PRÉLÈVEMENT ASEPTIQUE DES TISSUS

Le prélèvement aseptique des tissus constitue l'opération la plus délicate de toute la technique; le soin que l’on apporte à la réaliser conditionne, en grande partie, la réussite de la culture. Il n'existe pas de méthode vraiment générale, mais plusieurs procédés adaptés chacun à un matériel donné. Nous décrirons successivement les méthodes que nous avons employées pour les tiges minces de plantes herbacées ou

®) Solution de Berrmezor modifiée :

Eau. en en de ee RE NE Re man etienne en SN EN EE EE 1.000 cm°

Sulfate ferrique (SO®)°Fe, OHAO ER RE et DCE 50 gr.

Sulfate de Manpanèse/ SO Mn;,7H 0 eee ne ten mine name ce De 2 gr.

Todure:de Potassium Re". rte Food es COUT cd Moon 0 co 0,5 gr. Chlorure-deiNickel CENT GRO RE EE 0,05 gr.

Chlorure:de:Cobalt(C2Co, CHOSE RE RE 0,05 gr. Sulfate de Titane 510°, SO', 5H°0.:..:. M Ne PR ES NÉE 0,20 gr. Sulfate:de Zinc SO!Zn, 71H70. RE Re En te 0,10 gr. Sulate de Quivre 5010, BHO RTS TEE 0,05 gr Sulfate de Giucmium SO°Be, AH?0:7 7 20e ee EE UE ER 0,10 gr Acide Borique BOSS ne ebln EE CURE DRE RTE ie 0,05 gr.

Acide:sulfurique d16 6 %B6%. cs cast res eme CUS NE TR ER TU TS DRE 1 cm°

ligneuses, pour le tissu cambial des arbres, pour les racines minces et enfin pour les tissus de Crown-Gall.

a. Tiges aériennes de faible diamètre. — L'isolement aseptique de fragments de tiges aériennes est facilement réalisable : en effet, la surface de ces organes est peu riche en microorganismes, si bien que l’on peut éviter les stérilisations profondes utilisées pour les organes souterrains par Gaurerer, et qui sont inapplhicables dans le cas présent, en raison de la position superficielle de la zone génératrice. Nous opérons donc de la manière suivante : les tiges soigneusement débarrassées de leurs feuilles, vrilles, stipules etc... sont découpées en fragments de 30 centimètres de long, que l’on plonge rapidement dans de l'alcool à 96°. Ce trempage permet d'éliminer l’enduit cireux qui recouvre fréquemment les organes aériens et assure donc un mouillage complet de leur surface sans interposition de bulles d’air. Les fragments sont retirés de l'alcool après quelques secondes et plongés sans lavage préalable dans une solution d’hypochlorite de calcium à 70 grammes par litre U). Les organes restent pendant une demi-heure au contact de cette solution. La cuticule qui recouvre la tige est suffisamment imperméable pour que les tissus internes ne soient pas tués par ce traitement, alors que s ’ils avaient été épluchés, ils auraient été en grande partie détruits par l’hypochlorite ; après une demiheure, les tiges sont retirées de la solution, essuyées avec du papier filtre stérile, puis rincées à deux reprises avec de l’eau stérile.

Après ce lavage, on épluche les organes ; pour cela, on les retire de l’éprouvette dans laquelle ils baignent dans l’eau, on les trempe dans l'alcool et on les place rapidement entre deux feuilles de papier stérile. On élimine ensuite l’épiderme en raclant très légèrement avec un scalpel tranchant. On effectue cette opération en maintenant la tige sous une feuille de papier stérile. L’organe ainsi épluché est de nouveau trempé pendant quelques instants dans de l'alcool à 95° pour en parfaire l’aseptie; puis, après rinçage à l’eau stérile, on le découpe en petits tronçons de 1,5 à 2 centimètres de long. Les fragments ainsi obtenus ne sont pas symétriques. [ls possèdent deux extrémités qui n’ont pas les mêmes propriétés. En général, seule l'extrémité radicale de l’explantat, c’est-à-dire celle qui est normalement tournée vers la racine est capable de se développer. Or, comme le contact du milieu inhibe souvent la croissance, cette partie doit se trouver à l'air libre. Il convient donc au cours des opérations de stérilisation de repérer soigneusement l'orientation des tiges de façon à pouvoir après découpage, planter verticalement le fragment dans la gélose dans une position inverse de celle qu’il occupe dans la plante, de façon que son extrémité radicale tournée vers le haut ne soit pas en contact avec le substratum.

Les tubes de culture bouchés avec un tampon de coton sont ensuite obturés presque kermétiquement, au moyen de petits carrés de papier d’étain de 7 centimètres de côté stérilisés à l’autoclave. Ce capuchonnage a pour but de maintenir l’atmosphère du tube saturée de vapeur d’eau et d’éviter la concentration du milieu par évaporation. Cette méthode permet dans les cas les plus favorables d’obtenir jusqu’à 90 p. 100 de cultures aseptiques.

b. Tissu cambial d'arbres. — Au cours de ses premières recherches sur la culture du tissu cambial d’arbres, Gauraenær effectuait ses prélèvements directement sur le terrain. Cette technique présente certains inconvénients matériels dont le principal est de néces-

@) Pour préparer cette solution, on ajoute 70 grammes d’hypochlorite de calcium titrant 200° chlorométriques dans 1 litre d’eau, on agite continuellement pendant 10 minutes, et l’on filtre enfin sur papier très épais.

s ter le transport en pleine forêt, souvent à une grande distance des objets aseptiques nécessaires à la réalisation des cultures. De plus, lorsque l’on travaille en plein air, les contaminations accidentelles par les germes de microorganismes qui flottent dans l'air sont beaucoup plus fréquentes que dans une salle spécialement aménagée ; aussi, avonsnous adopté la méthode suivante, permettant d'opérer au laboratoire. On fait débiter un tronc d'arbre ou de grosses branches en bûches de 1 mètre de long, qui peuvent rester vivantes très longtemps, et même se développer pour produire des pousses feuillées ; ces branches sont ensuite transportées au laboratoire, où a lieu le prélèvement, La bûche est entièrement lavée à l'alcool avant d’être introduite dans la pièce réservée au travail aseptique. Dans cette salle, l’opérateur, à l'aide d’un couteau à deux manches semblable à une plane de menuisier, enlève sur une large surface, à l'endroit où il désire effectuer les prélèvements, la partie subérifiée et brune de l’écorce. Après un nouveau lavage à l'alcool, il élimine la partie la plus superficielle du liber, puis découpe avec la pointe d’un scalpel le tissu cambial toujours adhérent au bois en fragments rectangulaires de 1 em. X 2 em.; au moyen de pinces fines, il saisit alors ces fragments par un angle et les sépare du bois auquel ils n’adhèrent que faiblement; pour terminer, ces fragments sont ensemencés comme précédemment en les plantant dans des milieux gélosés. Le tissu cambial des espèces que nous avons étudiées ne présente pas de polarité très nette, si bien que nous n’avons pas tenu compte de l'orientation des fragments au moment de leur mise en culture.

Cette méthode de prélèvement assure une moins bonne asepsie que la précédente et le nombre de cultures stériles ne dépasse jamais 60 à 70 p. 100.

c. Racines de fable diamètre. — Le prélèverhent aseptique des tissus d’une racine est plus délicat à réaliser que celui d’un fragment de tige ;les microorganismes qui pullulent dans le sol sont en effet beaucoup plus nombreux que ceux qui vivent à l'air libre; de plus, au cours de la croissance de la racine, il se forme constamment des radicelles dont la plupart meurent en peu de temps; ces radicelles se décomposent après leur mort et permettent aux microorganismes de s’introduire dans la profondeur des tissus. Pour réaliser des prélèvements sur ces organes, nous opérons de la façon suivante : on les épluche très légèrement afin d'éliminer les parties superficielles plus ou moins imperméables, et on les plonge pendant dix minutes dans une solution d’hypochlorite de calcium à 70 grammes par litre. On leur fait subir alors un second épluchage également très superficiel, de manière à éliminer les tissus tués par l’hypochlorite, ainsi que la majeure partie des bactéries et des champignons. On les plonge ensuite une seconde fois dans l’hypochlorite pendant dix minutes également, afin de détruire les germes qui auraient pu échapper au premier traitement, ; un troisième épluchage enlève les cellules tuées par ce second trempage; on rince ensuite l'organe à l’eau stérile et on découpe les racines en tronçons de 1,5 à 2 centimètres qui sont finalement enseméncées comme des fragments de tige. L'expérience nous a montré que les résultats obtenus par deux traitements successifs à l’hypochlorite sont, en ce cas, bien supérieurs à ceux que l’on obtient en faisant agir le désinfectant en une seule fois. On peut réaliser ainsi l’asepsie d'organes très minces sans en éliminer une épaisseur de plus de 1 millimètre.

L'efficacité de cette méthode varie évidemment avec la nature des organes traités, elle est généralement moins sûre que les précédentes et permet rarement d'obtenir plus

de 50 p. 100 de cultures aseptiques.

d. Tissus de Crown-Gall. — Les tissus de Crown-Gall renferment des cellules de Plhyto-

monas tumefaciens qu'il convient d'éliminer au cours du prélèvement. Celles-ci sont heureusement peu nombreuses et ordinairement localisées à la périphérie de la tumeur ce qui rend possible le prélèvement aseptique des tissus internes. I faut pour cela attendre que le Crown-Gall soit assez volumineux, mais en grossissant, la tumeur, au lieu de demeurer homogène, se fissure profondément et divers microorganismes peuvent alors pénétrer par ces fissures. En pratique, c’est environ deux mois après l’inoculation de la bactérie qu’il convient d’effectuer le prélèvement. Étant donné que ces tumeurs sont généralement peu volumineuses, on doit leur faire subir un traitement analogue à celui utilisé dans le cas des racines de faible diamètre, c’est-à-dire qu'après les avoir épluchées légèrement, on les trempe pendant dix minutes environ dans la solution d'hypochlorite à 70 grammes par litre, puis on les épluche une seconde fois, et l'on fait agir à nouveau le désinfectant pendant dix minutes avant de procéder à l’épluchage définitif. En ce cas, la proportion de cultures aseptiques varie beaucoup avec l'espèce. Les tumeurs de certaines plantes comme la Vigne paraîssent ne renfermer que très peu de cellules bactériennes, d’autres au contraire, comme celles de Datura, en contiennent beaucoup. Si bien que dans certains cas (Vigne) presque toutes les cultures sont aseptiques, alors que dans d’autres au contraire (Datura) presque toutes sont contaminées par le Phytomonas.

IIT. Reprquaces.

Les fragments d’organes mis en culture sont très hétérogènes, aussi leurs différents tissus se développent-ils très inégalement. Certains, par exemple le bois, ne prolifèrent pas, d’autres au contraire, comme le tissu cambial, s’accroîssent d’une manière très active; cette croissance est fréquemment polarisée, et dans ce cas, seule l’extrémité radicale du fragment produit un cal important. D’autres fois, les proliférations ne sont abondantes qu’à l’intérieur du milieu comme si ce dernier activait le développement des tissus par son contact direct. Dans certains cas enfin, de nouveaux organes, tiges ou racines, apparaissent sur les néoformations. L'observation d’un fragment de tige ou de tissu cambial montre que la croissance s’installe plus ou moins vite. Au bout de quelques jours, le fragment se modifie. Il augmente de volume et produit des mammelons parenchymateux qui deviennent rapidement volumineux, continuent à s’accroître pendant quelques mois, puis cessent de se développer et les tissus meurent ensuite. Si l'on veut maintenir l’activité de la culture, il faut, avant que la croissance ne se relentisse, isoler un fragment de tissu dans la partie qui est en voie de prolifération intense, et le transporter sur un milieu neuf où il puisse continuer à se développer. Geci constitue l'opération du repiquage.

Les cultures repiquées ne tardent pas à se modifier; chez certaines espèces, la prolifération est généralisée et tout l’explantat se transforme, augmente de volume, prend une forme globuleuse ; chez d’autres, au contraire, la croissance est limitée à certaines régions privilégiées sur lesquelles apparaissent en des points limités de petits massifs de parenchyme, en voie de croissance active. Ces massifs se développent rapidement, certains se soudent entre eux et l’explantat primitif se recouvre ainsi, sur un ou plusieurs côtés, de tissus néoformés, alors que le reste se modifie à peine.

Parfois, les néoformations possèdent d’emblée un aspect différent des tissus normaux; dans d’autres cas les tissus se transforment très lentement, leur surface qui était lisse devient de plus en plus mamelonnée, ils élaborent moins de chlorophylle. Certaines espèces perdent à la longue la faculté d'émettre des racines. Après le premier repiquage, les tissus ne sont pas encore accoutumés à la vie in vitro, la croissance est souvent irrégu-

lière. Ils demeurent très fragiles. Certaines cultures se développent activement, d’autres, au contraire, très faiblement, et meurent au bout de quelques temps. Puis, peu à peu, les tissus se modifient sous l'effet de la culture ; ils deviennent moins délicats et s’accoutument à la vie in vitro. Leur rèpiquage devient alors beaucoup plus aisé. Geci explique que le repiquage primitif, qui a pour but d'isoler les tissus néoformés, encore très délicats, des tissus préexistants, soit très différent du repiquage d’une souche; il constitue en quelque sorte un prélèvement secondaire. Aussi, nous décrirons séparément le repiquage des cultures primitives et des souches anciennes.

a. Repiquage de la culture primitive. — Étant donnée la fragilité des tissus néoformés,

Fic. 1. — Repiquage des cals formés par des fragments de tige :

À. Cal formé à l'air libre ; on le détache d’un trait de scalpel suivant la ligne AB. B. Cal formé à l’intérieur du milieu ; on le détache par deux traits de scalpel parallèles À et A’.

il faut apporter de grands soins à cette opération. On doit commencer par examiner soigneusement toutes les cultures, afin d'éliminer celles qui sont infectées, mal développées, ou en voie de nécrose. On enlève alors la capsule d’étain qui obture le tube de culture, on lave ce dernier à l'alcool, puis avec une pince on retire l'explantat du tube et on le transporte dans une boîte de Petri stérile où on peut l’examiner à loisir et le découper à l'abri des germes de microorganismes qui flottent dans l'air. Le découpage des tissus s'opère différemment selon que la prolifération a eu lieu à l'air libre ou à l'intérieur du milieu.

Dans le premier cas (fig. 1 A) nous repiquons ces cultures de la manière suivante : nous commençons par éliminer les organes tiges ou feuilles qui se sont éventuellement formés sur le cal, puis nous détachons ce dernier d’un trait de scalpel passant au niveau du raccord des tissus néoformés et des tissus préexistants. Si ce cal n’est pas trop

volumineux (moins de 0,5 em. de diamètre) nous le transportons.en entier sur un milieu neuf en appliquant la partie blessée par la lame du scalpel contre la surface de la gélose; s’il est plus gros, nous le découpons en deux ou quatre fragments que nous repiquons séparément.

Dans le second cas, c’est-à-dire lorsque le cal se forme au contact du milieu de culture, nous opérons de la manière suivante : nous séparons des tissus préexistants la majeure partie des néoformations par deux traits de scalpel parallèles qui suivent les contours primitifs de la tige (fig. 1 B). Les deux fragments ainsi détachés sont ensuite transformés en cubes grossiers avant d’être placés dans un tube de milieu neuf. Nous avons remarqué qu'il y a intérêt au cours de cette première opération, à ne pas repiquer de fragments trop petits. Il faut en effet que les explantats ne mesurent pas moins de 5 millimètres de côté et que leur poids ne soit pas inférieur à 100 milligrammes. Dans les deux cas, les tubes ayant été ensemencés sont obturés d’une manière presque hermétique avec du papier d’étain stérile.

b. Repiquage d'une souche. — Les cultures provenant de souches anciennes forment généralement des masses homogènes qui s’accroissent d’une manière diffuse, leur repiquage est alors très simple : comme précédemment après avoir retiré la capsule d’étain qui obture le tube, on lave ce dernier à l'alcool. on extrait rapidement la colonie pour la placer dans une boîte de Pétri stérile, on la découpe alors en fragments réguliers de 0,5 em. de côté que l'on porte rapidement sur un nouveau milieu, en prenant soin de les enfoncer très peu dans la gélose. |

Il arrive parfois que le développement soit irrégulier et confiné en certaines régions de l'explantat, tandis que d’autres parties se nécrosent ou forment des amas de cellules géantes sans consistance. En outre, certains tissus produisent des organes tiges ou racines. I faut au cours du repiquage éliminer ces organes, ainsi que les parties molles et nécrosées incapables de proliférer, pour ne garder que les tissus sains et fermes. Après cette opération, les tubes sont ensuite obturés de manière presque hermétique à l’aide d’une feuille de papier d’étain stérilisée.