C. Théorie de l’élution
L’élution est le phénomène inverse de ladsorption c’est la décomposition d’une combinaison d’adsorption. En traitant l’adsorbant chargé de diastase par une solution minérale de pH défini, différent de celui où s’est effectué l’adsorption on fait passer l’enzyme en solution tandis qu’une partie des impuretés qui accompagnaient la diastase restent fixées sur l’adsorbant. Parfois le déplacement de la diastase est obtenu avec des substances pour laquelle la diastase a une grande affinité.
Nous avons vu que AMBARD [1] déplaçait l’amylase fixée sur l’amidon cru par l’empois d’amidon ; J. Er- FRONT [35] déplaçait la ptyaline fixée sur ses filtres de cellulose par l’empois d’amidon ; HEDIN [54] élue la tryptase par la caséine.
MEYERHOF [79] a utilisé le sucre de canne pour libérer la saccharase de sa liaison avec l’hydroxyde de fer. D’après les travaux de WiLLSTÂTTER d’une part et de Mi- CHAELIS [80] d’autre part, il semble que l’élution du sucre de canne n’est pas spécifique, et qu’il n’y a pas seulement élution de l’enzyme, mais aussi de son substratum.
Tout comme l’adsorption, l’élution a demandé des recherches particulières. I1 semble qu’il soit nécessaire que
on. JD =
l’adsorbat renferme à côté de l’enzyme certaines substances favorisant l’élution. WiLLSTÂTTER et RACKE [116] ont été les premiers à faire des expériences sur ce point. Leurs travaux portèrent sur l’élution de l’invertine dans les adsorbats de tonerde. Si l’adsorption est effectuée dans les autolysats obtenus rapidement en traitant la levure par le toluène, l’invertine est éluable par l’ammoniaque diluée, mais si on neutralise l’activité produite pendant l’autolyse, les adsorbats de tonerde ne peuvent plus être élués par l’ammoniaque. Si au contraire on soumet à l’adsorption des autolysats préalablement déféqués par l’acétate de plomb, c’est le contraire que l’on observe : l’adsorbat est élué par l’ammoniaque diluée.
Dans tous les adsorbats, on peut éluer l’invertine par du phosphate d’ammonium. WiLLSTÂTTER et RACKE, expliquent ces faits en admettant que les diastases ne sont pas toujours fixées directement sur l’adsorbant, mais qu’elles sont fixées par des composés intermédiaires, qu'il ont appelés « co-adsorbants ». Aïnsi la liaison directe enzyme-adsorbant pourrait être éluée par l’ammoniaque, tandis que la liaison enzyme-co-adsorbant-adsorbant ne présenterait pas ce caractère. D’autre part les enzymes pourraient aussi former d’autres combinaisons avec des substances qui les accompagnent et auquels s’attaquent les produits utilisés pour l’élution. Ces substances sont appelées co-éluants. Les deux sortes de substances co-adsorbantes et co-éluantes peuvent prendre part à l’adsorption avec l’enzyme.
En schématisant la composition des complexes diastasiques à base de saccharase, WILLSTÂTTER et RACKE, ont envisagé les 3 cas suivants :
co-adsorbant-adsorbant Nco-éluant à ce complexe est éluable par l’ammoniaque diluée. .
2° Enzyme — co adsorbant — adsorbant complexe non éluable par l’ammoniaque.
3° Enzyme — adsorbant complexe non éluable par l’ammoniaque.
1° Enzyme
Dans l’autolysat de levure non neutralisé on aurait à faire au complexe [1] où malgré le co- adsorbant l’enzyme peut être élué par l’ammoniaque.
Cette théorie a fait ses preuves, plus tard dans plusieurs exemples l’existence des co-adsorbants a été prouvée. C’est ainsi que l’amylase pancréatique d’après WiL- LSTÂTTER, WALDSCHMIDT-LEITZ et HESSE [120] perd complètement sa faculté d’être adsorbée par l’alumine si on lui enlève certains corps qui l’accompagnent normalement (co-adsorbant).
Reste à expliquer le rôle des phosphates dans l’élution il semble que le mode d’action des phosphates soit différent de celui de l’ammoniaque diluée, ceci indépendamment de la variation de pH qu’ils produisent.
EULER et ERIKSON [39] ont constaté que l’hydroxyde d'aluminium adsorbe de grandes quantités de phosphates. On peut penser que l’élution par le phosphate est due au remplacement de l’enzyme par le phosphate plus facilement adsorbable (adsorption d'échange).
D. Les facteurs de l’adsorption.
Malgré les nombreux travaux publiés, l’adsorption de la diastase n’est pas sans difficultés. Cette méthode de purification exige au préalable, toute une série d'essais qui rebutent souvent les chercheurs trop pressés. Il faut, en effet, pour chaque diastase, édifier une technique opératoire qui dépend de facteurs aussi nombreux que variés.
a) INFLUENCE DE LA PURETÉ DES DIASTASES.
Généralement, il faut faire subir des purifications plus ou moins poussées aux préparations diastasiques avant de les soumettre à l’adsorption. Et, à ce titre, les méthodes d’adsorption dépendent de toutes les autres méthodes de purification, qu’elles sont destinées à compléter. On utilise
généralement des précipitations, alcooliques et acétoniques, mais celles-ci sont parfois insuffisantes, tel est le cas du suc d'arbre à laque qui renferme une quantité considérable de substances étrangères. Il existe une méthode originale et intéressante pour l’obtention d’une bonne préparation diastasique, méthode qui, malheureusement ne s'applique qu’à des cas restreints, mais qui permet d’avoir une diastase à un excellent degré de pureté. C’est celle que WILLSTÂTTER et STOLL [118] ont utilisé pour la préparation de la peroxydase du raifort. Ces auteurs réalisent une adsorption de la peroxydase La racine fraîche du raifort, bien mondé et lavée, est découpée perpendiculairement à son axe longitudinal en tranches de un demi millimètre d'épaisseur, après un lavage à l’eau courante pendant plusieurs jours, les racines sont traitées par l’acide oxalique (solution à 2 p. 100) qui fixe la peroxydase dans les cellules. Le produit est égoutté et broyé jusqu’à l’obtention d’une pulpe qui est filtrée au Buchner sur filtre en tissu, le produit est encore lavé avec la solution d’acide oxalique à 2 p. 100. Puis le résidu exprimé est traité par une suspension de baryte, qui élue la peroxydase. Par filtration on obtient une solution de peroxydase qui, en solution alcoolique à 50 p. 100 est directement adsorbable par l’alumine. La composition chimique de la préparation diastasique joue aussi un rôle important. De fortes teneurs en albumine, en glucides, la présence de substance résineuses où gommo résineuses s'opposent à l’adsorption. C’est ainsi que WiLLSTÂTTER et RACKE [116] pour pouvoir réaliser des adsorptions de l’invertine de la levure de bière ont dû abandonner l’autolyse sans antiseptique de C. O. SUELIVAN et F. V. ToMmPpsoN [948] (car ces solutions renferment trop d’albumines et d’hydrates de carbone) pour utiliser la méthode plus rationnelle de C. S. Hupson et N. S. Paie [60] : l’hydrolyse partielle avec addition de toluène ; mais là encore il est nécessaire pour réussir d’adsorption, de laisser vieillir ces solutions d’in-
vertine pendant plusieurs mois, pour permettre la digestion complète des substances albumineuses. WILLSTÂT- TER et SCHNEIDER [117] acidifient fortement l’invertine obtenue d’après la méthode d’Hupson. Elle est alors adsorbable par le kaolin.
KRAUT et RUBENBAUER [69] purifient l’estérase du foie (extrait de foie ammoniacal) par dialyse avant de faire l’adsorption.
b) INFLUENCE DE LA RÉACTION DU MILIEU.
Lorsque la préparation diastasique est suffisamment purifiée pour être soumise à l’adsorption, il faut faire une étude de celle-ci en fonction de la réaction du milieu, car il existe un pH optimum d’adsorption, comme il existe un pH optimum d'activité diastasique. Les divers pH sont obtenus en utilisant des solutions tampons de faible concentrations pour ne pas surcharger en électrolytes la préparation diastasique purifiée. Nous avons constaté en effet au cours de nos essais d’adsorption, que des préparations de laccase renfermant beaucoup de carbonate de sodium ne peuvent pas être adsorbées à moins de recourir à certains artifices que nous indiquerons plus loin.
EULER et MYrBACK [42] ont fait des expériences sur l'influence de l’acidité sur l’adsorption de la saccharase par l’hydrate de tonerde. Ils utilisèrent comme mélange tampon le mélange acide acétique et amoniaque et trouvèrent que le pH optimum d’adsorption est voisin de 6 pour leur préparation de saccharase. Environ 90 p. 100 de la saccharase sont adsorbés à ce pH.
EULER et JOSEPHSON [41] ont pensé découvrir une relation entre l’optimum du ph d’adsorption et les propriétés amphotères de la saccharase.
La présence des impuretés rend parfois délicates les variations du pH, c’est ainsi que NorTHop [85] travaillant sur la trypsine, dont la purification était moins
poussée que celle de la saccharase, a trouvé un maximum d’adsorption sur charbon très étendu compris entre pH 3 et pH 9, c’est-à-dire quasi indépendant de la réaction du milieu.
Lord NORDFELT a trouvé que l’oxynitrilase de l’émulsine est adsorbée par l’alumine, aussi bien en milieu alcalin qu’en milieu acide.
La réaction du milieu si importante pour l’adsorption de la diastase joue encore un grand rôle dans la séparation des diastases entre elles, tel est le cas des diastases pancréatiques : lipase, amylase et trypsine (WIiLLs- TÂTTER €et WALDSCHMIDT-LEITZ [119].
