CHAPITRE IV

Adsorption et élution.

L’adsorption mise en œuvre méthodiquement par WiL- : LSTÂTTER et son école, a permis d’obtenir des diastases à un degré de pureté et de concentration, jusque là jamais atteint.

Les techniques de l’adsorption sont beaucoup plus simples, beaucoup moins brutales que celles utilisant des réactifs chimiques.

L’adsorption exige, cependant des préparations diastasiques suffisamment purifiées, et à ce titre, elle fait suite et elle complète les autres méthodes de purification (précipitation, dialyse, ultrafiltration).

Ces dernières méthodes employées au début de la purification, ne provoquent pas de trop grandes pertes de l’activité, grâce semble-t-il, aux colloïdes qui protègent la diastase ; mais lorsque la purification est très avancée et que la diastase devient de plus en plus sensible, seule l’adsorption est utilisable, et elle permet grâce à son inocuité, de pousser très loin la purification.

L’adsorption permet au chercheur de réaliser une élimination progressive des diverses substances que l’on rencontre constamment dans les préparations diastasiques et de reconnaître par là même, si telle ou telle substance est nécessaire, indifférente ou nuisible à l’activité de la diastase.

Les travaux de WILLSTÂTTER et de ses collaborateurs nous montrent la valeur de cette méthode. C’est ainsi que WILLSTÂTTER, SCHNEIDER et WENSEL [117] ont ob-

tenu la saccharase de la levure de bière, à un degré de pureté élevé. Ils ont pu notamment séparer cette diastase de la « gomme de levure » en effectuant des adsorptions successives avec un hydrate d’alumine et avec le kaolin. Leurs préparations les mieux purifiées ne donnaient plus les réactions des protéines, (Réaction de Millon négative) et ne renfermaient plus que des traces de tryptophane (Réaction Xanthoprotéique légèrement positive). Les réactions des glucides avaient aussi disparu. De même pour la peroxydase du raifort, WILLSTÂTTTER et POLLINGER [115] ont réussi, grâce aux méthodes de purification par adsorption, à obtenir une préparation diastasique très concentrée, ne renfermant plus ni protides, ni glucides, et dans laquelle le fer et le phosphore étaient éliminés en grande partie. WILLSTÂTTER et ses élèves ont réussi également à faire disparaître les réactions des protéines et des glucides dans les lipases et les estérases du pancréas, du foie, dans l’amylase pancréatique. |

C’est encore par l’adsorption, que WILLSTÂTTER [110] étudiant une peroxydase végétale, et que KRAUT et BaAu- ER [68] examinant la papaïne montrèrent la présence de corps inhibiteurs, séparables par adsorption.

Les applications de l’adsorption à l’étude des diastases du tube digestif montrèrent à WALDSCHMIDT LEITZ [107] le rôle d’activateur que joue l’entérokinase sur la trypsine pancréatique. La trypsine avec l’entérokinase attaque les protéines, la trypsine débarrassée d’entérokinase par adsorption "n’attaque plus que les peptones.

A. Historique de l’adsorption des diastases.

L'histoire de l’adsorption des diastases peut être divisée en trois étapes.

1° La première étape correspond aux recherches d’auteurs isolés. Leurs essais quoique ingénieux, sont restés à l'arrière plan dans la littérature des diastases parce

qu'ils ne comportaient pas de mesures quantitatives. Il manquait d'autre part aux chercheurs de cette époque les données si précieuses qu’apportèrent plus tard la chimie physique, et la chimie biologique.

La première expérience sur l’adsorption semble être due à Ernest BRUuCKE [27] qui en 1861, dans une étude sur la digestion constate la fixation de la pepsine sur une substance solide, extrêmement divisée, telle que le phosphate de chaux, le soufre ou le cholestérol. Pour libérer la diastase de l’adsorbat, BRUCKE utilisa l’acide phosphorique pour dissoudre le phosphate de chaux, ou l'éther pour dissoudre le cholestérol. Mais le manque de méthodes, d'étude quantitative de la pepsine, ne permit pas à cet auteur d'utiliser avantageusement cette technique de purification.

L'année suivante, dans le laboratoire de KUHN, DANI- LEWSKY publia un travail qui, s’il avait été étudié à fond aurait pu être riche en conséquences. En partant d’un suc pancréatique sans pouvoir lipasique, et utilisant le collodion comme adsorbant, DANILEWSKY réalisa l’adsorption de la diastase protéolytique (trypsine) et utilisant l’albumine comme adsorbant il réalisa ladsorption de l’amylase avec des traces de trypsine, il put méme éluer la trypsine par l’alcool dilué.

Les essais d’adsorption furent continués au laboratoïre de KUHN en 1863 par J. COHNHEIN [29]. Celui-ci traitant par adsorption la salive avec du phosphate de calcium, obtint après lavage à l’eau, une ptyaline active dépourvue de mucine. En traitant de la même façon une macération pancréatique, il obtint une solution d’amylase sans trypsine.

-En 1872, O. HAMMARSTEN [52] décrivit une méthode avec laquelle il pu obtenir une chymosine de pepsine, par précipitation avec le carbonate de magnésium ou avec une solution d’acétate de plomb.

Par une autre méthode de purification, J. P. PAWLOW et S. W. PARATSCHEN et O., HAMMARSTEN montrèrent plus

tard que la solution de chymosine, renferme de la pepsine inactive.

2° La deuxième étape de l’histoire de l’adsorption des diastases comprend les recherches de toute une série d'auteurs, qui donnèrent des bases nouvelles à l’adsorption, et préparèrent en quelque sorte les travaux de WiL- LSTÂTTER et de ses collaborateurs.

C'est ainsi que HÉRISSEY [56] dans son travail sur l’émulsine étudia l’action du tanin sur cette diastase. Une préparation d’émulsine donne avec le tannin un précipité abondant. Alors que le filtrat est inactif sur l’amygdaline, le précipité complexe émulsine-tanin dédouble ce glucoside très rapidement. Malheureusement l’auteur n’a pu éluer. ensuite l’émulsine du précipité obtenu. De ce travail il faut toutefois retenir un fait important l’action de certains réactifs sur les diastases est susceptible de déterminer un précipité actif par suite de l'entraînement par adsorption. Il n’est pas nécessaire comme l’a montré HÉRISSEY et comme le démontrèrent plus tard BOURQUELOT et BRIDEL [26] pour assurer j’action des diastases de les utiliser à l’état de dissolution. Cette action du tannin mise en évidence par H. HÉRISSEY a été utilisée avec profit par WILLSTÂTTER et POLLIN- GER [115] et WiILLSTÂTTER et STOLL [118] sur une peroxydase végétale déjà extrêmement purifiée.

Des essais d’adsorption qui furent très nets au point de vue des résultats sont contenus dans les travaux de HEDIN [54] en 1907.

Cet auteur réussit par adsorption fractionnée, une séparation très intéressante de trois protéases de la rate, protéases agissant partie en solution acide, et partie en solution alcaline, et contenant par conséquent un mélange de peptases et de tryptases. Il utilisa la terre d’infusoire (Kieselguhr) qui adsorbe la tryptase, tandis que l'enzyme agissant en milieu acide reste en solution (peptase).

HEDIN constata d’autre part que la tryptase était toujours adsorbée par le charbon quelle que soit la réaction du milieu. Il réussit l’élution avec une solution de caséine à température relativement élevée.

MICHAELIS et EHRENREICH [82] d’une part et ICOVESco [62] d’autre part, apportèrent dans l’étude de l’adsorption des diastases des précisions d’ordre physicochimique.

MICHAELIS et EHRENREICH [80 et 81] étudièrent les propriétés électro-chimiques des diastases et des adsorbants. Ils admirent que l’adsorption dépendait de la charge électrique de la diastase et de celle de l’adsorbant. Ainsi le kaolin chargé négativement adsorbe les bases et l’alumine chargée positivement adsorbe les acides ; l’invertine adsorbée par l’alumine ne l’est jamais par le kaolin ; cette diastase présenterait donc un caractère acide. La ptyaline de la salive, la trypsine adsorbées indifféramment par le kaolin et par l’alumine, sont des corps amphotères.

ISCOvESsco étudia l’action du courant électrique sur les colloïdes et constata que l’albumine coagulée prend une charge positive dans l’eau acidulée et une charge négative dans l’eau distillée. Si l’on fait passer le courant à travers un suc gastrique renfermant de l’albumine coagulée, on constate à l’anode une activation de la digestion pepsique. Grâce à l’action du courant électrique, la pepsine a donc été adsorbée par l’albumine dont la charge est positive.

L. AMBARD [1] en 1920, en étudiant le mécanisme de la digestion amylolytique, utilisa l’adsorption de l’amylase par l’amidon de riz cru. L’amylase se fixe sur l’amidon cru, et si, cet adsorbat après lavage à l’eau est mis en présence d’empois d’amidon, celui-ci est aussitôt hydrolysé.

J. EFFRONT [35] étudia l’adsorption de la ptyaline par la cellulose des filtres. La ptyaline, se fixe plus fortement à chaud qu’à froid, et n’est pas éluable par l’eau, ni par

les solutions sucrées. Elle entre en solution en présence d’empois d’amidon ou de chlorure de sodium.

3° La troisième étape de l’histoire de l’adsorption des diastases est la plus importante. D’une part le rôle de la réaction du milieu (ph) permit de réaliser des adsorptions et des élutions dans des conditions bien déterminées. D’autre part, les mesures quantitatives de l’activité des diastases se perfectionnèrent.

Les résultats ne se firent pas attendre, ils furent si nets, si concluants, qu’à l’heure actuelle, les méthodes d’adsorption sont considérées par la plupart des auteurs, comme le principal moyen de purification des diastases.

Cette troisième étape est l’œuvre presque entière de WILLSTÂTTER et de ses collaborateurs. Il y a peu de diastases que WILLSTÂTTER n'aient tenté de soumettre à des essais d’adsorption. Non seulement il a réussi à porter à un degré très élevé la purification des diastases, à ‘séparer de nombreuses diastases entre elles, mais il a de plus, donné des techniques précises, et défini les modalités de chaque adsorption. Cette étude systématique, a amené WILLSTÂTTER et KRAUT [114] à étudier les adsorbants eux mêmes et spécialement les hydrates d’alumine. Si la bibliographie de l’adsorption des diastases a été relativement simple dans les deux premières étapes, elle devient très compliquée dans cette troisième partie. Il est impossible de citer ici tous les travaux de WILLSTÂTTER et de ses collaborateurs, on consultera avec fruit les auteurs suivants : en langue allemande : Von EULER [37] OPPENHEIMER et KUHN [86] d'OPPENHEIMER- PINCUSSEN [87] et en langue française, les conférences de : E. LE BRETON [71] de FABRE [48] AUBEL et GENEvois [2] et une revue de G. VALETTE [105].

A côté de l’œuvre immense de WILLSTÂTTER, de nombreux auteurs apportèrent une importante contribution à l’étude de l’adsorption des diastases. Là encore, il nous est impossible d’énumérer les publications de chacun d’eux, on se rapportera aux ouvrages d'ensemble cités ci-dessus.

DO |) Ce

Cependant nous devons mentionner les travaux de MADINAVEITTIA [74] qui appliqua un des premiers (1912) dans le laboratoire de WILLSTÂTTER, l’adsorption pour la purification de la catalase. Cet auteur utilisa des acides gras comme adsorbants. Plus tard HENNICHS [57], contüinuant les travaux de BATTELI et STERN [8], utilisa l’adsorption par l’alumine pour la purification de la catalase. La solution de catalase purifiée d’abord par des précipitations fractionnées à l’aide d’alcoo!l, est acidifiée par l’acide acétique et traitée par une suspension d’alumine qui fixe 90 p. 100 de catalase. L’adsorbat séparé par centrifugation est élué par une solution de phosphate disodique. L’éluat est ensuite soumis à la dialyse dans un sac de collodion.

HENNICHS utilisa aussi pour l’adsorption de la catalase le kaolin qui, d’après lui, fixe moins facilement cette diastase que ne le fait l’alumine, mais donne de meilleurs résultats au point de vue de la pureté. Par cette méthode HENNICHS est arrivé à obtenir une préparation 300 à 400 fois plus active que la première, et il en a fait l’analyse que nous croyons inutile de reproduire ici.

A côté de l’école de WILLSTÂTTER, EULER et ses collaborateurs contribuèrent pour leur part, à l’étude des phénomènes d’adsorption des diastases, en ce qui concerne la cinétique, soit la purification des diastases.

C’est ainsi que EULER et JOSEPHSON [40] modifiant encore les techniques de HENNICHS pour l’étude de la catalase remplacent, pour l’élution, les phosphates alcalins, par l’ammoniaque et pratiquent la dialyse à basse température ils purent obtenir ainsi une catalase 700 fois plus active que la préparation initiale.

EULER et MYrBÂCH [42] ont réalisé des adsorptions de linvertine en utilisant l’hydrate d’alumine comme adsorbant et l’ammoniaque comme agent d’élution. Ils ont étudié l’adsorption en fonction du pH, et trouvé que leur préparation d’invertine est fixée par l’alumine dans une proportion voisine de 90 p. 100 entre les pH 5 et 7.

SHERMAN (H.C) CALDERWELL (M. L) et Apams (M.) [92] purifièrent par adsorption l’amylase d’une pancréatine commerciale extraite par une solution de glycérol à 87 p. 100. L’adsorption est réalisée par une supension de gel d’alumine en présence d’alcool. À un pH compris entre 5,2 et 6 avec une teneur en alcool de 25 p. 100 et une suspension d’alumine dont la teneur en Al:O; comprise entre 0 g.,60 et 0 g.,80 pour 100 cm de diastase, ils adsorbent environ 90 à 95 p. 100 de l’amylase contenue dans leur préparation. Pour l’élution ils obtiennent d’excellents résultats en utilisant une solution diluée de soude 0,0015 M. à basse température. Le volume de solution alcaline employée est le tiers ou le quart du volume de la solution diastasique utilisée pour l’adsorption.

B. Théories de l’adsorption.

La complexité des phénomènes d’adsorption a engendré nécessairement une multitude d’hypothèses, tendant à expliquer leur mécanisme.

Les phénomènes d’adsorption s’observent au contact de deux phases différentes — phases solide et phase gazeuse — ou phase solide et phase liquide — et traduisent tous l’enrichissement de la phase solide au dépend de la phase gazeuse ou liquide — En ce qui concerne l’adsorption des diastases, c’est la phase solide qui s'enrichit aux dépens de la phase liquide. Cet enrichissement est plus ou moins accentué selon les conditions, et les circonstances peuvent rendre également la réversibilité du phénomène plus ou moins facile.

Quand une substance dissoute est captée par un corps rigide (adsorbant) un grand nombre de phénomènes peuvent entrer en jeu, capillarité moléculaire (processus de MicHAELIS), condensation, réactions chimiques, de sorte qu’il est très difficile de distinguer l’adsorption et l’absorption.

Cest pourquoi J. W. Mac Bain, [7] Von EULER, [57] KOPACZEWSKI [64] rangent tous ces phénomènes sous le terme général de sorption. Sur les caractères généraux de l’adsorption dont l'étude sortirait du cadre de ce travail, on consultera avec fruit les ouvrages de Von Evu- LER [37] KopaczEwskt [64] et la revue de FABRE [44]. Nous n’envisageons ici que la partie de ladsorption qui a trait aux diastases.

D’après WiLLSTÂTTER et ses élèves, reprenant une théorie esquissée par G. BERTRAND, une diastase est une substance chimique active fixée sur un support colloidal. Pour une diastase donnée la nature de ce support colloïdal peut varier, c’est-à-dire que le groupement chimique actif qui constitue la diastase proprement dite peut passer d’un support sur un autre, suivant les conditions du milieu sans que l’activité diastasique varie. C’est ce qu’on effectue lorsqu'on réalise des adsorptions, la diastase passe de son support colloïdal naturel sur le support colloïdal qui est l’adsorbant lui-même.

MiCHAELIS et EHRENREICH [82] admettent que l’adsorption dépend de la charge électrique de la diastase et de celle de l’adsorbant. L’alumine est alcaline et chargée positivement, le kaolin est acide et chargé négativement, et les diastases qui se fixent sur l’un ne peuvent en général se fixer sur l’autre. Toutefois l’on doit tenir compte de l’état de pureté de la préparation diastasique, et WIiLLSTÂTTER discute les conclusions de Mï- CHAELIS et de EHRENREICH qui ne tiennent pas compte du rôle des corps accompagnant la diastase dans l’adsorption. Ainsi sous l’action du courant, l’invertine en solution impure se porte à l’anode et elle est adsorbée par l’alumine (tonerde) ; après purification, elle va aux deux pôles et elle est adsorbée par le kaolin (WILLSTÂT- TER, GRASER et KUHN [112]. La saccharase incomplètement purifiée est adsorbée par l’alumine, purifiée davantage elle devient amphotère (WILLSTÂTTER et RAKE [116]). L’amylase provenant des extraits du pancréas est

adsorbable par l’alumine, mais il est facile de la rendre non adsorbable par les adsorbants acides ou basiques en la purifiant WILLSTÂTTER et WALDSCHMIDT-LEITZ [119]. Il semble d’après toutes les expériences de WiLLSTÂT- TER qu'il est difficile de fixer a priori, la charge et la modalité d’adsorption de telle ou telle diastase, et comme le fait si bien remarquer Mlle Eliane LE BRETON, une diastase de signe positif peut être engagée dans un complexe colloïdal avec un excès d’un colloïde négatif et son affinité pour tel ou tel adsorbant peut être de ce fait totalement modifiée. Il semble donc que l’hypothèse de MICHAELIS d’après laquelle les adsorbants agissent par leur propriété basique ou acide sur les complexes diastasiques de charge électriquement opposée n’est pas suffisante pour expliquer tous les faits expérimentaux. Pour H. KRAUT, le rôle des charges électriques des adsorbants et de la diastase est indiscutable mais sur cette action s’en greffe d’autres, de nature chimique, qui obligent à chercher les conditions appropriées à chaque purification par adsorption. WILLSTÂTTER a encore perfectionné les techniques d’adsorption, en utilisant des adsorbants sélectifs, les travaux sur ce sujet semblent fournir un nouvel argument contre les idées de MICHAELIS.

WILLSTÂTTER et KRAUT [114] ont préparé et étudié toute une série d’hydrates d’alumine qui possèdent des propriétés sélectives vis à vis de telle ou telle diastase. Ils ont trouvé que les corps chnnquenens voisins, présentent de grande différences quant à l’adsorption: Le gel d’alumine A1,0, rapidement vieilli est supérieur à un gel d’alumine très frais, en ce qui concerne l’adsorption élective d’un mélange de saccharase et de maltase. WILLSTÂTTER et BAMANN [111] ont trouvé que pour séparer la maltase et la saccharase, il faut se servir de « tonerde » bien définie. On peut ajouter d’autres exemples de ce genre, notamment dans la séparation des enzymes provenant de l’appareil digestif. | L’orthohydroxyde d'aluminium rapidement vieilli absorbe beaucoup de trypsine, lentement vieilli il n’adsorbe

plus de trypsine (WALDSCHMIDT-LEITZ, SCHÂFFNER, W. GRASSMAN [108]. Ces deux sortes d’hydroxyde d’aluminium adsorbent l’érepsine, et pour séparer la trypsine de l’érepsine il faut se servir de l’orthohydroxyde lentement vieilli. Le métahydroxyde adsorbe contrairement à l’hydroxyde, plus de trypsine que d’érepsine.

Citons encore .les expériences devenues classiques de la séparation des trois diastases pancréatiques à l’aide du kaolin et de l’alumine par WiLESTÂTTER. On trouvera d'autre part de nombreux exemples d’adsorption sélective dans l’intéressante conférence d’Eliane LE BRE- TON [71].