’imprégnation des vaginales, et des lymphatiques à cessé ; 1l ne reste de traces de pigments que dans les ganglions mésentériques et dans l’épiploon. Un minimum de 35 à Lo jours est nécessaire pour que l'élimination soit totale aa niveau du péritoine.
La disparition du pigment se fait par passage dans la circulation générale mais à cause de sa lenteur «lle passe inaperçue ; dans un seul cas nous avons pu cependant là surprendre : le cobaye n° 6 sacrilié g jours après injection a présenté une infiltcaton ictérique généralisée.
15 avril. 8° série d'expériences, faites avec une solution plus riche en pigment. 1 gr. 052 de bilirubine sont dissous dans 3 cc. 6 de soude étendue; on neutralise avee HCI puis on ajoute 2 centimètres eubes de solution de CofNa? à 13,33 0/0 et on fait un volume de 5o centimètres cubes.
La nouvelle solution contient done 2 gr. 10 o/o de matière colorante. Le 16 avril on inocule 4 cobayes.
Cobaye n° 10 (poids —35o), reçoit 10 centimètres cubes en péritoine. Cobaye n° 11 (poids =480), reçoit 10 centimètres cubes en péritoine: Cobaye n° 12 (poids 525), reçoit 5 centimètres cubes en péritoine et centimètres cubes sous la peau.
Cobaye n° 13 (poids=525), reçoit 5 centimètres cube en péritoine et centimètres cubes sous la peau.
Le 18, le cobaye n° 10 a succombé.
Dans la cavité abdominale, présence d’une petite quantité de liquide séro-sanguinolent à peine coloré en jaune ; la presque totalité du pigment est déjà fixée sur les gaines vaginales, mésentère et épiploon.
Urine et bile de la vésicule, normales.
Le 19, sur le cadavre du cobaye n° 11, localisations identiques de la bihrubine.
cr
Le 22 mort du n° 12. Volumineux œdème en plaque avec exsudation fibrineuse, coloration générale jaune orangée et verdâtre par places.
Le 28, on sacrile le n° 13, qui après 8 jours de maladie a repris le dessus; imprégnation de la peau et du tissu conjonctif sous-eutané, localisations péritonéales signalées plus haut.
2 mai. 4 série d'expériences. Anoculation de doses massives de même solution.
Cobayes n°° 14 et 15, reçoivent 10 centimètres cubes sous la peau et 5 centimètres cubes en péritome.
Cobayes n° 16 et 17, reçoivent 10 centimètrés cubes en péntoine et 5 centimètres cubes sous la peau.
Les deux premiers meurent le 4 mai ; au niveau de la région d’inoculation, large foyer fibrineux vert-émeraude au centre, jaune-oranñgé à Ja périphérie et jauhe pâle au loin.
Dans le péritoine, congestion de tous lés organes, ét forte teinte ofatigée de toute la séreuse.
La vésicule biliaire du cobaye n° 15 renferme de la bile fortement colorée en jaune, recueillie et épurée au chloroforme, on isole de la bilirubine.
C'est le deuxième cas où où a retrouvé le pigment dans la poche biliaire ; ici cette observation acquiert une importance considérable de ce fait que le passage dans la bile commence très rapidement, deux jours après l’injecton.
Cette observation permet de conclure que l'élimination du pigment se fait par le foie et de là par l'intestin.
L'appareil urinaire ne joue donc pas le rôle d’émonctoire physiologique vis-à-vis de ces produits biliaires ; ce n’est que dans les ictères graves que cela a lieu.
Les cobayes n°% 15 et 16 meurent le 5 avec des lésions identiques, mais sans modifications de la bile.
Au point de vue toxicité en conclut de ces expériences que la dose mortelle pour le cobaye est d'environ o gr. 525 de bilirubine cristallisée par kilogramme d'animal, en injection intrapéritonéale, et qu'elle est encore supérieure par injection hypodermique. |
Ces résultats sont donc notablement différents de ceux de Boucxarp, Taprer et De BRUIN ; nous en avons vu la raison.
Nous en tirerons une autre conclusion plus générale d’ordre purement physiologique en ce qui concerne la marche de l’absorption et de l’élimination pigmentaire.
Ces deux phénomènes sont d’autant plus rapides que l’inoculation s’accompagne de lésions moindres. La production de désordres locaux, œdèmes, dépôt fibrineux fixent en effet sur place le pigment et retardent plus ou moins la diffusion de la substance, le passage dans la circulation générale.
Nous avons déjà démontré un fait semblable pour le pigment sanguin.
L’injection de solution aqueuse d'hémoglobine cristallisée s'accompagne d’une absorption très rapide, car la matière est à l’état soluble donc très facilement diffusible. Au contraire l'injection de la même quantité d’hémoglobine encore fixée sur le stroma globulaire demande un temps
jncomparablement plus long pour que l'élimination soit coms
plète; c'est que le pigment retenu à l’état insoluble ne peut passer directement dans l'économie ; aussi subit-il une lente évolution locale, une digestion intracellulaire sous l'influence des leucocytes surtout, qui aboutit à la transformation classique en pigments biliaires, jaunes, verts, bleus.
