IV. TECHNIQUES ANATOMIQUES

Pour analyser la prolifération des cultures nous avons eu recours à des examens anatomiques. Nous croyons utile de décrire sommairement les techniques utilisées pour la réalisation des préparations destinées à ces examens. Cette réalisation comprenait les opérations suivantes : fixation des tissus, inclusion dans la parafline, confection de coupes et enfin coloration.

a. Fixation. — Nous avons toujours utilisé comme fixateur le Picroformol de Bouin préparé au moment de l’emploi; ce fixateur a la composition suivante :

Solution aqueuse saturée d’acide picrique.............. 30 volumes. BOOADDE DUO SR Rien 10, — Acide acétique cristallisable.............. M RATS VD —

Ce fixateur est très pénétrant, et d’un usage commode pour les objets volumineux comme les cultures de tissus; on peut les y laisser longtemps, sans qu’ils s’altèrent. En pratique, la durée de fixation que nous avons adoptée est de deux jours. Il n’est pas nécessaire de laver à l’eau après fixation. Il suffit de transporter les pièces dans l'alcool

à 90° qu’on change plusieurs fois. Nous avons fixé de cette façon soit des colonies entières, soit simplement les néoformations apparues sur les fragments. Après inclusion dans la paraffine, les objets étaient coupés en série au microtome Minot. Nos coupes avaient le plus souvent 12 y d'épaisseur, les objets hétérogènes renfermant des parties dures et ayant tendance à se déchirer étaient coupés à 20 y. Dans certains cas, cependant, notamment pour l'étude de la prolifération de tiges très lignifiées comme celles de Vigne ou d’Aubépine, nous avons dû renoncer à ce procédé, car toutes les coupes se déchiraient, ou la partie ligneuse s’émiettait; nous avons alors fait des coupes plus épaisses à main levée. |

b. Coloration. — Les coupes collées et déparaffinées étaient ensuite traitées par la méthode de double coloration au bleu de méthylène et rouge de ruthénium. Pour cela, on colorait chaque préparation pendant cinq minutes par du bleu de méthylène aluné (bleu de méthylène 1, alun de potassium 10, eau 100); on lavait à l’eau et on colorait à nouveau pendant cinq minutes avec une solution de rouge de ruthénium, préparée au moment de l'emploi en ajoutant une trace de ce produit à quelques centimètres cubes d’eau ammoniacale, dans un verre de montre, de façon à obtenir une coloration rouge foncé. Les préparations étaient ensuite montées au baume de Canada.

Par cette méthode les cellules à parois cellulosiques se colorent en rouge, les vaisseaux et les éléments lignifiés en bleu violacé. D’autres constituants cellulaires sont également colorés comme les mucilages qui prennent une teinte rouge intense, et les tannins qui deviennent violet foncé.