MODE OPÉRATOIRE
a) Obtention du pH 6,7. — L’ajustage du mélange réactionnel au pH 6,7 est réalisé par tâtonnements ; dans un tube à essais on mesure 5 em de la solution de gaïacol à 2 p. 100 ; on ajoute : ch
1° des quantités mesurées des solutions de phosphates
Dre
disodique et monopotassique de telle sorte que le volume de leur mélange soit de 4 cm.
2° La solution diastasique (0 cm#,1 à 0 cm#,4) préalablement inactivée par la chaleur.
3° de l’eau distillée pour faire un volume de 10 em.
Le pH du mélange obtenu est mesuré colorimétriquement à l’aide du bleu de bromothymol.
En faisant varier les proportions relatives des phosphates, on arrive à obtenir le pH optimum 6,7.
b) Oxydation du gaïacol. — Toutes nos expériences ont été effectuées à l’aide du tube spécial décrit par P. FLEU- RY (Recherches sur la laccase : p. 35) ; la capacité totale de cet appareil est de 25 à 30 cm.
On y introduit 5 em° de la solution de gaïacol à 2 p. 100, 4 cm* du mélange tampon de phosphates choisi comme il vient d’être indiqué, et on complète le volume à 10 cm avec de l’eau distillée.
Le tube est placé au thermostat réglé à 30°. On y fait passer un courant d’air à la vitesse de 15 à 20 litres à l’heure. Quand l’équilibre de température est établi, soit au bout de 3 minutes environ, on soulève le bouchon de l'appareil et on y introduit, au moyen d’une pipette la solution diastasique exactement mesurée. On ajuste de nouveau le bouchon ; au bout de 10 minutes on introduit d’un seul coup dans l’appareil 10 cm* de chloroforme. On agite, après avoir fermé les orifices de l’appareil ; le chloroforme s’empare de la totalité de la tétragaïacoquinone. On prélève avec une pipette à travers la couche aqueuse la solution chloroformique de tétragaïacoquinone qui sera diluée s’il en est besoin, pour la mesure colorimétrique.
L'examen au colorimètre est effectué immédiatement la solution type d’iode N/100 étant toujours vue sous une épaisseur de 10 mm. On prend la moyenne de 4 mesures.
Soit H’ la hauteur lue en millimètres.
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c) Calcul. — Premier cas : La solution chloroformique d'extraction n’a pas été diluée.
Soit C la concentration en gaïacoquinone correspondant à la solution type observée sous la hauteur H, C la concentration cherchée. Si, pour avoir l’égalité de teinte, il a fallu observer la solution chloroformique de tétragaïacoquinone sous la hauteur H”, on peut écrire la relation fondamentale de la colorimétrie :
GR DS AC DEA Valeur de H. — Cette valeur est toujours 10 puisque
nous observons toujours la solution d’iode sous 10 mm.
Valeur de C. — La solution centinormale d’iode correspond à une solution de gaïacoquinone à 46 mg.,5 pour 1.000 cm°. Comme nous cherchons à connaître la quantité de gaïacoquinone contenue dans 10 cm de chloroforme, nous devons donner à C la valeur C — 0 mg.,465.
L’équation ci-dessus devient alors :
0 mg.,465 x 10 4,65 H? — H? mg.
Deuxième cas : La solution chloroformique d’extraction a été diluée avant la mesure.
Ce
el rte , :
Soit = la dilution (mélange de 1 volume de la solution
chloroformique extractive avec (n-1) volumes de chloroforme).
L’équation devient :
