C. Appareils utilisés

Poursuivant notre essai de purification de la laccase, nous avons cru utile de soumettre à l’ultrafiltration nos préparations diastasiques.

De nombreux appareils ultrafiltrants ont été préconisés, dûs à MALFITANO, BECHHOLD, ZSIGMOND, etc. La membrane ultrafiltrante utilisée généralement en collo- dion, est en forme de doigt de gant, ou elle est simplement constituée par une membrane plane, quelquefois on imprègne de collodion des supports ultrafiltrants de BECHHOLD et HOENIG, ils sont en porcelaine spéciale durcie et la partie filtrante n’est pas émaillée. On peut donner à ces supports des formes variables. Nous avons uti-

lisé des bougies Chamberland L2, dont les dimensions sont : 1 cm. de diamètre, 5 cm. de hauteur.

La membrane ultrafiltrante est obtenue en plongeant ces bougies dans du collodion (voir plus loin).

Nous avons utilisé un appareil ultrafiltrant présentant beaucoup d’analogie avec celui qu'utilisait MARTIN en 1896, pour la filtration de ses solutions colloïdales ; un tel système a servi à GIEMSA [49], puis avec quelques perfectionnements à HIRTH et TCHIEMBER [58] et à DELA- VILLE [31]. Nous avons simplement remplacé, dans l’appareil ultrafiltrant de DELAVILLE, le petit manchon de papier de SCHLEICHER, par une bougie de Chamberland L2 qui sert de support à la couche de collodion.

La bougie est traversée par un tube capillaire, et par l'intermédiaire d’une fiole de KITASATO, reliée à un appareil à vide. CourTois [30].

Nous avons connu trop tard l’appareil de GRABAR [50] pour l'utiliser dans nos recherches. Cependant les inconvénients que présente notre système ultrafiltrant par rapport à l’ultrafiltre de GRABAR, peuvent être réduits au minimum si on observe les deux précautions suivantes :

1° Rendre l’appareil étanche.

2° Prendre la précaution de placer dans la fiole de KITASATO, où se rassemble l’ultrafiltrat, quelques centimètres cubes d’eau pour réaliser une atmosphère saturée de vapeur d’eau et empêcher ainsi la concentration de l’ultrafiltrat par évaporation.

a) PRÉPARATION DU COLLODION.

La constitution des membranes de collodion, a été l’objet de nombreuses recherches, dans le but d'obtenir des membranes à pores de dimensions variables, permettant de retenir les colloïdes de différentes dimensions. On a utilisé soit du collodion acétique, soit du collodion éthéro-alcoolique, en faisant varier la con-

centration et les proportions d’alcool et d’éthér. SIGAUD [93] insiste sur la préparation de la nitro-cellulose, il conseille d'utiliser des collodions dont la teneur en nitro-cellulose varie de 1,5 à 6 p. 100 et de s’en tenir de préférence au taux de 2,5 p. 100.

Le facteur considéré comme le plus important dans la préparation de la membrane ultrafiltrante est la composition du mélange d’alcool et d’éther utilisé. Les dimensions des pores des membranes semblent diminuer lorsque les proportions relatives d’alcool s’élèvent.

La résistance, la perméabilité de la membrane, pa- ‘aissent aussi dépendre de ces proportions pour lesquelles SIGAUD a indiqué les limites suivantes

70 parties d'alcool à 960...,.... donnent une membrane S0 parte een ENTRE Nriée perméable.

30 parties d'alcool à 960... .u:.. donnent une membrane 70 parties d'éther ..,..... Eater perméable.

On conseille aussi, sans preuve expérimentales bien nettes, de laisser vieillir le collodion, et surtout les membranes obtenues, pendant un certain temps à l’étuve à 37° ce qui améliorerait la perméabilité.

La pression semble jouer aussi son rôle dans lPultrafiltration, certains auteurs conseillent des pressions allant de 10 mm. de Hg à une atmosphère, d’autres conseillent de ne pas dépasser 300 mm. de Hg.

Depuis l’époque où ces recherches ont été exécutées, GRABAR a indiqué une technique extrêmement minutieuse permettant l’obtention de membranes de porosité bien déterminée.

b) TECHNIQUE UTILISÉE.

Dans nos essais d’ultrafiltration, nous avons utilisé le collodion éthéro-alcoolique, après une étude sur la teneur en cellulose et les proportions d’alcool à utiliser, nous avons adopté la technique suivante :

Nitrocellulose Poulenc ........ 1 g.,5

EtHORÉ DE este Pre ea ie SA ER OUT CELS AJCOO! vhs DO RE rome 1. “HAURCIN®

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La nitrocellulose effilochée est d’abord imprégnée d’éther, l’alcool est ajouté ensuite par petites portions. Après une agitation lente, le collodion obtenu est conservé dans un flacon bien bouché, qui est maintenu renversé sous une couche d’eau.

Préparation de la bougie ultrafiltrante. — La bougie

Chamberland L2 longuement lavée à l’eau, à l’alcool et à l’éther, par aspiration, est séché à l’étuve à 100° pendant deux heures au moins. Si la bougie a déjà servi à une ultrafiltration, on opère de même après raclage de la membrane de collodion.

Dans une éprouvette de 30 cm, on verse lentement le collodion ci-dessus, en évitant les bulles d’air puis on plonge lentement la bougie Chamberland, de façon que le niveau du collodion dépasse la partie poreuse, et sans attendre, on retire lentement la bougie en prenant soin de bien égoutter la dernière goutte de collodion qui se forme à la partie inférieure ; on imprime un mouvement de rotation à la bougie, son grand axe étant maintenu horizontal, peu à peu l’éther et l’alcool s’évaporent, et on obtient ainsi une première couche. La durée de cette opération est de l’ordre de deux à trois minutes. On la recommence deux fois. Après évaporation de lalcool-éther, l’appareil est prêt à fonctionner. Quelques précautions doivent être prises :

1° Lors de l’évaporation de l’éther et de l’alcool, ne pas soufler sur la bougie pour hâter l’évaporation.

2° Eviter les bulles d’air lors de l’immersion de la bougie dans le collodion.

3° Le collodion qui a servi à l’immersion ne doit plus être utilisé car une partie des solvants volatils s’est évaporée et la concentration du collodion a varié.

c) VÉRIFICATION DU SYSTÈME ULTRAFILTRANT.

Nous avons vérifié nos ultrafiltres au début de nos essais, et quelquefois après utilisation. Pour contrôler la

perméabilité des ultrafiltres, BÉCCHOLD [10] a proposé plusieurs méthodes, et a donné une table qui permet de déterminer exactement la perméabilité du filtre utilisé. Parmi les méthodes qu’il indique, la plus simple consiste à filtrer un hydrosol d’hémoglobine (dimension de la micelle environ 2 my. Si le liquide passe incolore, l’ultrafiltre retient la plupart des sels minéraux.

Nous avons opéré de façon analogue avec une solution d’hémoglobine, obtenue de la manière suivante : quelques centimètres cubes de sang dilués dans du sérum physiologique sont centrifugés ; après deux lavages consécutifs avec du sérum physiologique, par centrifugation, le culot d’hématies est mis en suspension dans autant de fois 100 centimètres cubes d’eau distillée, qu’on a utilisé de centimètres cubes de sang. Après hémolyse ce liquide est soumis à l’ultrafiltration.

Nous avons essayé, aussi nos ultrafiltres avec du sérum sanguin dilué dans cent parties de sérum physiologique.

La plupart d’entre eux n’ont laissé passer ni la solution d’hémoglobine, ni le sérum dilué au 1/100° soit avant, soit après ultrafiltration de la laccase.

D. Ultrafiltration de la laccase.

À l’aide du système ultrafiltrant indiqué ci-dessus, nous avons soumis à l’ultrafiltration les sucs de laque de Nuoc’Son plus ou moins dilués.

20 cm de ce liquide sont soumis à l’ultrafiltration qui fournit 10 cm3 d’ultrafiltrat. Si la laccase est un colloïde, et que notre membrane ultrafiltrante retienne les particules les plus petites de ce colloïde, la partie non ultrafiltrée doit avoir une activité double de l’activité primitive puisque dans l’opération la concentration se trouve doublée. |

Résultats. — Voici les résultats obtenus en utilisant des sucs d'arbres à laque (Nuoc’son) plus ou moins dilués. (Tableaux I, IT et II).

TABLEAU I

d © © a 2 S & | SE) 5 | + K= ns La E 2 S Ê 25 5 a E = LES ES EEE SPRL Suc 10 cm + eau q.s.p. 100 cmê| 1.100| 2,000 |traces | 1.037

Résultats exprimés en C.D.

TABLEAU II

Ultrafiltration du suc à pH = 5,2.

SUCPAUÉES. 2. Dodo do Te 16 cm3 HÉONES AD Ne merci 100 cm3 On opère avec 20 em de cette dilution,

Suc dilué

a A A B. : not 3 ous È 2 S Sra| 2e ES 28 |: ssl Psp r sr sles esse | Fr A an = de) = Le 2 es © a < 1 2 3 & 5 6 Suc dilué : 20 Gm8................ 130,4| 1,815! 150 | 3,25 | 72,8 24,9 Ultrafiltration totale, 40%non ultrafñitrable 2%. .:...:. 1240180 /845 50 M0 10114152 8,85 DOM OMDRARE M Too re à ...| 0 |0,945) 90 | 2,00 Ultrafiltration totale et lavage.

49-non-ultratiltrable. 2"... ....:1. 125180 625125515085 12200 6,78 DOI A ITA nee ces 0 945| 90 | 2,05 39 liquide de Fiaes.<6.50. 0e. 0 |0,240| 25 | 0,40

Remarque : Les valeurs données dans les colonnes 1, 2, 3 et 4 se rapportent à la totalité des produits mis en œuvre.

Ultrafiltration au pH = 9,2{ solution N.Co;Na ..... 40 cm |

TABLEAU III

suc dilué au 1/3,......,. 40 cm$ )

centrifuger .

on opère avec 20 cm3 du liquide surnageant.

3 el Co] A D] E nrrN RL ee) Seules San guw|£Se| $6 | 2215618 = = + S = ££ es . S 2 D ve É cs) S = a 2 E È E = [==] 5 |& "| #4. | 26,6 El IA , c l 2 3 4 5 6 Suc non traité par Co;Na mais dilué au 1/6 : 20 cm8............ 141,5] 1,725] 15,5 | 3,2 | 82,2] 29,7 Suc traité par Co;Na : 20 cm8....| 137,5] 2,240| 74,5 | 0,435 ,18 Ulirafiltration totale.

4°nonaultratlirablé 0. 145 | 1,44 | 18 0,27 | 100 1,86 2oultraniliratses ee Er 0 | 0,960! 525 | 0,125 Ultrfiltration totale et lavage.

19-noniuItratilraDIé SES TS 130 0,990! 40,5 | 0,15 | 131 0,86 D'OSUUTAN ETAT Se re cat eee: 3:3151-515 0,10 SHquidé dudavape ete rc ee 0 | 0,230] 10,5 | 0,05

Remarque : Les valeurs données dans les colonnes 1, 2, 3 et 4 se rapportent à la totalité des produits mis en œuvre.

Remarque : On voit que, le mélange du suc primitif et de l’ultrafiltrat nous conduit toujours à une perte d’unités diastasiques qui est de l’ordre de 10 p. 100. Nous constatons ici sous une autre forme ce que nous avions déjà observé dans nos précipitations alcooliques ou acétoniques.

Conclusions. — De ces trois expériences, il résulte que notre système ultrafiltrant, préparé et vérifié selon la technique donnée précédemment est susceptible d’arrêter complètement la laccase, ainsi que le prouve l’inactivité de nos ultrafiltrants et le maintien quasi intégral de l’activité dans le suc non ultrafiltrable. La perte en unités diastasiques U.D. est d’environ 12 p. 100 dans les cas les plus défavorables.