A. TECHNIQUES GÉNÉRALES

La réalisation de cultures de tissus végétaux est, en grande partie, conditionnée par la création d’un milieu nutritif convenable et de conditions adaptées à la nutrition des cellules que l’on veut cultiver. Les techniques’ que nous avons utilisées sont inspirées de celles qui, imaginées par Gauruerer (20), lui ont permis d'obtenir pour la première fois la survie indéfinie des tissus de Carotte. Elles en diffèrent cependant par quelques détails, car le matériel que nous avons employé nous a obligé à modifier les procédés culturaux imaginés par cet auteur, en les adaptant aux problèmes que nous devions résoudre. Nous indiquerons tout d’abord les milieux de culture que nous avons utilisés, puis les diverses méthodes employées pour prélever aseptiquement les tissus et pour effectuer le repiquage des cultures. Nous examinerons enfin les procédés dont nous nous sommes servis pour étudier la structure de ces tissus.

TL. Micreux DE cuLcrure.

Les milieux de culture employés sont relativement simples; ils renferment, dissous dans l’eau des sels minéraux, un aliment glucidique, diverses substances de croissance, et sont solidifiés par de la gélose.

L'eau utilisée dans la préparation des milieux doit être très pure, et dépourvue de tout élément organique ou minéral. L’eau distillée généralement employée dans les laboratoires est obtenue en faisant usage d’ alambics métalliques et ne peut convenir pour cet usage, car elle renferme des traces de métaux lourds très toxiques et notamment de cuivre. Il convient donc de la distiller et de la conserver dans des appareils en Pyrex.

Les sels minéraux renfermant les aliments plastiques nécessaires à la croissance de toute plante supérieure, sont fournis par la solution de Kvop() qui est utilisée après dilution de moitié. Elle est additionnée au moment de l’emploi de très faibles

@) Solution de Kwop diluée de moitié :

Eau distillée dans le Pyrex................................,....4......sssssesesessessse 1.000 cm°

Nitrate de Calcium.(NO*)? Ca, 4H°0...................4...........,.....44cseesesseresese 0,50 gr. Niirato de BotassumiNO Re ee a eme nie na eee maielele De leiote oi sleleiele late ie ee ele cities sise store 0,125 gr. Sulfate de Magnésium SO‘Mg, GA e POELE Be RE ON CE DE A TS ET ON NT LE CE 0,125 gr. Phosphate monopolassique PO‘H?K...................................................e...e. 0,125 gr.

Dissoudre les quatre premiers sels sans précautions particulières ; ajouter ensuite le phosphate monopotassique broyé, et agiter constamment jusqu’à dissolution complète, de façon à éviter la-précipitation du calcium et du magnésium sous forme de phosphates, par suite d’une concentration locale de la solution.

quantités d'éléments oligodynamiques qui sont contenus dans la solution de Berraecor U) légèrement modifiée par suppression du calcium que l'on apporte déjà avec le liquide de Kwor et par addition d’Iode qui favorise la multiplication cellulaire. Nous ajoutons une goutte de cette solution pour 100 centimètres cubes de milieux.

Comme aliment glucidique nous avons uniquement utilisé le glucose pur à des concentrations variant de 3 à 5 p. 100.

Les substances de croissance sont incorporées sous forme de solution aqueuse au moment de la préparation des milieux de culture. Nous utilisons le chlorhydrate de cystéine à la concentration de 10-5 et l’aneurine à la concentration de 10-65. L’acide pantothénique est ajouté à l’état de pantothénate de calcium, linositol et la biotine sous forme de solutions du produit pur. Nous n’avons d’ailleurs utilisé ces trois dernières substances qu'exceptionnellement, seulement dans le cas de tissus d'arbres et de plantes de la famille des Malvacées. Comme hétéroauxine, nous utilisons le plus souvent l'acide naphtyle acétique, qui présente l’avantage d’être plus stable à la lumière que l'acide indole-B-acétique. Ces substances sont également incorporées sous forme de solution aqueuse et utilisées à des concentrations variant de 10-8 à 10<.

Les tissus isolés ne supportent pas l’immersion à l'intérieur des milieux liquides, c’est pourquoi ceux-ci sont toujours solidifiés par de la gélose utilisée à la concentration de 1,2 p. 100. La gélose est physiologiquement inactive; son rôle est donc purement mécanique. :

Pour préparer les milieux de culture on commence par diluer de moitié la solution de Knor, on lui ajoute les oligo-éléments, le glucose, les substances de cfoissance, puis la gélose, et on porte lentement à l’ébullition pour obtenir la dissolution complète de ce dernier produit. La solution nutritive est ensuite filtrée, puis répartie dans des tubes de culture de 16 centimètres de long sur 24 ou 30 millimètres de diamètre, et enfin stérilisée à l’autoclave à 110° pendant 20 minutes. À condition que les milieux ne soient pas alcalins, ce qui est habituellement le cas, toutes ces substances peuvent supporter 110°; toutefois, il ne faut pas dépasser cette température, car alors la vitamine B, s’hydrolyse assez rapidement ; les autres facteurs de croissance, hétéroauxine, cystéine, inositol, acide pantothénique et biotine, sont, au contraire, thermostables.