III. Cucrure ou virus DE LA Mosaïque pu Tapac

1. Culture sur tissu normal. — Pour obtenir des cultures de virus de la Mosaïque du Tabac, nous sommes parti de tiges de tabac de la variété « White Burley» auxquels on avait transmis la maladie et qui en présentaient les symptômes caractéristiques sur le feuillage. Nous avons ensemencé des fragments de ces tiges, suivant notre technique habituelle, sur des milieux contenant de l’acide naphtyle acétique à la concentration de 5.107. Nous avons également ensemencé comparativement des fragments de tige de plantes saines ayant le même âge. Les deux catégories de fragments ne tardèrent pas à se développer et produisirent en deux mois des cals volumineux. Ils furent alors repiqués Sur un milieu contenant de l’hétéroauxine à la dose de 1077 où ils continuèrent à proliférer très lentement. Ces tissus furent repiqués tous les deux mois sur le même milieu, mais leur croissance demeura très médiocre. Les cultures de tissus infectés présentaient le même aspect que celles de tissus sains ; aucun caractère morphologique ou anatomique ne permettait de les distinguer et seule l’inoculation de jeunes plantes à l’aide du jus de tissus broyés permettait de déceler la maladie.

9. Culture sur des tissus accoutumés. — Après quatorze mois de culture, la croissance de trois colonies tissulaires de la souche infectée par le virus s’améliora soudainement. Ces colonies qui jusque-là étaient brunâtres et produisaient de nombreuses cellules

ANNALES Des Érirayries n

géantes, se mirent à proliférer activement pour former des masses de parenchyme blanc et ferme, L'étude des réactions de ces tissus vis-à-vis de l’acide naphtyle acétique nous permit de constater qu'ils se développaient vigoureusement en l'absence de cette substance et avaient perdu toute sensibilité vis-à-vis de ses propriétés excitoformatrices. Ces colonies avaient donc subi le phénomène d’accoutumance à l’hétéroauxine, Nous avons alors cherché si elles étaient toujours infectées par le virus de la Mosaïque du Tabac. Pour cela de jeunes plants de Tabac ont été inoculés avec le jus provenant du broyage de deux cultures et les symptômes de la maladie n’ont pas tardé à se déclarer.

3. Culture des tissus de Crown-Gall. La lenteur de la prolifération des tissus normaux de Tabac et l'irrégularité avec laquelle se produit le phénomène d’accoutumance qui permet d'obtenir une meilleure croissance nous ont incité à tenter la culture du virus de la Mosaïque du Tabac sur des tissus de Crown-Gall qui se développent plus activement. Pour cela nous avons inoculé le Phytomonas tumefaciens à de jeunes tiges de Tabac de la variété « White Burley», auxquel on avait transmis la Mosaïque quelques jours auparavant. Des tumeurs se développèrent rapidement sur les tiges au point d’inoculation de la bactérie. Deux mois plus tard, nous avons prélevé aseptiquement ces tumeurs et nous en avons mis des fragments en culture dans des milieux renfermant ou non de l’hétéroauxine. Nous avons réalisé comparativement des cultures témoins à partir de tumeurs produites par l’action du Phytomonas sur des plantes dépourvues de virus. <

Les tissus tumoraux se sont développés avec une grande rapidité. Deux mois plus tard, ils furent repiqués sans hétéroauxine et leur croissance se poursuivit avec la même régularité. Les cultures de tissus provenant de plantes infectées étaient absolument identiques à celles obtenues à partir de plantes saines ; rien dans leur aspect extérieur ni dans leur structure anatomique ne permettait de déceler les virus. Nous avons cependant pu vérifier sa présence en inoculant le jus provenant du broyage de deux cultures à quelques plantes saines, dont les feuilles montrèrent rapidement les symptômes caractéristiques de la maladie,

A. Inoculation du virus aux cultures. — Au lieu de partir de plantes infectées pour obtenir des cultures de virus, nous avons cherché à inoculer directement des tissus sains cultivés on nitro, et, pour cela, nous avons opéré uniquement sur des cultures de Crown-Gall qui se multiplient très activement. À priori cette Inoculation semblait être possible car le virus de la Mosaïque du Tabac se transmet par de simples procédés mécaniques.

On peut par exemple l’introduire dans les plantes au moyen de blessures minimes telles que : ruptures de poils, déchirures des cellules épidermiques, ete. L'inoculation se produit dans les meilleures conditions lorsque les lésions sont très faibles et se cicatrisent rapidement. Pour cela on utilise généralement un abrasif comme le carborundum dont on saupoudre la feuille à inoculer ; on dépose ensuite quelques gouttes de jus infectieux à la surface de’cette feuille, puis on étale ce jus sur tout le limbe en le frottant très légèrement avec une baguette de verre ; c’est cette méthode qui nous aservi pour transmettre la maladie à des cultures saines. Nous opérons de la manière suivante : une culture saine est placée dans une boîte de Petri et l’on saupoudre la surface avec un peu de carborundum stérilisé à l’autoclave; puis, avec une pipette, on dépose une goutte de Jus infectieux dans la région recouverte par cette poudre, et on étale ensuite très légèrement ce jus avec un agitateur stérile afin de provoquer de très légères déchirures des cellules superficielles. Nous avons cherché à obtenir un jus

infectieux aseptique de deux manières différentes : soit en filtrant un jus brut sur bougie de porcelaine, soit en stérilisant des pétioles de feuilles de Tabac infectées par trempage dans l'alcool et flambage, et en les écrasant dans un tube stérile. Ce deuxième procédé nous a fourni des résultats bien supérieurs au premier. Les particules de virus de la Mosaïque du Tabac ont, en effet tendance à s’agglomérer entre elles assez rapidement, et elles sont alors facilement retenues par la bougie de porcelaine, si bien ‘qu'il arrive parfois que le jus filtré ait perdu toutes ses propriétés infectieuses. Le virus est, par contre, assez résistant à la chaleur et le flambage des tissus ne l’échaufle pas suffisamment pour altérer sa virulence.

Des contaminations de plantes entières réalisées un mois plus tard, à l’aide de jus de cultures nous ont permis de contrôler le résultat de l'opération. Nous avons pu nous rendre compte de cette manière que l’inoculation réussissait dans tous les cas.

5. Étude comparative de la multiplication des virus dans les tissus cultivés in vitro et dans la plante entière. — L’inoculation de jus provenant du broyage des tissus cultivés à de jeunes plants de Tabac, permet de constater que ces tissus renferment toujours le virus ; mais ce renseignement est purement qualitatif et ne permet pas d'apprécier la quantité de virus contenue dans les tissus. Lorsqu’on désire procéder au dosage du virus, on peut recourir par exemple à une réaction sérologique; pour cela, on prépare un immunsérum de Lapin en injectant par voie intraveineuse à l'animal une préparation purifiée du virus de la Mosaïque du Tabac. Nous avons préféré à l’examen des floculations en tubes à hémolyse la méthode de Jermozsev et H. Rusxa (1939). Une goutte de l’immunserum est mélangée sur la lame porte-objet du microscope avec une goutte de jus centrifugé de la culture éprouvée ; l’examen est ensuite réalisé à l’aide d’un microscope à fond noir. Cette microméthode, d’abord utilisée uniquement pour les diagnoses, se prête également au dosage du virus (43). La détermination de la plus grande dilution du jus virulent donnant encore un précipité perceptible (dilution limite) permet en effet de déterminer la teneur en virus de ce ‘ dernier par rapport à un témoin connu.

En nous servant de cette technique 4) nous avons entrepris de comparer la teneur en virus des deux souches de tissus sur lesquelles nous le cultivons (souche accoutumée et souche tumorale) avec la teneur des tissus d’une plante entière; nous avons alors constaté que la teneur en virus d’un jus provenant de cultures de tissus de tumeur était 30 à 40 fois plus faible que celle d’un jus de feuille de Tabac infecté. Dans les tissus accoutumés la quantité de virus était encore moindre, si bien qu’on ne le décelait généralement pas avec le sérum utilisé, mais sa présence a pu être mise en évidence par des inoculations au Micotiana Tabacum et au Nicotiana glutinosa. Ainsi le virus de la Mosaïque du Tabac se multiplie bien moins activement, dans les tissus tumoraux et accoutumés cultivés in vitro que dans la plante entière. Gette particularité est actuellement difficile à expliquer. Toutefois si l’on considère que, dans la plante entière, la teneur en virus des points végétatifs est beaucoup plus faible que celle des tissus différenciés, on peut admettre, à titre de simple hypothèse, que le caractère méristématique des tissus tumoraux et accoutumés leur confère des propriétés comparables à celles des méristèmes primaires.

IV. Cucrure ou virus X De La Pomme pe verre. — Le virus X est très répandu dans les plantations de Pommes de terre. À l’état isolé, il est d'ordinaire relativement peu (1) Celte nouvelle méthode de dosage était en cours de mise au point au moment de notre étude et nous tenons à remercier

Mie Avcrer pe MonrcreutEr qui a obligeamment effectué nos dosages.

dangereux, et ne provoque qu une légère mosaïque; mais, lorsqu'il est associé à d’autres virus, comme le virus À et surtout le virus Ÿ, il produit des lésions plus sévères; on peut l'inoculer, par simple friction, à diverses Solanées, comme le Tabac, le Datura ou la Jusquiame.

1. Culiure sur tissu normal. — Nous avons tenté de cultiver le virus dans des colonies de tissus normaux de Tabac. Pour cela, des tiges de jeunes plantes de Tabac inoculées par l'agent pathogène ont été mises en culture suivant notre technique habituelle, dans des milieux contenant de l'acide naphtyle-acétique à la concentration de 3.10-7; les cals formés par les fragments ont été repiqués tous les deux mois dans des milieux pe nant de l'acide naphtyle-acétique, à la concentration de 10-7: la croissance s’est poursuivie lentement et irrégulièrement pendant dix-huit mois ; à ce moment-là trois cultures ont alors été broyées, et le jus ainsi obtenu a été inoculé à de jeunes plantes de Tabac qui ne tardèrent pas à montrer les symptômes caractéristiques de la maladie lesquels consistent dans l’apparition de cercles décolorés sur les feuilles de la plante, que les auteurs de langue anglaise désignent sous le nom de Ring-Spot.

9. Culture sur tissus de Crown-Gall. — Nos cultures atteintes de virus X de la Pomme de terre n’ont pas présenté de phénomène d’accoutumance, et nous avons fini par perdre la souche après dix-huit mois de culture. Nous avons alors tenté de cultiver ce virus sur des tissus de Crown-Gall de Tabac qui se développent vigoureusement; pour cela, nous avons transmis ce virus à des colonies tissulaires saines par friction avec du carborundum, en utilisant la technique employée pour transmettre le virus de la Mosaïque du Tabac. Pour prélever Îe jus aseptique dans les pétioles de plantes malades, nous n'avons plus cette fois flambé ces organes, opération qui aurait risqué de détruire l’agent pathogène qui est assez fragile, mais nous les avons stérilisés par immersion d'une demi-heure dans une solution d’hypochlorite de calcium à 70 grammes par litre et nous en avons exprimé le jus dans un tube stérile après les avoir épluchés. Nous avons contrôlé le résultat de ces infections en inoculant quatre mois plus tard de jeunes : piants de Tabac à l’aide du jus provenant de colonies traitées. Les plantes inoculées ‘ n'ont pas tardé à présenter les symptômes caractéristiques du virus X.

Nous avons cherché à déceler, par la méthode sérologique, la quantité de virus contenue dans ces cultures. Nous avons constaté qu’elle était très inférieure à celle des tissus de la plante entière ; ainsi le virus X, comme le virus de la Mosaïque du Tabac, paraît incapable de se multiplier aussi activement dans les tissus tumoraux que dans les organes normaux.

3. Culture sur tissus de Jusquiame. — Nous avons également réussi à cultiver le virus X de la Pomme de terre sur des tissus de la racine de Jusquiame. La culture des tissus de cette plante a été l objet des travaux de Gauraerer et de Tezxe (7 1) et c’est pourquoi nous ne l'avons pas signalée dans la première partie de notre exposé. Pour réaliser ces cultures nous avons inoculé la maladie à de jeunes plantes dont nous avons ensemencé des fragments de racines comprenant du liber et du parenchyme vasculaire, en présence d’acide naphtyle acétique à la concentration de 10-6; ils ont produit des cals très volumineux qui ont été repiqués trois fois sur des milieux renfermant deux fois moins d’hétéroauxine (9.107); ces tissus étaient en tous points identiques à ceux des cultures saines ; seule linoculation de jus de jeunes plantes de Tabac a permis d'y caractériser le virus À.

Nous avons également cultivé ce virus sur des tissus de Crown-Gall de Jusquiame ;

pour cela, nous avons inoculé le Phytomonas tumefaciens au niveau du collet de plantes porteuses du virus X. D’énormes tumeurs (PL. XVI, fig. B) se sont développées au point d’inoculation ; nous en avons ensemencé des fragments, suivant notre technique ordinaire, sur des es dépourvus d’hétéroauxine; leur développement a été d’abord excessivement, rapide, puis s’est légèrement ralenti par la suite. Nous avons recherché, après six mois de culture, si ces tissus renfermaient toujours le virus. L’inoculation du jus extrait du broyage de deux colonies à de jeunes Tabacs a montré une réaction positive; mais nous n'avons pu encore apprécier les teneurs en virus de ces deux types de tissus, et nous ignorons si le processus tumoral provoque dans ce cas une diminution de la teneur en virus comparable à celle que nous avons observée chez le Tabac.

V. Cucrure ou virus Ÿ De La Pomme De verre. — Le virus Ÿ est surtout nuisible à la Pomme de terre. Les plantes atteintes présentent des symptômes très variables suivant la variété atteinte ; allant depuis la mosaïque légère à peine visible jusqu’à des nécroses brunes qui donnent aux feuilles un aspect bigarré et peuvent dans les cas graves provoquer leur chute.

Dans la nature, ce virus est transmis par divers Pucerons : notamment le Myzus persicae. Mais on parvient au laboratoire à l’inoculer par friction. C’est ce que nous avons tenté de faire en utilisant des cultures de tissus de tumeurs de Tabac. Pour cela, nous avons stérilisé des pétioles de Tabacs malades à l’hypochlorite de calcium, et après épluchage, nous en avons exprimé le jus virulent en les écrasant dans un tube à essais stérile. Nous avons ensuite inoculé le virus à des cultures de Crown-Gall de Tabac en opérant de la manière suivante : la colonie tissulaire était placée dans une boîte de Pétri stérile puis saupoudrée avec un peu de carborundum au préalable stérilisé à l’autoclave. Nous déposions ensuite une goutte de jus virulent sur la surface de cette colonie couverte d’abrasif et nous frottions très légèrement celle-ci avec une baguette de verre de façon à produire les lésions des cellules superficielles permettant la pénétration du virus. É

Les cultures inoculées ont continué à proliférer normalement et quatre mois plus tard, alors que celles-ci avaient subi 2 repiquages, nous avons constaté la régularité de l'infection, en inoculant le jus de ces cultures à de jeunes tabacs, dont les feuilles ont présenté les symptômes caractéristiques de la maladie.

En résumé, ces essais, bien que très fragmentaires, nous ont montré la possibilité de maintenir #2 vitro sur des cultures de tissus, trois des principaux virus des solanées : le virus de la Mosaïque du Tabac, le virus X et le virus Ÿ. Aucun de ces virus n’altère de façon sensible les tissus et ceux-ci continuent à proliférer de manière comparable aux tissus sains. Pourtant, nous avons pu vérifier dans certains cas, que, même après deux très longues périodes de culture in vitro, ils conservaient toute leur virulence, Nous avons enfin constaté que, dans le cas de la Mosaïque du Tabac, les tissus tumoraux et accoutumés renfermaient beaucoup moins de virus que les tissus de la plante entière et nous nous proposons d'étudier le mécanisme de cette diminution.