Recherches sur la sucrase: diastase inversive du sucre de canne

Les faits nombreux qu'une science accumule à se peuvent rarement, lorsqu'on les examine plus tard d'un ] rester complètement d'accord avec les observations r dont elle s'enrichit peu à peu ; il arrive un moment oi d^s faits anciens doit être reprise à la lumière des noi centea^ parce qu'on a chance, dans cette revision, de f paraître ^es contradictions apparentes et d'élucider d( qu'on s'étaîl contenté jusque-là de noter en passant et qu laissés sans exjp^lication. L'ensemble de nos connaissanc diastases n'échappç pas à cette loi générale ; les nombi vaux dont l'étude de ces corps singuliers a fourni la mal bien d'accord lorsqu'il a'agit de décrire les propriétés g de chaque diastase; mais si Ton cherche à pénétrer da tail du mode d'action de ces substances, on trouve u d'affirmations contradictoires, non seulement quand ( d'un auteur à l'autre, mais souvent chez un même autei

C'est qu'en effet il n'y a point de terrain d'études pi vaut que celui que nous présentent les diastases, et le£ dictions que nous rencontrons ne sont pas imputables aui des travaux publiés sur ce sujet, mais bien au sujet lu C'est là ce que je voudrais essayer de montrer ici, me pi moins de faire un résumé des travaux auxquels les dias

donné lieu, que de faire ressortir, en examinant quelques points particuliers de ces travaux, la nécessité de la revision dont je parlais tout à l'heure. Il nous sutlît pour cela de passer en revue quelques-unes des propriétés générales des diastases, en insistant sur les données qui paraissent le moiiis nettement établies et qui peuvent, par là même, prêter matière à des assertions contradictoires.

Une des grandes difficultés que présente l'étude des diastases, c'est rimpossibililé de préparer ces corps à Télat de pureté. Pour faire voir nettement cette impossibilité, que bien des esprits ont de la peine à admettre, nous n'avons qu'à examiner rapidement les divers procédés de préparation qui ont été mis en œuvre. Tous ces procédés reposent sur une propriété commune à toutes les diastases : elles se fixent comme une teinture sur les particules en suspension dans les liquides diastasifëres, et sont entraînées par les précipités qu'on produit au sein de ces liquides, surtout lorsque ces précipités sont très finement divisés et amorphes. C'est ainsi que MM. Wurtz et Bouchut ont observé que la fibrine, mise en suspension dans une solution de papaïne et lavée ensuite à Teau, se digère elle-même dans de l'eau acidulée, en abandonnant dé la papaïne à cette eau (2). La seule chose qui varie d'une méthode de préparation à l'autre, c'est le procédé employé pour produire le précipité qui entraîne la diastase. La méthode la plus ancienne et la plus répandue consiste à traiterle liquide diaslasifère par un .excès d'alcool; employé par Payen pour la préparation de l'amylase et de la pepsine, par M. Berlhelot pour la sucrase (1), par MM. Wurtz et Boiichut pour la papaïne, tout récemment par MM. O'Sullivan et Tompsoh pour la sucrase (12), l'alcool a servi à M. Dubrunfaut à purifier l'amylase ou diastase du malt, et a été appliqué par d'autres savants à la purification d'un grand nombre de diastases. En précipitant l'extrait de malt par son volume d'alcool à 90^ M. Dubrunfaut a obtenu un précipité très azoté et peu actif; une seconde précipitation par un nouveau volume d'alcool à 90° fournit la majeure partie de l'amylase. On élimine ainsi, en grande partie, les matières azotées qui accompagnent la diastase ; mâjs ce procédé de précipitations successives par l'alcool, qui a réussi pour l'amylase et peut fort bien ne donner que des résultats médiqçrés avec d'autres diastases, a en putreleg^rave

inconvénient de faire perdre une grande quantité de matière active, même lorsqu'on a la précaution de ne laisser là diastase précipitée que très peu de temps en contact avec l'alcool; c'est là un fait qui a été surtout constaté par M. Duclaux (4) à propos de la présure. Séchées avec précaution à température basse et dans le vide, les diastases ainsi précipitées par Talcool se conservent beaucoup mieux qu^en solution; leur conservation est également facilitée par l'emploi du procédé appliqué par Von Wittich (5) à la préparation de la pepsine, procédé dont Claude Bernard (6) s'est servi pour extraire Tamylase du foie, et qui consiste à dissoudre la diastase dans la glycérine ; on isole facilernent la diastase de la solution ainsi obtenue en la précipitant par Talcool.

Dans les autres méthodes de préparation, on enlève la diastase au précipité qui l'a entraînée avec lui en traitant ce précipité par l'eau, ou bien on traite le précipité par un dissolvant convenable qui laisse la diastase à l'état insoluble. Telle est la méthode de Wassmann, qui consiste à traiter la liqueur par l'acétate de plomb ; celle de Cohnheim, qui acidifie la liqueur par l'acide phosphorique et précipite ensuite cet acide par l'eau de chaux à l'état de phosphate tribasique de chaux ; celle employée pour la pepsine par Briicke (7), qui agite la liqueur avec une solution éthéro-alcoolique de cholestérine, et redissout ensuite la cholestérine dans Téther; celle de Danilewski (8), qui obtient le même résultat par l'emploi du collodion.

En somme, quel que soit le procédé employé, on voit que la diastase obtenue est toujours mélangée d'une quantité plus ou moins notable de matière étrangère dont on ne peut l'extraire, parce que la formation du précipité qui entraîne la diastase exige la présence d'une substance précipitable autre que la diastase elle-même ; et comme on ne peut pas savoir, dans la série des traitements successifs, à quel moment cette matière étrangère est éliminée, il est clair qu'on ne peut que se rapprocher plus ou moins de l'état de pureté absolue sans être jamais sûr de l'atteindre. D'ailleurs, pendant ces traitements successifs, la diastase se détruit en proportion de plus en plus grande : il semble que sa fragilité va en augmentant à mesure qu'elle se purifie, fait que MM. O'SuUivan et Tompson viennent de constater une fois de plus pour la sucrase. »

De ces constatations diverses résulte une première incertitude sur ridentité parfaite des substances obtenues dans diverses préparations, conduites en apparence exactement de la même manière, identité sur laquelle on demanderait vainement à l'analyse chimique de nous fournir des renseignements. C'est ainsi qu'on trouve dans la science les chiffres les plus variables pour la composition centésimale des diastases, de telle sorte qu'on est conduit à conclure avec Ad. Mayer (10) que les diastases se rapprochent beaucoup des matières albuminoïdes, mais que rien n'indique jusqu'ici qu'on doive les considérer comme des combinaisons chimiques nettement définies.

Les diastases ne pouvant être séparées à l'état de pureté des liquides qui les renferment, et cette séparation ne pouvant d'ailleurs se faire qu'avec une perte très notable de la matière active, on est conduit à employer, pour apprécier leur quantité une méthode de mesure détournée, fondée sur la détermination de la quantité de matière qu'elles sont capables de transformer. Si l'on appelle g la quantité de matière transformée, d la quantité de diastase employée pour opérer cette transformation et t le temps nécessaire pour la produire, on peut représenter l'action de la diastase pour la formule générale

dans laquelle A représente une constante que nous aurons à examiner tout à l'heure. Cette formule résume celles des propriétés générales des diastases qui sont les mieux connues; elle montre que toutes choses égales d'ailleurs, la quantité de matière transformée est proportionnelle au temps pendant lequel la diastase a agi, ou, pour un même temps, à la quantité de diastase employée. Les quantités de diastase employées pour transformer une même quantité de matière sont donc inversement proportionnelles aux temps pendant lesquels elles agissent.

Si en pratique l'action des diastases était aussi simple que l'indique la formule, leur mesure serait chose facile au moins pour quelques-unes d'entre elles : il suffirait d'avoir à sa disposition un procédé de dosage précis de la matière transformée. Mais les choses sont loin de se passer avec cette simplicité. Tout d'abord la formule n'est exacte que lorsque d ou t varient entre

certaines limites. Pour la présure en particulier, ces li assez étendues; mais lorsque la quantité de prési décroissant beaucoup, le temps nécessaire à la coagul mente beaucoup plus, et inversement, lorsqu'on augD quantité, le temps diminue beaucoup moins que ne Y la formule. Pour la sucrase, les limites entre lesquelL vérifie sont plus rapprochées, sans doute parce que de matière transformée, le sucre interverti, est plu apprécier avec précision que pour la présure dont Tai traduit que par le phénomène grossier de la coagulati d'ailleurs, remarquer que le produit de l'action de la p paraît du liquide où elle agit sous la forme insoluble le sucre interverti parla sucrase s'y accumule peu à pi là une circonstance qui restreint notablement les lir lesquelles la proportionnalité de l'action au temps M. Duclaux a reconnu, en effet, que les quantités de s verti par une même dose de sucrase ne sont proporti la durée de l'action qu'autant que la quantité de sucre ne s'élève pas à plus d'un huitième du sucre total prés gine. A partir du moment où la quantité de sucre atteint cette dose, l'interversion va en se ralentissant plus. L'expérience montre nettement que c'est bien li de la matière transformée qui produit ce retard; j comme on le verra dans la suite de ce travail, à moni a de ce retard une autre cause importante, l'oxyde diastase, dont j'aurai à parler tout à l'heure *.

1. Toute la première partie de câ travail a paru en, trois mémoi dans les Annales de T Institut Pasteur, en 1889 et janvier 1890. MM. Tompson, qui ont publié tout récemment un mémoire sur Vinvertase la levure (octobre 1890), ne semblent avoir eu connaissance ni de cei ni des faits que M. Duclaux a exposés relativement à la sucrase da biologie, en 1883. Ils annoncent entre autres, que la présence du su n'a aucune influence sur la marche de l'interversion. 11 me semble qu pas toujours mis en garde contre l'oxydabilite' de la sucrase, bien q de leurs expériences d'interversion aient été faites en présence d'acid qui empêchent l'oxydation. Je trouve chez ces auteurs une confirmai des faits que j'ai mis en lumière, et que je reproduis dans ce travail, à l'influence de doses faibles d'acide sur l'interversion. Mais je dois f réserves pour l'emploi de l'acide sulfurique, le seul dont lisaient étud La dose de cet acide qui favorise le plus l'interversion est, en ef faible, qu'il est difficile do la déterminer avec précision; et d'aill< ployant, comme ils l'ont fait, une sucrase qui renferme une proportii matières minérales, on ne peut pas être sûr d'opérer en présence de l'acide ajouté et en présence de cet acide seul. (Voir à ce sujet les m'ont déterminé à employer l'acide acétique, p. 21 et 34.)

La proportionnalité aux quantités et au temps qui n'existe qu'entre certaines limites, ne se manifeste d'ailleurs qu'aune certaine température. Cette température est variable d'une diastase à l'autre, mais pour une même diastase elle est, ou du moins paraît nettement déterminée. Si, en effet, on étudie les quantités de matière qu'unemême dose de liquide diastasifère est capable de transformer dans le même temps à différentes températures, on voit que ces quantités vont d'abord en croissant jusqu'à un maximum, correspondant à une certaine température, puis en décroissant. Cette température optimum est située pour la présure à 4i<^; pour la sucrase au voisinage de 56*^; pour la pepsine, vers 30®. L'amylase seule présente une anomalie curieuse : la vitesse de transformation de l'amidon par cette diastase présente bien un optimum, situé à 70® environ, mais à cette température les proportions de maltose et de dextrine formés ne sont pas les mêmes qu'aux températures inférieures, et d'une manière générale le rapport du maltose à la dextrine va en diminuant à mesure que la température s'élève.

Cette considération de la température nous ramène à l'examen de la constante A dans notre formule. Le terme A comprend en effet cette condition de température optimum, mais en dehors de cette condition, il en renferme implicitement un certain nombre d'autres, fort mal définies, dont quelquesunes ont été vaguement entrevues et dont les autres nous sont totalement inconnues. Les réactions mutuelles de ces conditions diverses, intimement liées les unes aux autres, mettent l'action d'une diastase sous la dépendance si directe d'influences considérées jusqu'ici comme négligeables, que les faits qui paraissaient le plus solidement établis semblent sujets à caution. Ce qui prouve bien que des conditions plus délicates que celles dont j'ai parlé jusqu'ici, et dont nous sommes maîtres dans une certaine mesure, entrent en jeu dans le phénomène, c'est la discordance des résultats relatifs à l'optimum de température pour les diverses diastases. C'est ainsi que M. Kjeldahl (9) et M. Duclaux ont observé que la température optimum pour l'invertine ou sucrase est située à S6® environ, tandis que Ad. Mayer indique une température beaucoup moins élevée, et, de plus, variable d'une série d'expériences à l'autre. Le même auteur, étudiant la température de destruction des

diastases, trouve également des chiffres variables, inférieurs en général à ceux qui ont été indiqués par d'autres; il rapporte, il est vrai, fort justement, mais sans preuve expérimentale directe, la discordance de ces résultats à la présence de matières étrangères. Notons en passant un fait intéressant signalé par Ad. Mayer, et dont on ne trouve l'indication que chez lui : les diastases qui sont détruites à des températures bien inférieures à 100° lorsqu'on chauffe leurs solutions, résistent au contraire à 100** et même à des températures légèrement supérieures lorsqu'on les chauffe à l'état sec. C'est là une constatation importante, qui établit un point de rapprochement de plus entre les diastases et les microbes, avec lesquels elles partageaient déjà un grand nombre de propriétés. Cette observation est d'ailleurs d'accord avec la pratique du touraillage du malt, opération dans laquelle le grain d'orge et la diastase qu'il renferme sont portés quelquefois à des températures de 120 et 125°, sans que l'amylase disparaisse totalement, comme l'a montré récemment M. Kayser (il). Mais ce résultat ne peut être atteint que si le malt a été chauffé très lentement et à température basse jusqu'au moment où il est parfaitement sec.

Il semble donc, en voyant les résultats contradictoires que j'ai mentionnés tout à l'heure, qu'il faille les imputer à l'intervention d'influences méconnues jusqu'ici. Il y a d'abord une cause d'erreur qui joue un rôle considérable dans les phénomènes auxquels les diastases donnent lieu : c'est l'intervention des microbes, qui peut devenir très active dans des expériences prolongées au delà de quelques heures, et contre laquelle on ne s'est pas toujours mis en garde. Quelques auteurs Tout bien soupçonnée, mais ne se sont pas rendu un compte exact de son importance. Ainsi, MM. Wurtz et Bouchut, dans leurs e;tpériences de digestion de fibrine par la papaïne, constatent bien que l'exactitude de certains de leurs résultats est infirmée par la présence de microbes de la putréfaction révélant leur présence par l'odeur des gaz dégagés; mais il est certain que l'influence de leur intervention avait dû se faire sentir bien avant que l'odeur la révélât, et c'est peut-être là une des raisons qui^ en faisant de la papaïne une diastase qui agit aussi bien en milieu alcalin qu'en milieu acide, nous la montrent comme une exception unique, occupant une place à part dans le monde des diastases.

M. Duclaux a montré dans sa Microbiologie ce qu'il faut faire pour se soustraire à celte grave cause d'erreur et a recommandé l'emploi des filtres en porcelaine pour obtenir un liquide diaslasifère qui soit sûrement débarrassé de microbes. C'est là une méthode précieuse qui rend de grands services pour la stérilisation des liquides; mais, avant de l'appliquer à l'étude d'une diastase il faut s'assurer que cette diastase n'est pas retenue par le filtre, et préciser les conditions dans lesquelles elle le traverse. Je montrerai, en effet, que parmi lessucrases de diverses origines, il y en a que le filtre retient intégralement ou partiellement, et d'autres qui le traversent en totalité, même lorsqu'on opère dans des conditions comparables. A défaut de celle méthode de filtration, on pourra s'opposer à Tenvahissement des microbes par l'addition d'un antiseptique, pourvu qu'on se soit tout d'abord assuré que cet antiseptique, à la dose qu'on emploie, est sans influence sur l'action de la diastase elle-même. M. Muntz a depuis longtemps montré que le chloroforme n'entrave nullement l'action des diastases, à des doses où il empêche toute manifestation de la vie (3). Il sera également possible dans certaines circonstances, et ce sera là un procédé préférable à tous, d'obtenir directement un liquide diastasifère absolument stérile.

Cette influence de l'intervention des microbes étant mise de côté, parce que son rôle dans tous les phénomènes de la chimie biologique a été assez nettement mis en lumière pour qu'elle n'échappe plus à un observateur consciencieux, nous pouvons passer à l'examen des autres causes d'erreur beaucoup plus importantes au point de vue où. nous nous sommes placés. M. Duclaux a montré l'influence que des quantités minimes de différents sels peuvent avoir sur Taction de la présure et de la sucrase ; M. Petit a fait la même élude pour la pepsine. Ces influences sontaccélératricespourcertainssels et retardatrices pour d'aulres; mais il arrive que pour un même selles doses faibles favorisent l'action et les doses fortes l'entravent, ou inversement. Le rôle de l'acidité ou de l'alcalinité est encore plus important à considérer et cependant il n'a été examiné de très près que pour quelques diastases. On sait que l'acidité du milieu favorise et l'alcalinité retarde l'action de la présure, de la sucrase, de l'amylase, de la pepsine ; que la pancréatine agit mieux, au contraire, en milieu alcalin qu'en milieu acide ; que la papaïne est, comme je

rai dit plus haut et avec les réserves que j'ai faites, indifférente à la réaction du liquide. De plus, les recherches de M. Kjeldahl sur rinvertiue et sur l'amylase ont montré que la dose d'acide la plus favorable est toujours très faible et que, lorsqu'on dépasse cette dose, Tacide a pour effet de retarder l'action de la diastase. M. Duclaux a vu, d'autre part, que l'action de la sucrase varie peu pour des doses variables de divers acides, et que l'action spécifique de l'acide disparaît derrière le caractère prédominant de l'acidité. On voit bien par là que le rôle de la réaction du milieu, bien qu'il n'ait pas été méconnu, n'a pas été examiné avec la précision qu'il comportait. C'est là, en effet, comme je le montrerai dans les pages qui suivent, l'une des causes les plus importantes d'incertitude qu'on puisse rencontrer dans l'action d'une diastase, et l'on conçoit aisément que cette circonstance ait pu passer presque inaperçue, parce que c'est au voisinage de la neutralité, c'est-à-dire précisément au point oîi les réactifs précis font le plus défaut, que l'influence des acides ou des bases est la plus notable.

Les quelques indications qui précèdent font voir comment l'action d'une diastase va en se compliquant de plus en plus à mesure qu'on saisit mieux les causes dont elle dépend. J'ai dit plus haut que toutes ces influences avaient entre elles des relations étroites qui font qu'elles réagissent les unes sur les autres; nous allons voir ces réactions mutuelles entrer en jeu en examinant une nouvelle cause d'incertitude qui tient à la fragilité même des diastases. Leur instabilité est un fait reconnu par tous les expérimentateurs; j'ai indiqué plus haut les contradictions qu'on trouve dans la science au sujet de la résistance à la chaleur; mais les phénomènes qui président à la destruction de ces corps n'ont fait l'objet d'aucune remarque spéciale. M. Duclaux seul a montré, en prenant pour exemple la présure et la sucrase, avec quelle facilité ces substances s'oxydent et combien l'action de la lumière favorise cette oxydation. Les conditions qui peuvent favoriser ou retarder cette oxydation à l'obscurité ou à la lumière restent cependant inconnues, cor l'action de la lumière est, contrairement aux expériences de M. Duclaux, considérée par Ad. Mayer comme nulle pour toutes les diastases sauf la présure. C'est là une lacune importante dans nos connaissances; des renseignements sur les circonstances qui peuvent rendre

celte oxydation des diastases difficile ou impossible sont cèpên-j' dant indispensables, car tout essai dans lequel l'expérimentateur ne sait rien sur Tabsencé ou la présence de cette cause de des^ truction devient par là même sujet à caution. Je me suis occupé d'élucider avec soin, dans le travail qui suit, ce point obscur et c'est en l'examinant que j'ai vu les relations étroites qui lient l'oxydabilité à la réaction du milieu, réaction qui influe ellemême sur l'activité de la diastase. Ainsi pour la sucrase, les bases ont une influence retardatrice non seulement à cause de la réaction qu'elles amènent dans la liqueur, mais encore parce que cette réaction facilite singulièrement la destruction de la diastase.

En insistant sur ces diverses causes d'incertitude, qui nécessitent, comme je le disais en commençant, une sorte de révision de nos connaissances sur les diastases, je ne crois pas èependant les avoir énumérées toutes. En comparant la grandeur des effets observés dans certains cas à la petitesse des causes, nous sommes forcément conduit à celte conclusion que l'action des diastases doit être encore soumise à des influences perturbatrices insaisissables, et que toutes les expériences qu'on pourra faire sur ces corps ne seront jamais soustraites d'une manière absolue à ces causes de perturbation. Mais les exemples que j'ai cités suffisent pour mettre notre prudence en éveil, en nous faisant prévoir les difficultés qu'on rencontrerait dans la revision dont je viens de parler; nous n'aurons chance d'atteindre notre but qu'en proportionnant la sensibilité de nos moyens d'investigation à la délicatesse des phénomènes que nous voulons étudier.