CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES ET CONCLUSIONS

Le but principal de notre travail a été d’obtenir la culture associée de tissus végétaux et de parasites obligatoires, incapables de se développer en dehors de leur hôte normal. Ces recherches nous ont amené à réaliser des cultures de tissus d’espèces très diverses qui, pour la plupart, n’avaient fait l’objet d'aucune tentative. Nous examinerons successivement les considérations générales suscitées par les principaux résultats que nous avons acquis sur cette question, puis celles relatives à nos essais de culture de divers agents pathogènes.

A. ConsIDÉRATIONS GÉNÉRALES SUR LA CULTURE DES TISSUS. — Au moment où nous avons commencé nos recherches, on ne savait cultiver qu’un petit nombre de tissus normaux provenant tous d'organes tubérisés tels que les racines de Carotte, de Chou-Navet, d’Endive, de Scorsonère, ou le rhizome de Topinambour. Le développement normal de ces organes révèle une prolifération cellulaire exceptionnellement intense. Les variétés cultivées qui les produisent ont été sélectionnées par l’homme dans un but alimentaire depuis la plus haute antiquité et constituent en quelque sorte des anomalies puisque les formes sauvages dont elles dérivent, par exemple : la Carotte ou la Chicorée sauvages, ne forment pas de tels organes. Il y a une relation évidente entre cette faculté de tubérisation et l’aptitude de leurs tissus à proliférer #n vitro, si bien que l’on pouvait se demander si les tissus d’autres espèces herbacées seraient susceptibles de fournir eux aussi des cultures durables. Nos recherches ont établi qu'il en est bien ainsi. Nous avons pu, en eflet, réaliser la culture des tissus de diverses plantes herbacées, non tubéreuses comme le Muflier, la Mauve, le Tabac, mais cependant avec la plus grande difficulté.

Les végétaux ligneux à tige pérennante et les arbres en particulier manifestent également une grande activité cambiale qui se traduit principalement par la formation d’un tronc épais. Les premières tentatives de Gauraerer ont porté sur la culture du tissu cambial de différents arbres, mais à l’époque à laquelle cet auteur réalisa ses premiers travaux, la technique n’était pas suffisamment avancée et c’est pourquoi il ne put obtenir de cultures indéfinies. Nos recherches ont établi que cette culture est possible et même relativement aisée. Ainsi, dans ce cas également, il semble bien y avoir une relation entre l’activité cambiale d’une espèce et son aptitude à proliférer in vitro. Nous avons réalisé en outre un troisième type de cultures de tissus en partant de fragments de lianes diverses, Vigne, Vigne-vierge, Cissus, Ronce. Enfin, nous avons obtenu le développement in vitro de nombreux tissus de Crown-Gall : Vigne, Tabac, Abutilon, Jusquiame, confirmant ainsi les résultats obtenus par Ware et Braun (80-81)surle Soleil, la Pervenche de Madagascar et, plus récemment, par Gavrnerer (25-26) sur le Topinambour et la Scorsonère. k

Nos recherches ont donc établi que la technique des cultures de tissus peut être généralisée à un grand nombre de Dicotylédones et que l’on peut cultiver non seulement des tissus plus ou moins pathologiques, mais aussi des tissus vraiment normaux.

L’observation des cultures d’un très grand nombre d'espèces nous a permis de constater qu'il n'existe pas de relation entre la faculté de proliférer in vitro et la position des espèces dans la classification. C’est ainsi que les tissus de la plupart des Ampélidées prolifèrent vigoureusement in vitro, tandis que ceux de quelques espèces comme : Tetrastigma voimeriana ne se développent pas du tout. De même les Ronces que nous avons étudiées nous ont fourni aisément des cultures durables, alors que nous avons été incapable d’en obtenir avec le Rosier. Il ne paraît pas non plus y avoir de lien entre les caractères morphologiques des néoformations obtenues in vitro et la position systématique des plantes ayant servi à réaliser les cultures. Nous avons en effet observé chez les diverses lianes de la famille des Ampélidées des types de croissance très différents. Les tissus des tiges de la Vigne indigène, Vitis vinifera, possèdent une polarité très marquée qui se traduit par la formation de cals uniquement sur la face radicale des fragments, tandis que celles de Parthenocissus tricuspidata en paraissent dépourvues et prolifèrent en n'importe quelle région des explantats. Une différence analogue s’observe entre les cultures de Ronce et d’Aubépine qui appartiennent toutes deux à la même famille. De même les deux Parthenocissus que nous avons étudiés prolifèrent très différemment. Les fragments de tige de P. quinquefoha produisent une grande quantité de racines, tandis que ceux de P. tricuspidata n’en forment qae rarement. Signalons enfin que’les tissus de Ronce se développent bien à l’intérieur du milieu de culture, alors que le contact de ce dernier inlüibe totalement la croissance de ceux d’autres rosacées comme l’Aubépine. Ainsi, on ne peut déduire des résultats obtenus sur une plante, le mode de développement d’une autre, même très voisine, et encore moins les généraliser à toute une famille.

Nous avons constaté une étroite relation entre la faculté de proliférer in vitro et l’acti-. vité de la plante dont proviennent les tissus mis en culture. Signalons en effet qu’en pratiquant des prélèvements sur des plantes à diverses périodes de leur cycle végétatif, nous avons en général constaté que plus les tissus se développent activement dans la - plante entière et mieux ils prolifèrent in vitro. C’est ainsi que l’on obtient les meilleurs résultats en mettant en culture des fragments de tige de Vigne ou de Vigne-vierge en mai-juin, au moment où la croissance de la plante est la plus active, alors qu'en automne, quand la végétation est arrêtée, ces mêmes fragments d'organes cessent de se développer; de même les tissus de Mauve ne prolifèrent in vitro que s’ils proviennent d’une plante très jeune n’ayant pas encore fleuri. Pourtant, dans certains cas, des tissus âgés sont au contraire capables de s’accroître 1x wiro plus activement que de très jeunes tissus. C’est ainsi que lorsqu'on prélève des fragments de tige de Tabac au moment de la floraison de la plante, on constate qu'ils produisent des cals plus volumineux que les extrémités de très jeunes tiges. Enfin, il semble également exister une relation entre la puissance de développement d’une espèce et l’activité de la croissance de ses tissus in vitro. C’est ainsi que le Parthenocissus tricuspidata, qui est une liane à végétation exubérante, produit des cultures qui s’accroissent en deux mois de plus de 3 grammes, alors que celles de Cissus incisa, plante dont le développement est très réduit, n’augmentent pendant la même période que de quelques centaines de milligrammes.

Nous avons étudié l’action des hétéroauxines sur tous les tissus que nous avons cultivés; cette étude nous a permis de constater, conformément aux résultats de Gaurmerger, que ces substances stimulent leur développement dans la plupart des cas. Ceux de certaines espèces, comme le Parthenocissus tricuspidata, ne prohifèrent pas du tout sans hétéroauxine, mais par contre, en présence de ce produit, on peut réaliser leur culture sans difficulté. D’autres, comme ceux de Vitis vimfera, se développent

pendant un certain temps sans facteur de croissance, mais on ne peut obtenir de cultures durables qu'après avoir fait agir de l’hétéroauxine sur les tissus. Les effets que produit cette substance varient avec la concentration ; si l’on utilise des doses progressivement croissantes, on observe successivement une stimulation de l’activité cambiale et une activation de la division cellulaire pour des concentrations inférieures à 1077, puis à partir de 5.107 chez les espèces capables de produire des racines, une rhizogénèse intense ; enfin, au-dessus de 10-65, on décèle des troubles physiologiques qui se traduisent par l'accroissement isodiamétrique des cellules et la désorganisation des tissus. Ces différentes actions ne se manifestent pas de la même manière sur toutes les plantes, car les différentes espèces sont inégalement sensibles aussi bien aux actions excitoformatrices qu'aux effets toxiques des hétéroauxines, de telle sorte qu’elles ne peuvent manifester cette action stimulante que si elle n’est pas masquée par des troubles physiologiques plus ou moins marqués suivant la sensibilité propre de l'espèce.

Ainsi, chez le Lilas, l'influence excitoformatrice de l’hétéroauxine est nette, car cette plante manifeste une grande activité cambiale et est peu sensible à l’action toxique du produit Chez la Guimauve, au contraire, l'activité cambiale est très faible et les tissus prolifèrent peu, même en présence de fortes doses de substances de croissance. Chez d’autres espèces, comme le Tabac, l’action sur la division cellulaire existe bien, mais elle est masquée par des troubles physiologiques qui se manifestent déjà pour des teneurs relativement faibles en substances de croissance. Enfin, d’autres plantes, comme la Glycine, paraissent absolument insensibles à l’action excitoformatrice des hétéroauxines, tout au moins aux doses que nous avons utilisées. Or, nous avons remarqué que l’on ne parvient à cultiver aisément #n nitro que les tissus des espèces sur lesquelles l’action cambiogène se manifeste nettement comme la Vigne, le Lilas, l’Aubépine; la culture de tissus des autres espèces comme la Guimauve, le Tabac ou la Glycine est très difficile à réaliser ou même impossible.

Malgré leur grande activité, les hétéroauxines ne suffisent pas toujours à obtenir des cultures durables. Dans certains cas, nous avons dû recourir à d’autres facteurs de croissance qui n'avaient jamais encore été employés pour la culture des tissus comme le méso-inositol, la biotine et l’acide d-pantothénique. Certaines de ces substances comme l’acide d-pantothénique stimulent considérablement la prolifération des tissus, mais, faute d'expériences précises, nous ne pouvons affirmer qu’elles soient absolument indispensables à leur croissance.

Nos recherches nous ont, en outre, permis de constater qu’au cours de la culture en présence d’hétéroauxine, les tissus se modifient profondément. Leur aspect extérieur, leur consistance, leur couleur même changent peu à peu; en même temps la croissance qui était irrégulière s’améliore et devient plus homogène. Lorsque nous avons alors comparé de façon précise les réactions des tissus normaux développés sur la plante à celles de ces tissus cultivés un certain temps en présence d’hétéroauxine, nous avons constaté que ceux-ci subissent des transformations importantes. La première de ces transformations est une sensibilisation des tissus à l’hétéroauxine. Elle est caractérisée par le fait que les tissus qui l’ont subie commencent à réagir à des doses de substance de croissance de dix à cent fois plus faibles que celles auxquelles sont sensibles les tissus normanx. En outre, la prolifération des tissus sensibilisés est inhibée par des doses qui, auparavant, provoquaient un développement exubérant. Cette transformation est très rapide. Elle se produit au cours du premier passage et, chez les espèces qui la subissent, elle est très constante. Toutes les colonies cellulaires traitées présentent cette modification que lon peut reproduire à volonté. De plus, elle apparaît avantageuse

pour les tissus qui, après l'avoir subie, prolifèrent plus régulièrement. Gauraerer (21), en étudiant l’action de l’acide indole acétique sur les tissus de Topinambour, a constaté un phénomène de sensibilisation analogue. Mais, dans ce cas, les tissus sensibilisés, au lieu de proliférer plus régulièrement, se développaient très mal et finissaient par mourir.

La seconde transformation que nous avons rencontrée est une perte de sensibilité vis-à-vis de l’action excitoformatrice de l’hétéroauxine. Les tissus qui l’ont subie deviennent en outre capables de se développer très intensément en l’absence de ce facteur de croissance. Contrairement au précédent, ce deuxième type de transformation apparaît sporadiquement après une période de culture indéterminée. On ne peut le reproduire à volonté. Il possède un caractère local et instantané qui évoque une mutation. Cette modification paraît n’affecter tout d’abord qu'une seule cellule ou qu’un très petit groupe de cellules qui se mettent à se multiplier très activement et forment sur la culture un mamelon qui présente généralement un aspect très différent du reste du cal. Alors que les tissus normaux sont le plus souvent fermes, compacts et opaques, les tissus accoutumés deviennent fragiles, mous et translucides, ce qui permet à un observateur averti de les repérer immédiatement.

. Cette seconde transformation est, elle aussi, avantageuse pour les tissus qui la subissent, car ceux-ci se développent alors plus activement et surtout plus régulièrement. | C’est ainsi que ceux de certaines espèces comme la Mauve et le Tabac, ne prolifèrent bien qu'après avoir été accoutumés à l’hétéroauxine.

Les caractères des tissus accoutumés les rapprochent beaucoup de ceux des tissus de Crown-Gall. En effet, Ware et Braun (80-81) ont pu montrer en étudiant des cultures de tissus de Soleil et de Vinca rosea que les tissus tumoraux se distinguent des tissus normaux par toute une série de caractères. Ils forment des colonies friables, translucides, capables de proliférer indéfiniment en l’absence d’hétéroauxine et sont insensibles à l’action excitoformatrice de ces substances. GauraereT a confirmé ces résultats sur le Topinambour. En ce cas, la différence est particulièrement accentuée, car les tissus normaux de cette espèce sont absolument incapables de se développer in vitro sans hétéroauxinc.

Ware et Braun ont, en outre, montré que les tissus tumoraux sont capables de se développer d’une façon exubérante et anarchique non seulement in witro mais également in situ. Si l’on greffe, en effet, sur une tige normale un fragment de tissu tumoral cultivé in vitro, il continue à prohiférer et reforme une tumeur alors que, dans les mêmes conditions, un fragment de tissu normal ne se développe pas. Camus et Gaurerer (9-10) ont constaté, d'autre part, en greffant sur des fragments de racines de Scorzonère des tissus normaux accoutumés et tumoraux, que les greffons constitués par des fragments de colonies de Crown-Gall ou de tissus accoutumés s’accroissent d’une manière exubérante pour donner des sortes de tumeurs, tandis que les fragments de colonies normales ne prolifèrent que d’une manière insignifiante. Ainsi les tissus accoutumés à l’hétéroauxine ont en commun avec les tissus de Crown-Gall toute une série de propriétés tumorales, dont les plus remarquables sont : le pouvoir de proliférer sans frein tn vitro en l’absence de substances de croissance et de former in situ des masses de tissus anarchiques qui échappent au contrôle de l’organisme. Nous avons nous-même pu comparer dans le cas de la Vigne, ces trois catégories de tissus : normal, tumoral et accoutumé. Ces deux derniers, c’est-à-dire le tissu tumoral et le tissu accoutumé, paraissent avoir les mêmes propriétés physiologiques et différent profondément du tissu normal par le fait qu'ils prolifèrent sans frein en l'absence d’hétéroauxine et sont insensibles à son action excitoformatrice ; pourtant, leurs caractères morphologiques et anatomiques

ANNALES DES ÉPIPHYTIES. 4 a

ne paraissent pas tout à fait identiques. Les tissus accoutumés forment des masses plus transparentes, plus fragiles que les tissus tumoraux qui demeurent fermes quoique moins compacts que les tissus normaux. En outre, les tissus accoutumés sont constitués par un parenchyme entièrement homogène qui s'accroît d’une manière diffuse, tandis que l'accroissement des colonies tumorales est bien diflérente. La prolifération intense de ces dernières est due au recloisonnement actif d’une zone méristématique située à la périphérie des cals. Enfin, ces tissus ne sont pas entièrement indiflérenciés, mais produisent parfois quelques lots lignifiés. Ces caractères nous amènent à penser que, dans le cas de la Vigne, le phénomène d’accoutumance est une véritable transformation tumorale ; toutefois, cette transformation n’est pas entièrement identique à celle que provoque le Phytomonas tumefaciens.

Nous avons songé à utiliser la facilité avec laquelle prolifèrent les tissus de Crown- Gall pour obtenir plus facilement des cultures de tissus d’espèces dont les tissus normaux se développent mal ou sont même incapables de s’accroître 2n vitro.

Nous avons ainsi isolé sans difficulté des souches de tissus de Tabac et d’Abutilon qui prolifèrent vigoureusement. Cet artifice peut donc permettre d'obtenir des cultures à partir d'espèces dont les tissus ne prolifèrent pas normalement in vitro. Mais il ne faut pas perdre de vue le fait que les cultures de ce type sont très différentes des tissus normaux.

Nous allons évoquer, pour terminer, les réflexions générales que nous suggère l'étude de la structure anatomique de nos cultures. Les premiers travaux de Gaurmerer (17) ont montré qu'il existe un antagonisme très net entre la croissance et la différenciation. Nos recherches confirment cette assertion. C’est ainsi que dans les cultures de Vigne, les formations très différenciées dérivant des zones génératrices apparaissent dans les régions où la croissance est peu active. De même, les cals qui se forment lentement sans hétéroauxine sont plus différenciés que ceux qui se développent rapidement sous l’action de ce produit.

Nos observations anatomiques ont également révélé que les tissus isolés prolifèrent d’une façon très différente de ceux qui font partie d’une plante entière. Geci n’a rien de surprenant à première vue puisqu’en les isolant on les soustrait aux phénomènes de corrélations auxquels ils sont normalement soumis. Leur structure semble alors échapper à un plan d'organisation et se présente comme particulièrement anarchique. Ils se différencient notamment d’une façon tout autre, soit en formant des zones génératrices aberrantes, des nodules libéro-ligneux plus ou moins irréguliers, ou même des groupes de cellules ligneuses isolées. Remarquons toutefois que, si presque tous les tissus cultivés an vitro se différencient, il existe pourtant divers degrés de différenciation. Certains tissus le sont à peine. Ils forment des masses de parenchyme homogène où l’on rencontre de très rares flots de cellules ligneuses ou quelques nodules cribrovasculaires. Ce sont les tissus de plantes ligneuses qui présentent cette structure; par exemple celles de Lilas, d’Aubépine ou même de Vigne. Rappelons, en effet, que les énormes cals qui se forment sur les tiges de Lilas demeurent entièrement parenchymateux, alors que la plus grande partie de la plante entière est formée de bois. D’autres tissus, au contraire, se différencient notablement au cours de la culture pour former de nombreux nodules cribrovasculaires qui prennent parfois une grande extension. Ce second type de structure correspond aux tissus des plantes herbacées. Dans certains cas, comme chez les Malvacées, les formations libéro-ligneuses apparaissent très tôt et forment à elles seules la plus grande partie des cals. Il est difficile d’expliquer ce phénomène qui, à première vue, peut sembler anormal. Nous pensons qu’il est peut-être causé par l’antagonisme

qui existe entre la croissance et la diflérenciation. Les tissus des plantes herbacées que nous avons étudiées ont, en effet, une activité cambiale très faible et de ce fait prolifèrent lentement, ce qui peut expliquer qu'ils se différencient beaucoup lorsqu'on les cultive in vitro; au contraire, les tissus de plantes ligneuses ont tous une très forte activité cambiale et, comme ils se développent très rapidement in vitro, ils demeurent peu différenciés.

L'étude des cultures nous a également montré que les formations cribro-vasculaires qui apparaissent au cours de la différenciation des tissus cultivés ën vitro peuvent prendre des aspects variés; chez la plupart des espèces que nous avons étudiées, elles se présentent sous la forme de nodules cribro-vasculaires plus ou moins circulaires qui apparaissent dans certains cas (Tabac, Aubépine) aussi bien dans les cals primitifs que dans les tissus repiqués. Ces nodules sont composés d’une partie centrale formée de vaisseaux aberrants généralement disposés sans ordre, entourée d’une zone génératrice circulaire qui donne naissance vers l’extérieur du nodule à des tubes criblés. Nous pou- vons considérer cette disposition comme normale, puisqu'elle rappelle celle qui est réalisée dans les tiges et les racines des Dicotylédones où les massifs vasculaires sont entourés de liber. Les dimensions de ces formations sont limitées dans les cals primitifs, mais elles peuvent prendre une grande extension dans les tissus repiqués de certaines plantes comme le Muflier. Chez d’autres espèces comme la Mauve, les nodules libéroligneux ne se forment que dans les tissus repiqués. La structure du cal primitif produit par un fragment de tige est en effet tout autre. On y rencontre une longue zone génératrice qui, au lieu de se cycliser, se raccorde de chaque côté à la zone génératrice préexistante de la tige et produit des vaisseaux du côté des formations vasculaires préexistantes, c’est-à-dire vers l’intérieur du cal, et du hiber vers l’extérieur. Lorsqu'on repique ces cals primitifs, la zone génératrice est désorganisée par la croissance des tissus; elle se fragmente en différentes parties qui se cyclisent et forment alors des nodules cribrovasculaires typiques. Ce type de structure correspond à celui que Gauruerer a signalé dans le parenchyme vasculaire de Carotte cultivé 1n vitro.

La Vigne nous a enfin montré un troisième type de structure. Les tissus de cette espèce ue forment jamais de nodules cribrovasculaires, même au cours des repiquages successifs. Les zones génératrices ne se cyclisent jamais et sont en outre remarquables par leur orientation inversée ; les vaisseaux se forment constamment sur leur face externe et les tubes criblés sur leur face interne aussi bien dans les cals primitifs que dans les cultures anciennes ayant subi de nombreux repiquages.

Signalons aussi que l'étude des trois types de tissus normaux, tumoraux et accoutumé révèle, en général, des structures anatomiques distinctes.

C’est ainsi que dans le cas de la Vigne nous avons vu que dans les tissus normaux apparaissent constamment de longues zones génératrices inversées ; les cultures de tissus tumoraux de cette espèce sont constitués d’un parenchyme à grandes cellules à la périphérie duquel on rencontre une région formée de plusieurs assises cellulaires en voie de multiplication intense. Ce parenchyme est presque entièrement homogène et ne renferme que quelques rares flots de cellules ligneuses. Enfin les tissus accoutumés sont formés d’un parenchyme entièrement homogène ne se différenciant jamais. C’est d’ailleurs le seul exemple connu de culture de parenchyme à l’état pur. Si on le cultive en présence d'hétéroauxine à faible concentration (5.10), ses cellules présentent une tendance marquée à s’arrondir et à se séparer les unes des autres. Les cultures présentent alors la consistance d’une purée qui s'étale à la surface du milieu. Elles demeurent cependant vivantes et l’on peut repiquer aisément ces tissus en prélevant avec la pointe

d'un scalpel un peu de cette gelée que l’on porte sur un milieu neuf où elle continue à s’accroître. Nous pensons qu’il y a peut-être là une voie nouvelle permettant de réaliser la culture de cellules isolées de plantes supérieures.

Dans le cas du Tabac, les tissus normaux s’accroissent d’une manière diffuse par la multiplication des cellules indifférenciées des parenchymes qui les composent. Ces tissus renferment de très nombreux nodules cribo-vasculaires qui s'étendent très peu. Les tissus tumoraux ont une structure analogue, mais ils sont moins différenciés et les éléments ligneux qu’on y observe n’y sont pas associés à des tubes criblés ; on n’y rencontre donc pas de formations cribo-vasculaires, mais uniquement des vaisseaux aberrants. Les tissus accoutumés ont une structure intermédiaire, ils sont moins différenciés que les tissus normaux, on y rencontre de véritables formations cribro-vasculaires ; mais les éléments criblés y sont plus rares que dans les cultures de tissus normaux.

Dans le cas de la Vigne-vierge et de la Mauve nous n’avons pu comparer que la structure des tissus normaux et accoutumés et nous avons pu constater qu’elles différaient profondément.

Les tissus des colonies normales sont composés d’un parenchyme régulier renfermant des formations cribro-vasculaires. Ce parenchyme prolifère lentement et d’une façon diffuse; au contraire les colonies qui ont subi le phénomène d’accoutumance renferment beaucoup moins de formations cribro-vasculaires et s’accroissent d’une manière très différente; on distingue en effet dans les régions indifférenciées du parenchyme des plages en voie de multiplication active. Ces plages s’accroissent indépendamment les unes des autres et forment des amas de nodules sans cohésion qui se séparent les unes des autres, ce qui donne aux colonies de Vigne-vierge ou de Mauve une consistance friable.

Ainsi il n'existe pas de structure caractéristique de chacune des trois catégories de tissus, normaux, tumoraux et accoutumés. Mais pour chaque espèce chacune de ces trois catégories présente une structure et un mode de croissance spécial.

B. ConsIDÉRATIONS GÉNÉRALES SUR LA CULTURE DES PARASITES OBLIGATOIRES. — 1° Cultures de champignons parasites. — Comme toutes les sciences biologiques, la pathologie végétale est demeurée très longtemps une science d'observation. Les premiers auteurs qui ont étudié les maladies des plantes se sont en effet contentés de décrire les organismes parasites, de les classer et d'enregistrer les lésions qu'ils produisent. À ce stade purement descriptif a succédé une étude plus approfondie faisant appel à des méthodes expérimentales. On a alors tenté de connaître le mode de reproduction des champignons parasites, leur cycle végétatif; plus tard encore les phyto pathologistes ont étudié les conditions de propagation des maladies et cherché à les enrayer par des moyens très empiriques. Puis, tout récemment, ils ont enfin essayé d'étudier les relations physiologiques qui s’établissent entre le parasite et l’hôte. Ces relations sont plus ou moins étroites (Certains comme les Botrytis ou les Fusarium ne sont pas nécessairement parasites. On les rencontre non seulement sur des plantes vivautes qu'ils tuent en secrétant des substances toxiques, mais encore sur n'importe quels débris végétaux où ils vivent en saprophytes. D’autres, plus spécialisés, comme le Mildiou de la Pomme de terre, les Tavelures des arbres fruitiers, les Ustilaginales, ne se rencontrent que sur des espèces bien déterminées, et non sur des débris désorganisés, mais sont néanmoins capables de se développer à partir de substances inertes convenablement choisies, si bien qu’on peut les cultiver in vitro sur des milieux analogues à ceux que l’on emploie pour les espèces purement saprophytes.

En ce cas, si l’on examine de près la nature de ces relations, on remarque que le développement d’un parasite sur une plante exige que celle-ci le tolère et qu’elle lui fournisse en outre les éléments nécessaires à la croissance,

Ainsi, la Tavelure du Poirier n’attaque que le Poirier. Elle est incapable de se développer sur des genres très voisins comme le Pommier ou le Cerisier, parce que ces plantes se défendent par un mécanisme humoral. Néanmoins, ces espèces possèdent toutes les substances nutritives nécessaires au développement de ce champignon, car il suffit de l’ensemencer sur un jus de pommes ou de cerises pour le voir croître vigoureusement.

Enfin ces relations peuvent devenir, quelquefois, tellement étroites, que non seulement le parasite n’attaque que des végétaux appartenant à une seule espèce ou à un seul genre, mais qu'il lüi est même impossible de se développer en dehors des tissus vivants de ces plantes. Il peut paraître singulier que le parasite ne puisse trouver dans les cellules mortes les éléments nutritifs qu’il puise normalement dans les cellules vivantes ; pour expliquer ce phénomène on peut envisager plusieurs hypothèses. L’arrêt de croissance du parasite au moment de la mort de la plante hôte peut être due à une modification de la constitution chimique des cellules au moment de leur mort, modification qui provoquerait la formation de substances toxiques pour le champignon. Cet arrêt de croissance serait alors dû à un phénomène d’inhibition comparable à celui qui cause la mort d’un tissu \égétal lorsqu'on le met en présence d'un extrait de plante quelconque ou même en certains cas d’une substance proteïque comme la peptone. Si cette hypothèse est exacte, on ne peut espérer réaliser sa culture sur des milieux naturels, mais uniquement sur des milieux synthétiques. Mais il est plus vraisemblable d'attribuer cet arrêt de développement à un trouble de nutrition. La prolifération du mycélium peut nécessiter des substances de croissance contenues dans les tissus vivants, mais se détruisant rapidement après leur mort. Par exemple des produits intermédiaires du métabolisme cellulaire qui disparaissent quand celui-ci cesse. En ce cas, sa culture deviendra possible quand nos connaissances de la biochimie de la cellule permettront l'isolement de ces substances. Enfin le parasite peut avoir besoin comme support du milieu colloïdal spécial qu'il trouve dans le protoplasme, et, en ce cas, 1l n’y aurait que peu d'espoir de pouvoir le cultiver en dehors des tissus vivants.

La spécificité des Urédinées hétéroïques pose un problème spécial. Pour expliquer que la même espèce ne puisse se développer que sur deux hôtes souvent très différents comme un Gymnosperme et une Dicotylédone, ou une Monocotylédone et une Dicotylédone, il faut admettre soit que les deux phases du cycle végétatif ont un métabolisme très différent, soit que les deux hôtes possèdent un caractère commun qui nous échappe. Ce caractère peut être, soit une déficience du mécanisme de défense humorale commun à deux plantes, soit la réalisation d’un mode de nutrition propre au champignon chez ces deux espèces.

Après avoir ainsi évoqué quelques idées générales relatives aux possibilités de cultiver des champignons strictement adaptés à la vie parasitaire, nous allons rappeler les résultats de nos essais de culture. La technique des cultures associées de tissus et de champignons parasites nous a permis d’obtenir la culture in vitro de deux espèces, le Mildiou et l’Oïdium de la Vigne. Ce résultat a été pénible à obtenir. Les difficultés que nous avons rencontrées provenaient tout d’abord de l'obtention aseptique des spores du parasite et ensuite de l’infection des cultures par ces spores. Il est en effet relativement facile d'isoler une espèce saprophyte, car le mycélium se développant avec vigueur sur

dés milieux artificiels peut servir de point de départ à des cultures. HE suffit souvent de le prélever aseptiquement dans les parties profondes des tissus ; lorsque cela est impossible, on a toujours la ressource d’ensemencer des spores et, si l’on n’obtient pas immédiatement des cultures pures, on peut, par des repiquages successifs, éliminer les impuretés qui contaminent le milieu. [l n’en est pas de même avec des tissus cultivés on vitro. La moindre spore de champignon saprophyte, la moindre bactérie se développe sur la gélose et les tissus ne tardent pas à être tués. Il devient impossible de les éliminer, d’où la nécessité absolue de partir d’un matériel non contaminé. Gette difficulté n’est cependant pas la principale, car nous avons montré dans chaque cas particulier que l’on pouvait, par divers artifices, prélever aseptiquement des spores ; toutefois, il n’existe aucune méthode vraiment générale.

L’infection des tissus est plus délicate à réaliser. Il semble que le Mildiou et l’Oïdium de la Vigne pénètrent plus difficilement à l’intérieur des tissus peu différenciés comme ceux que l’on obtient en culture que sur des organes comme les feuilles ou les tiges.

Ces difficultés sont plus grandes encore avec les Urédinées et expliquent les échecs que nous avons rencontrés. Ils ne sont pas dus, croyons-nous, à une impossibilité pour le champignon de se développer à l'intérieur des tissus cultivés in vitro, mais plutôt à un mauvais mode opératoire. Dans tous les cas, les échecs provenaient de notre ignorance du mode d’inoculation naturel. Ils ne sont d’ailleurs pas définitifs, car les circonstances de nos échecs nous'ont, au contraire, suggéré des moyens de parvenir à de meilleurs résultats. Nous pensons qu’une solution relativement facile de la culture des Urédinées consisterait à faire des cultures à partir d'organes déjà contaminés, porteurs d’une infection à l’état latent. Cette méthode n’est évidemment pas applicable dans tous les cas, car le thalle de beaucoup d’espèces est très petit et n'apparaît souvent que dans des régions spécialisées dont les tissus ne peuvent être cultivés, comme c’est le cas pour les feuilles. Parfois, cependant, l'infection peut se généraliser à toute la plante et dans ce cas la culture de tissus permettrait sans doute d’obtenir 2n wtro le développement d'Urédinales, de suivre la formation de leurs appareils reproducteurs si variés et d’en étudier le déterminisme.

2° Cultures des Virus. — Le problème posé par la culture des virus est très différent de celui que nous venons d'évoquer à propos de la culture des champignons parasites obligatoires : si l’on peut en effet malgré tout espérer réaliser la culture de ces derniers sur des milieux inertes, il n’en est pas de même pour les agents pathogèves. Il est évidemment impossible de concevoir leur multiplication en dehors de la cellule vivante puisqu'ils ne sont pas à proprement parler des êtres vivants, mais plutôt des substances dérivant d’une déviation du métabolisme. On peut tout au plus espérer en réaliser la synthèse si toutefois on en découvre qui possèdent une structure plus simple que ceux que l’on connaît actuellement. Nous avons montré que la technique des cultures de tissus permet de cultiver au laboratoire certains virus et indiqué les avantages matériels de ces cultures. Nous ne considérons pas cependant la réalisation de ces cultures comme le but définitif de nos recherches. Nous y voyons plutôt un moyen d'investigation nouveau pour étudier ces agents pathogènes. Sur aucune de nos cultures nous n'avons observé les symptômes caractéristiques de la maladie et, dans chaque cas nous étions obligé de recourir à des inoculations pour contrôler la présence du virus. La croissance des colonies ne paraissait pas non plus être affectée par le parasite. Ceci semble dû au fait que les virus que nous avons étudiés ne causent au Tabac que des lésions bénignes. Nous pensons qu'il y aurait lieu d'étudier sur d’autres plantes

l’action de virus provoquant des troubles plus graves, tels que des nécroses locales ou un ralentissement prononcé de la croissance.

Enfin, les cultures de tissus qui sont toujours réalisées en milieu entièrement synthétique constituent un matériel de choix pour l’étude de la formation de ces protéines si spéciales. Il doit être possible d’en étudier la synthèse in nitro en fonction de la nutrition des tissus et d'envisager également l’action de substances bien définies telles que celles qui constituent leur molécule sur leur synthèse.

La culture du virus de la Mosaïque du Tabac nous a montré une diminution considérable de la multiplication de cet agent pathogène dans les tissus tumoraux et accoutumés. Pour expliquer que les tissus de Crown-Gall ou ceux qui ont subi le phénomène d’accoutumance renferment de trente à quarante fois moins de virus que les tissus de la plante entière, nous avons tout d’abord imaginé que l’auxine normalement contenue dans les tissus pouvait troubler la synthèse du virus. On a reconnu en effet que les tissus tumoraux et accoutumés synthétisent davantage d’auxine que les tissus normaux. Mais, cette hypothèse nous paraît cependant fragile, car les recherches d’Avery ont montré que les feuilles de Tabac sain contiennent des quantités importantes d’auxine.

On peut également admettre que cette faible teneur des tissus tumoraux et accoutumés en virus est provoquée par la rapidité avec laquelle ceux-ci prolifèrent. Dans les tissus cultivés in witro, comme dans la plante entière, il y a en effet un antagonisme entre la prolifération des cellules et leur pouvoir d'élaboration. Les tissus méristématiques en voie de multiplication active produisent peu de métabolites ou de produits d’excrétion. Les colonies tissulaires qui s’accroissent activement élaborent également très peu de ces substances. Si le virus, comme on l’admet souvent, est un produit d'élaboration de la cellule, on conçoit que les tissus tumoraux et accoutumés qui se développent d’une façon exubérante n’en élaborent que très peu. Ces hypothèses sont toutefois provisoires et nécessitent, pour être vérifiées ou infirmées, de nouvelles recherches expérimentales, que nous nous proposons d'entreprendre sans tarder.

C. Conczusrons.— Arrivé au terme de cet exposé, il nous paraît utile de mettre en relief les principaux résultats que nous avons obtenus au cours de notre travail. Ceux-e1 peuvent se résumer de la manière suivante :

1° Des fragments de tiges de diverses Lianes de la famille des Ampélidées (Vins, Parthenocissus, Cissus) et des Rosacées (Rubus) ensemencés dans des milieux synthétiques composés d’une solution minérale glucosée solidifiée par de la gélose et renfermant en outre diverses substances de croissance (cystéine, aneurine et hétéroauxine) proliféraient activement pour former des cals volumineux ; toutefois, les tissus d’autres lianes (Wisteria, Clematis, Hedera), ne se développent pas dans ces conditions.

La croissance in vitro de fragments de tiges de la plupart de ces lianes ( Vitis) présente une polarité très nette se manifestant par le fait que, seule, l'extrémité radicale des explantats se développe ; les tissus d’autres espèces (Parthenocissus) paraissent dépourvus de cette propriété. La structure anatomique des néoformations est très variée ; dans certains cas (Rubus) le cal demeure indifférencié; dans d’autres cas (Cissus) il renferme des nodules cribrovasculaires. Enfin, à la périphérie des néoformations produites par les tiges de Vitis apparaissent de longues zones génératrices qui ont une orientation inversée et produisent des vaisseaux vers l'extérieur et du liber vers l'inté-

rieur du cal.

9° Des fragments de tissu cambial ou des tronçons de tiges de divers arbres : Cra-

taegus, Pyrus, Syringa, se développent dans les mêmes conditions en produisant des formations analogues à celles que nous avons observées sur des tiges de Lianes. Les üges de ces espèces présentant une polarité très nette et les néoformations obtenues in vitro sont très peu différenciées.

3° Des fragments de tiges aériennes de diverses plantes herbacées, Antirrhinum, Malva, Althea, Nicotiana, ensemencés sur le même milieu, prolifèrent également très vigoureusement. Les tiges de toutes ces plantes possèdent aussi une polarité très accentuée. Mais le parenchyme des cals qu’elles produisent se différencie très tôt; on y observe soit de longues zones génératrices raccordées à la zone génératrice normale de la tige et formant des vaisseaux à l’intérieur du cal du côté du bois préexistant et du liber vers l'extérieur (Malva), soit de nombreux nodules cribro-vasculaires (Nicotiana).

4° Nous avons observé que, lorsqu'on repique les cals obtenus en cultivant in tro des fragments de tiges de ces trois catégories de végétaux : lianes, plantes ligneuses, et plantes herbacées, sur des milieux renfermant de lhétéroauxine, ils continuent à se développer et paraissent capables de proliférer d’une manière indéfinie. Nous avons pu ainsi isoler des souches de cultures de tissus de divers Vitis, Parthenocissus, Rubus, de Crataegus monogyna, Pyrus communis, Syringa vulgaris, Antirrhinum majus, Malva sylvestnis, divers Althea et Nicotiana Tabacum.

5° L'étude de l’action de l’hétéroauxine sur les tissus de Witis vimfera et de Parthenocissus tricuspidata nous a permis de montrer qu’en présence de cette substance à concentration convenable ceux-ci subissaient successivement deux types de transformations : la première est caractérisée par le fait que les cellules deviennent capables de proliférer faiblement mais indéfiniment sans hétéroauxine en même temps qu’elles manifestent une exaltation de leur sensibilité vis-à-vis de cette substance. La seconde transformation consiste dans le fait que les cellules deviennent capables de se multiplier très intensément, même en l'absence d’hétéroauxine, mais perdent leur sensibilité vis-à-vis de l’action excitoformatrice de ce produit; cette seconde transformation est accompagnée de modifications morphologiques et anatomiques très caractéristiques ; elle est analogue au phénomène décrit par Gavraerer sur: les tissus de Carotte et de Scorsonère sous le nom d’accoutumance à l’hétéroauxine. Les tissus de Malva sylvestris et Nicotiana tabacum subissent également cette seconde transformation et leur culture qui était très délicate à réaliser devient alors beaucoup plus facile.

6° Nous avons mis en évidence l’action excitoformatrice de l'acide d-pantothénique de la biotine et de l’inositol sur les tissus de Crataepus monogyna et Pyrus communs.

7° Nous avons réalisé des cultures de tissus de Crown Gall de Vitis vinifera, Nicotiana tabacum et Abutilon avicennae. Nous avons constaté qu'ils prolifèrent vigoureusement in vitro en l'absence d’hétéroauxine et possèdent un certain nombre de caractères qui les rapprochent beaucoup des tissus ayant subi le phénomène d’accoutumance.

8° Nous avons pu inoculer le Plasmopara witicola et l’'Uncinula necator aux tissus de Vigne cultivés in tro et réalisé ainsi pour la première fois la culture de ces parasites.

9° Nous avons cultivé des tissus de Maicotiana tabacum atteints par le Virus de la Mosaïque du Tabac, le virus X et le virus Y de la Pomme de terre. Nous avons également pu inoculer ces virus à des tissus de Tabac sain cultivés in vitro et constaté que les virus se multiplient dans les tissus.

10° Nous avons enfin dosé la quantité de virus contenue dans des cultures de tissus

accoutumés à l’hétéroauxine et dans des tissus de Crown-Gall de MNicotiana Tabacum. Nous avons ainsi constaté que la quantité de virus que contiennent les tissus accoutumés et tumoraux est d'environ 30 à 40 fois plus faible que celle des feuilles de la plante entière.