CHAPITRE I

Mesure de l’activité de la laccase.

Rappelons que la laccase est une phénolase, c’est-àdire une diastase qui favorise l’oxydation de dérivés phénoliques aux dépens de l’oxygène de l’air, réaction qui se manifeste par l’apparition d’une coloration ou d’un précipité.

Pour établir une méthode de mesure de l’activité de la laccase à la fois simple et rapide, il est tout indiqué de s’adresser aux réactions de coloration comme l'ont fait récemment FLEURY [46] et SUMINOKURA [99]. Mais, en dépit de sa simplicité apparente, cette détermination nécessite quelques explications préliminaires.

La mesure de l’activité d’une diastase est en somme une mesure de vitesse de réaction, c’est-à-dire une mesure de la quantité de matière transformée en fonction du temps.

Toutes les méthodes employées se déduisent facilement de l’équation suivante qui, en première approximation permet de représenter l’activité d’une diastase :

Q DE A — activité Q — quantité de matière transformée A Temps D — quantité de préparation diastasique.

(la température et la réaction du milieu sont supposées

constantes).

On voit sur l'équation que si l’on maintient constants

deux quelconques des facteurs du deuxième membre, l’activité variera en fonction du troisième facteur qui pourra ainsi servir de mesure de l’activité diastasique.

La formule précédente contient deux hypothèses

1° Pour une quantité D constante de diastase, il y a proportionnalité entre le temps et la quantité de matière transformée.

2° Pour un temps t constant, il y a proportionnalité entre la quantité de diastase et la quantité de matière transformée.

Dans le premier cas ( D constant), pour que la quantité de matière transformée soit proportionnelle au temps il faut que cette quantité Q reste petite par rapport à cele du substrat mis en œuvre ; en pratique, elle ne doit pas dépasser notablement 10 à 15 pour 100 du substrat (méthode dite des vitesses initiales).

Dans le deuxième cas (t constant) pour que la quantité de substance transformée soit proportionnelle à la quantité de diastase, il faut que le rapport entre les concentrations du substrat et de la diastase demeure entre certaines limites qu’il est possible de déterminer expérimentalement.

Enfin il faut tenir compte de l'influence des matières étrangères apportées par la préparation diastasique dont on veut mesurer l’activité.

Il peut arriver en effet que, même dans le cas où les conditions ci-dessus énoncées sont remplies, la loi de proportionnalité ne se vérifie pas, car lorsqu'on compare deux préparations diastasiques, on fait en réalité varier deux facteurs : la quantité de diastase et la quantité d’impuretés qui l’accompagnent inévitablement. Ces impuretés peuvent jouer un rôle important dans l’activité de la diastase, soit en la diminuant, soit, plus rarement, en l’augmentant. On peut d’ailleurs avoir une idée de cette influence en étudiant les variations d'activité de la diastase en présence d’une certaine quantité de solution diastasique inactivée par la chaleur.

= D Je

Mesure de l’activité de la laccase.

: Méthode de P. Fleury.

P. FLEURY, au cours de ses recherches sur la laccase [46], a mis au point une méthode colorimétrique de mesure de l’activité de cette diastase ; le principe de cette méthode est le suivant

La laccase provoque l'oxydation, aux dépens de l’oxygène de l’air, du gaïacol en tétragaïacoquinone dont la coloration rouge se prête à une mesure colorimétrique.

Quand la réaction est effectuée dans des conditions bien déterminées, indiquées par l’auteur, elle est suffisamment régulière pour servir de base à un dosage ; la tétragaiacoquinone formée est extraite par le chloroforme ; la coloration de la solution chloroformique est comparée à celle d’une solution centinormale d’iode prise comme étalon ; P. FLEURY a montré qu’une solution chloroformique à 46 mg.,5 de tétragaïacoquinone par litre, obtenue par extraction directe-de la solution aqueuse après action de la laccase sur le gaïacol présente la même teinte qu’une solution centinormale d’iode (examinée sous une épaisseur de 10 mm. au colorimètre DUBOSCQ).

Conditions du dosage.

Température : 30° (thermostat).

PH optimum : 6,7 (obtenu au moyen de solutions tampons de phosphates).

Durée d’oxydation : 10 minutes.

P. FLEURY a déterminé expérimentalement la valeur substrat gaïacol diastase — laccase pas dépasser ; il opère sur 10 cm* d’une solution de gaïacol à 1 p. 100 ; dans ces conditions la quantité de diastase mise en œuvre doit être telle que, après oxydation de la solution de gaïacol dans les conditions énumérées, la

du rapport qu'il convient de ne

quantité de tétragaïacoquinone formée ne dépasse pas 10 mg., soit 10 p. 100 du gaïacol.