RELATIONS ENTRE LES PIGMENTS ORANGÉS ET LES PIGMENTS VERTS DE LA BILE

Les pigments orangés sont considérés, à juste titre, comme les pigmentsles plus importants de la bile et sans doute aussi comme l’origine de tous les autres. $

Ce sont eux également qui sont les mieux connus et qui présentent par suite de leur cristallisation EE les garanties les plus solides de pureté. |

C'est deux que nous partirons pour étudier les pigments verts de la bile.

Jusqu'à présent la biliverdine a été considérée soit comme un produit d'oxydation et d’hydratation de la bilirubine classique d’après l'équation de SræpLer :

C'SH'#N°20;: + H°0 = O — C'SH?N°0: É soit comme un simple dérivé d'oxydation (Mary). C*H=°N:0° LE O0? = CHYNOS

Cette dernière, la seule admise, n’a pas en l'appui suffisamment rigoureux de l’analyse.

Elle paraît d’ailleurs traduire, sous forme de chiffres, les circonstances dans lesquelles est obtenue la transformation d’un pigment dans l’autre, qui sont, en effet, des conditions d’oxydation plutôt que d'exprimer une réaction chimique réelle.

L'analyse élémentaire est une méthode générale qui comporte seulement des approximations plus ou moins serrées ; elle devient très délicate lorsqu'il s’agit de substances de

poids moléculaire élevé (P M. — 320 ou 640 dans le cas de la biliverdine) ; d'autre part le calcul de l’oxygène repose sur une différence, et ne peut avoir la certitude des autres élé-. ments hydrogène, carbone, azote.

Tauprcuum a étudié la question de plus près ; d’après lui, la bilirubine en s’oxydant donnerait naissance à un volume d'acide carbonique égal au volume d'oxygène absorbé d’après l'équation :

C'H'NO* + O? = CHNO? + CO?

biliverdine

mais ce n’est là qu’une hypothèse, et l'auteur n’a fourni aucune démonstration expérimentale. ne

I. — Nous allons exposer brièvement une longue série de recherches sur les réactions de transformation du pigment orangé de la bile en matières colorantes vertes.

Sans les ranger en une classification systématique, nous en ferons deux groupes principaux ; les réactions en milieu alcalin et les réactions en milieu acide. Nous ne croyons pas, en effet, que l'oxydation s’il y a oxydation, soit le seul mode de verdissement des pigments orangés.

Les unes sont classiques, nous leur donnerons, l'interprétation qui nous paraîtra la plus logique, les autres sont nouvelles et recevront les développements nécessaires.

Oxydants. — L'emploi des oxydants (bioxyde de sodium, peroxyde de zinc, eau oxygénée pure) nous a donné des résultats très médiocres.

Si dans une solution alcaline de bilirubine on ajoute peu à peu de petites quantités de bioxyde de sodium on n'obtent à froid aucune coloration verdâtre ; à chaud, il se produit au contraire une décoloration totale.

MM. Huaouxexo et Doxon (1) ont basé un mode de préparation de la biliverdine sur l'emploi de Na°0° d’après la technique suivante : on mélange la poudre de bilirubine sèche

(1) Huaounene et Dovon, Archiv. de physiolog. 5] VUE, p. 525,

âveé une petite quantité de bioxyde de sodium. On ajoute goutte à goutte de l'eau, puis de l'acide chlorhydrique dilué jusqu’à saturation complète. Le mélange fonce peu à peu en couleur ; on verse encore HC] jusqu’à l'apparition de la coloration vert franc. À ce moment le magma est jeté sur un filtre et on lave jusqu'à neutralité.

Le pigment est alors repris par l’alcool absolu qui par évaporation, abandonne de la biliverdine pure.

Nous ferons remarquer tout d’abord que la transformation est rarement complète, sur le filtre une quantité appréciable de pigment reste à l’état de bilirubine; en outre l'alcool absolu entraîne toujours une petite quantité de matière orangée en même temps que de pigment vert.

Nous insisterons surtout sur ce fait que la réaction a lieu dans des conditions très spéciales : ce n’est pas le bioxyde de sodium seul qui agit, la présence d’acide chlorhydrique est absolument nécessaire. Mais alors il se produit des réactions secondaires entre l’acide et le bioxyde, mettant en liberté de l'eau oxygénée, qui elle-même brûle un certain poids d’hy- drogène de HCI; le Cl correspondant devient disponible et peut agir pour son propre compte sur la substance. Ce sont les deux équations possibles “

Na°0° + 2HCI = 2 NaCl + HO.

H°0° + >HCI= 2H°0 + CP

Ce phénomène, de simple qu’il paraît, devient ainsi fort complexe et demande une étude plus complète.

De même que le bioxyde de sodium, le peroxyde de zinc ne provoque aucune modification à froid et une décoloration partielle ou totale à chaud.

Aù sujet de l’eau oxygénée il y a une réserve importante à faire. Lorsqu'on emploie l’eau oxygénée impure du commerce on oblient assez généralement à chaud un verdissement du bilirubinate alcalin en solution aqueuse.

Cette transformation s'explique comme plus haut par la présence de petites quantités de chlorures ou d'HCI qui en

présence de réactif oxydant libèrent du CI qui alors agit sur le pigment orangé.

Au contraire l’eau oxygénée pure, distillée dans le vide, 'ne provoque pas autre chose qu'une décoloration.

En ce qui concerne l’action du bioxyde de plomb, Mary (1) a sans doute montré qu'en chauffant le bilirubinate alcalin en présence de PbO? jusqu’à ce que la liqueur commence à vérdir par addition d'acide acétique, on obtient un précipité de pigment vert, mais il n’a pas élucidé le mécanisme intime de cette réaction. Küsrer (2) qui a repris ee point particulier écrit qu’il « n'est pas certain si les produits verts préparés par Mary ont été obtenus avec l'oxygène seul ou par PbO* ».

I ajoute qu'il doit se produire en même temps qu’une oxydation une hydrolyse comme le supposait déjà Sræperer.

2. Action des alealis en solutions aqueuses, — A froid, les solutions potassiques ou sodiques de bilirubine changent insensiblement de teinte; après quelques heures de contact elles acquièrent une légère coloration brun verdâtre.

En liquéur ammoniacale, la modification est très faible.

L'addition d'acides minéraux étendus, en particulier d’hydracides (HF,HCI, HBr, HI) produit dans les solutions alcalines des variations intéressantes :

Lorsqu'on neutralise les liqueurs aussitôt leur préparation achevée, l'acide provoque la précipitation dela bilirubine sous l’aspect de gros flocons couleur rouille.

Si on fait cette neutralisation un peu plus tard, mais cependant avant qu’il n’y ait eu débutde verdissement-de la liqueur alcaline, le précipité pigmentaire a déjà changé de teinte, il présente une légère coloration verdâtre.

Enfin, après verdissement manifeste, l'addition d’acide précipite une substance floconneuse d’un bleu clair qui passe bientôt au vert foncé. Autour de chaque goutte d'acide se forme une zone bleuâtre, puis un précipité de même teinte,

(1) Mazv, Ann. der chem. u. Pharm., t. CLXXV, p. 76. (2) Küsrer, Zeitschrif fur physiolog. chem., p. 314, 1898.

el après quelques instants de contact le verdissement a Heu dans toute la masse.

Nous avons suivi au spectroscope, pas à pas, les modifications de couleur provoquées sous l’influence des acides.

Les solutions alcalines fraîches ne possèdent aucune bande dans la partie visible du spectre.

Il en est de même des solutions alcalines devenues vertes.

Au contraire, le précipité vert dissous, après lavage et dessiccation, dans l’alcool méthylique ou l’acide acétique concentré, possède une forte bande d'absorption dans le rouge, dont l’axe coïncide avec le numéro 70 de la graduation micrométrique.

Le changement de coloration se manifeste donc également par un phénomène optique très net.

En poussant plus loin ces expériences, nous avons pu faire d’intéressantes observations :

Si dans la solution alcoolique de pigment vert possédant la bande À — on ajoute de l’alcali ; cette bande disparaît en même temps que la couleur verte passe à l’orangé clair, c’està-dire à la coloration primitive de la bilirubine.

De nouveau, l'addition d’acide ramène le verdissement, etc. On obtient ainsi par le jeu des acides et des bases les successions de substance orangée sans bande et de substance verte avec bande optique. On est tenté de voir dans ces phénomènes des analogies frappantes avec les réactions colorées des phénols de la série aromatique.

Nous avons vu que le changement de coloration de la solution alcaline aqueuse de bilirubine se fait d’une façon progressive.

MM. Dasrre et FLoresco ont bien précisé les conditions de ce phénomène, et en particulier l’influence de l'oxygène.

Nous avons repris l'étude de ce point particulier.

Sur la cuve à mercure on introduit dans une éprouvette de 200 centimètres cubes, 5o centimètres cubes d’eau complètement privée de gaz par ébullition dans le vide. Puis on prépare de petites ampoules en verre mince de 5 à 8 centimètres

cubes que l’on remplit d’une solution alcaline, faite au moment même, de bilirubine cristallisée. On réalise le vide parfait dans ces ampoules en s’aidant de la chaleur et on les scelle à la lampe en évitant de chauffer trop près de la liqueur. Une ou plusieurs de ces ampoules sont introduites sous mercure dans l’éprouvette. Elles sont entraînées et viennent flotter dans la couche aqueuse; il suffit alors de les briser à l'aide d’une épaisse tige de verre. On obtient ainsi une solution de bilirubinate alcalin dans une atmosphère totalement privée d'oxygène. Cinq éprouvettes ont été préparées dans ces conditions et conservées sur la cuve à mercure, exposées à un éclairage moyen.

Nous avons constaté qu'après 5, 8 et 10 jours de contact, aucune de ces solutions n’avait subi de modification de coloration. Sur chacune d'elles nuus avons alors fait agir des solutions aqueuses d’HCI préparées à l'abri de l’air en recevant du gaz chlorhydrique, séché sur chlorure de calcium, dans de petites éprouvettes contenant de l’eau sans gaz.

Or, dans tous les cas, l’addition d'HCI a provoqué la précipitation de flocons orangés ou ocres, sans verdissément immédiat ou éloigné. Ces expériences démontrent, par voie indirecte, le rôle de l'oxygène dans ces phénomènes.

3. Action des alcalis en solutions alcooliques. — L'action à froid des alcalis en solution alcoolique sur la bilirubine est la mêmequ’en solutionaqueuse, mais beaucoup moins énergique. Cela tient à la rapide évaporation des alcools et de l’alcali lui-même dans le cas de l’ammoniac.

A chaud, cependant, le verdissement est obtenu assez vite et cela même dans une atmosphère très pauvre en oxygène.

En effet, si l’on chauffe à l’ébullition, après avoir fait le vide et en continuant l'aspiration pendant la chauffe, une solution de bilirubine dans l’alcool sodé ou potassé, on constate qu'après 10 à 20 minutes la solution orangée vire brusquement au vertémeraude. |

Mais dans cette expérience il se produit, en mème temps, une attaque profonde de la molécule pigmentaire, puisque,

Piettre 13

Et

comme nous le verrons, il y a mise en liberté de chaînes

grasses.

4. Action de composés organiques à fonctions phénoliques ou quinoniques. — Les üns sont des réducteurs : pyrocatéchine,

hydroquinone ; les autres : chlorannile et surtout benzoquinone sônt des oxydants indirects qui agissent par déshydro< génation.

Les premiers ajoutés aux solutions alcalines de bilirubine

en produisent lentement le verdissement.

Les seconds sont très actifs.

L'emploi de la quinone est fort intéressant. Il nous à fourni le moyen le plus sûr et le plus rapide de préparer le pigment vért. On fait séparément une solation alcaline de bilirubine et une solution très faiblé de quinone dans l’eau distillée, Quand elles sont tièdes, on verse goutte à goutte dans la première la liqueur quinonique en agitant. On laisse au bainmarie quelques instants, on filtre et on acidifie avec de l’acide chlorhydrique étendu, Le pigment vert précipité en larges flocons que l’on recueille, filtre, lave et sèche.

IL. Telles sont les réactions des milieux alcalins sur la bilis rubine. Nous allons étudier l’influence des acides au même point de vue de la transformation de cé pigment fondamental de la bile en matières colorantes vertes.

1. Les halogènes (CI, Br, 1) en solution chloroformique (Mary, TaupicHum) ou alcoolique (A.Jouzes, Brerry et Ranc)(1), agissent sur la bilirubine dissoute dans le chloroforme et donnent de beiles colorations vertes, vert-bleuâtres. Nous obtenans les mêmes réactions en ajoutant les halogènes à des solutions alcooliques sodées de pigment; dans ces conditions on peut engager beaucoup plus de matière qu'en utilisant le chloroforme comme solvant de la bilirubine. Dès que le sodium est neutralisé l'halogène agit sur le pigment orangé pour le transformer en pigment vert.

Plusieurs auteurs, en particulier A. Jozues (2) ont basé sur

(1) Brerry et Ranc, Société biologie.

(2) A. Joires, Archiv. f. d. ges. Phys., LXXVII et LXXV, 446,

ces réactions des méthodes de dosage de la bilirubine. Ce sont des méthodes d'intérêt purement théorique. Elles sont en effet très délicates, un très faible excès d'halogène pouvant dépasser la coloration verte et produire une décoloration totale, en outre la fin de la coloration‘est difficile à observer.

Ces réactions sont surtout précieuses pour la recherche et la caractérisation de la bilirubine.

Dans cet ordre d'idée nous signalerons une réaction beaucoup plus sensible ; c'est la coloration violette que prend la bilirubine dissoute dans le chlorure de benzyl sous l'influence des halogènes, du brome en particulier. Elle nous a permis de déceler des traces infinitésimales de pigment. La matière à analyser est traitée à chaud par le chlorure de benzyl ; après filtration ei refroidissement on ajoute goutte à goutte une solution très faible de brome dans du chloroforme ou de l'alcool. S'il y a de la bilirubine, le. chlorure de benzyl se colore fortement en violet-bleu.

2. Nous avons vu l’action des acides halogènés sur les solutions alcalines aqueuses de bilirubine, en milieu alcoolique les résultats sont un peu différents parce que le pigment ici reste dissous dans l'alcool.

L'addition de ces acides à la solution alcoolique alcaline ne produit aucun changement de coloration. Mais si on ajoute alors de l’eau oxygénée pure on observe un verdissement intense, presque instantané à chaud. Il se fait une libération d'halogène qui agit directement ou indirectement sur le pigment. Par neutralisation à l’aide d'alcool sodé on régénère la coloration orangée primitive, qu'une nouvelle acidification fait virer au vert-émeraude, etc. Après l’action première de l’eau oxygénée on obtient ainsi, sous l'influence des acides et des bases une succession régulière de colorations vertes et orangées, qui rappellent les colorations des leuco-dérivés de la chimie organique.

De même si l’on soumet la matière verte soluble dans l'alcool méthyliqué provenant du traitement acide (HCI) des

calculs biliaires, à une ébullition avec de l'alcool ou de l'acétone anhydre saturé d’ammoniac gazeux sec, on obtient une liqueur d'abord verte qui devient orangée puis par refroidissement et évaporation dans une atmosphère sèche abandonne bientôt de fines aiguilles orangées très belles. Ces cristaux repris par le chloroforme ou le mélange chloroforme et tétrachlorure de carbone redonnent les petites tables classiques de bilirubine cristallisée.

3. L'acide trichloracétique fondu au bain-marie dissout en vert-émeraude la bilirubine.

Le bromal anhydre donne une belle coloration vert-bleu.

Le chloral anhydre et pur réagit d’une façon analogue. Si dans ce liquide qui vient d’être distüillé et dont on ne conserve que le cœur de la distillation, on projette de la bilirubine on obtient instantanément une solution émeraude dont M. Fouarp a bien voulu étudier la conductibilité. Après avoir constaté que le chloral pur anhydre servant aux expériences, avait une conductibilité expérimentalement nulle, il a observé que l'addition de bilirubine provoque immédiatement l'apparition d’une conductibilité en même temps que la coloration verte apparaît. Dans une expérience faite à la température de 30°2 elle a augmenté de 97* 1% à 114,5*1—9 unités pratiques en une demi-heure. C’est 1à l’indice d’une réaction chimique continue dans laquelle se forme un composé très dissociable en ions, comme un corps à fonction acide.

Il semble bien que dans cette expérience le verdissement soit fonction d'une combinaison acide.

Cette conception est appuyée d’une façon encore plus solide par le fait suivant :

Lorsque l’on fait bouillir pendant quelques instants de la bilirubine cristallisée dans de l’acide acétique glacial, il se produit une légère coloration vert bleuâtre qui va en augmentant sans cependant devenir bien accentuée, Si alors on ajoute quelques cristaux d’un sel halogène, chlorure, bromure, iodure alcalin, aussitôt cette coloration devient beaucoup plus foncée en se rapprochant du bleu,

Ces conditions expérimentales présentent une très grande analogie avec celles qui accompagnent la préparation d’acéthémine de Nexsky et Sigser. L'addition de Na à l'acide acétique permet d'obtenir très aisément le noyau hématique du pigment sanguin, mais combiné à HCI et non libre. Il se fait un coefficient de partage entre l’acide acétique et l’acide chlorhydrique et une certaine quantité de ce dernier se combine à l'hématine en quantité d’ailleurs variable comme nous l’avons démontré M. Vira et nous.

La même réaction a-t-elle lieu ici? Nous n’avons pu encore réunir assez de matière pour doser le Cl.

La solubilité de la bilirubine dans l’acide acétique étant très faible, on ne transforme ainsi qu’une très petite quantité de pigment orangé en pigment vert, Mais on peut augmenter ce rendement de la manière suivante : dans un ballon on verse 150 centimètres cubes d’acide acétique glacial et on ajoute 5 à 8 grammes de NaCI bien pulvérisé ; on porte au bain-marie bouillant puis on fait tomber dans la liqueur goutte à goutte une solution légèrement alcaline riche en bilirubine (o gr. 50 de pigment dans 15 centimètres cubes de liqueur alcaline). Il se fait aussitôt un verdissement intense. Si l'on filtre rapidement, par refroidissement une petite quantité de la matière précipite à l’état de bilirubine cristallisée en petits prismes orangés pâles. La transformation n’est donc que partielle ; pour être complète elle exige un chauffage de quelques minutes à feu nu, à l’ébullition.

Par concentration de la solution acétique au bain-marie sous l'influence du vide et reprise par l’eau on sépare le pigment vert à l’état amorphe.

Si, au contraire, on soumet à l’évaporation à l'air libre la solution acétique préalablement concentrée à un faible volume, on obtient en même temps qu’un dépôt salin (NaCl, CH*COONàa) un précipité vert foncé qui, examiné au micro-

scope, présente les caractères suivants.

C'est un dépôt non homogène ; la majeure partie est cons-

tituée par une matière amorphe vert foncé granuleuse; l’autre partie est cristallisée sous deux formes :

— d’aiguilles groupées en étoiles, ou isolées, colorées en vert-bleu et polarisant la lumière ;

— de tout petits cristaux réunis en boule, en oursins, de coloration. verte extrêmement foncée, polarisant très peu la lumière.

Ces-expériences permettent donc d'obtenir le pigment vert à l’état cristallisé.

Nous nous réservons de revenir plus tard sur cette question. |

Ces expériences, en même temps qu'elles montrent combien sont variables les conditions dans lesquelles doivent se faire la transformation du pigment orangé en pigments verts, prouvent que la bilirubine paraît posséder très certainement deux fonctions chimiques : une fonction acide et une fonction basique.

IT. — Cette coexistence dans la même molécule de deux fonctions différentes n'est d'ailleurs pas une exception en biologie ; de très nombreux composés (acides amides, leucine, glycocolle, taurine, etc,) nous offrent des exemples de cette propriété qui leur donne la plasticité nécessaire aux exigences des réactions organiques complexes.

L'hématine, dans le groupe des pigments, est un type de ces substances ; elle se dissout volontiers dans les alcalis et les acides la précipitent à l’état amorphe de ces solutions basiques. D'autre part elle se combine aux acides halogénés (HCI), en donnant des chlorhydrates très bien cristallisés. Nexsky et SIeBER (1) ont préparé un de ces sels contenant en moyenne 5,20 0/0 de Cl, c'est l'acéthémine, C#*H#O!N'FeCl.

Avec À Vira (2) nous avons repris ces recherches des deux savänts russes el obtenu, en faisant varier les conditions, des

(1) Nensky et SIEBER.

Nexsxy et ZaLeskr, Zeitsch. für Physiol., t. XXX, 1900, p. 384. (2) Pixrrre et Vira, OC. R. Académie des sciences, p. 734, t. CXLI.

composés également cristallisés avec des teneurs variables en Cl.

Il ne serait donc pas étonnant que les deux fonctions du pigment sanguin se retrouvent dans le pigment biliaire qui en dérive si étroitement.