TÉMOIGNAGE DE VIVE RECONNAISSANCE ET DE RESPECTUEUSE AFFECTION

Introduction.

Les travaux auxquels a donné lieu Fembryogénie des Poissons osseux sont déjà tellement nombreux, qu'il paraîtra peutêtre superflu de faire de nouvelles recherches sur ce sujet, et surtout de prendre comme objet d'étude, la Truite, l'un des Poissons dont le développement a été le plus souvent suivi. Si Ton examine cependant avec soin les mémoires publiés jusqu'à ce jour sur la question, on est frappé du désaccord qui existe entre les auteurs sur des points qui ont une très grande importance, non seulement en ce qui concerne le développement particulier des Poissons, mais encore au point de vue de rembryogénie générale; telles sont, par exemple, l'origine des feuillets blastodermiqucs, la formation du système nerveux, du cœur, du sang, etc.

Depuis les travaux de Vogt (l9l) et de Lereboullet (112), qui, bien que déjà anciens, peuvent.ôtre encore consultés avec fruit pour les stades avancés, l'important mémoire d'CEllacher (l23) était à peu près le seul, en 1880, lorsque je commençai mes recherches, que nous avions sur le développement des Salmonidés. J'ai donc cru, à cette époque, qu'il serait utile de reprendre à nouveau l'étude de l'embryogénie de la Truite, à l'aide des procédés que la technique moderne mettait à ma disposition. Depuis lors, il est vrai, ont paru les observations de C. K. Hoffmann (89), Ziegler (200) etGoronowitsch(57), mais los résultats obtenus par ces auteurs concordant pou entre eux et ditlérant sur plusieurs i)oint'S do ceux auxquels j'étais déjà

arrivé, loin de me décourager, m'engagèrent à poursuivre mon étude.

La facilité que j'avais de me procurer des œufs de Truite à tous les états de développement dans les aquariums établis par Coste, au Collège de France, m'a déterminé à choisir cette espèce de Poisson, comme objet de mes recherches. J'ai fait également quelques observations sur l'Èpinoche et la Perche.

J'avais primitivement l'intention de suivre d'une manière complète le développement de la Truite, depuis la fécondation de Toeuf jusqu'à Téclosion; mais, outre que les stades avancés, déjà bien décrits par Vogt et Lereboullet, ne présentent pas un très grand intérêt au point de vue embryogénique, je n'ai pas tardé à reconnaître que leur étude, faite avec autant de détails que le comporte celle des premiers stades, exigeait un travail de longue haleine, et pouvait donner lieu à plusieurs mémoires distincts. Bien que possédant des préparations nombreuses relatives à tous les stades du développement de la Truite, j'ai donc dû limiter mes recherches aux premières phases de ce développement. Je me suis arrêté dans ce travail au moment oii le blastoderme a recouvert la totahté du vitellus. Ce stade caractéristique est très important pour la Truite, car il correspond à la formation des organes les plus essentiels du système nerveux central, des yeux, des vésicules auditives, des premières fentes branchiales, de l'intestin, du canal de Wolff et du cœur.

Ce travail, commencé en 1880, n'a pu, par suite de circonstances indépendantes de ma volonté, être publié plus tôt, mais j'en ai déjà indiqué les principaux résultats dans des communications préalables faites à l'Académie des sciences, à la Société de Biologie, et à la Société philomatliique (67 à 76).

L'époque de la reproduction pour les Truites du Collège de France commence dans les premiers jours de novembre ; ces animaux, élevés en captivité depuis plusieurs générations, semblent avoir perdu l'instinct défrayer; abandonnées àelleSmèraes, les femelles ne se débarrassent pas de leurs œufs, qui restent dans la cavité abdominale, sont en partie résorbés ou finissent pour amener la mort de l'animal. Aussi chaque année, du mois de novembre à la fin de janvier, on pratique la fécondation artificielle des œufs, en suivant les règles établies

par Coste dans ses Instructions pratiques sur la pisciculture. Depuis plusieurs années on emploie cependant de préférence la méthode russe qui donne un peu plus grand nombre d'œufs fécondés que la méthode indiquée par Coste. La méthode russe consiste, comme on sait, à recevoir les œufs à sec dans un récipient, à faire tomber dessus une certaine quantité de laitance et à ajouter ensuite de l'eau pour opérer la fécondation.

La durée de l'incubation est très variable et dépend de la température ; elle peut varier de 35 à 100 jours. Cette différence considérable dans la durée de l'incubation ne permet pas de désigner l'âge d'un œuf ou d'un embryon, comme on le fait par exemple pour le Poulet, par le nombre d'heures ou de jours qui le sépare de la ponte. Un œuf pondu depuis vingt jours peut renfermer un embryon dont le développement ne sera pas plus avancé que celui d'un embryon contenu dans un autre œuf ayant seulement huit jours d'incubation. C'est pour cette raison que, dans mon travail, je n'indiquerai pas l'âge des embryons ; à l'exemple de Balfour, j'ai établi un certain nombre de stades artificiels, correspondant à des périodes déterminées du développement et caractérisées, soit par une modification dans la forme extérieure, soit par l'apparition d'un nouvel organe. Cette méthode est la seule qui permette de rendre comparables les travaux faits, par des auteurs différents, sur le développement d'un animal dont la durée de l'évolution em* bryonnaire varie avec les circonstances extérieures.

Ce n'est qu'après de longs tâtonnements et après avoir sacrifié un assez grand nombre d'œufs que je suis parvenu à trouver des modes de préparation de l'embryon permettant d'obtenir de bonnes coupes, et n'altérant pas les éléments his»^ tologiques. J'insisterai un peu longuement sur les méthodes que j"ai employées, parce qu'en embryologie, plus peut-ôtre qu'en toute autre scrence biologique, la technique joue un rôle des plus importants. Je montrerai par la suite que beaucoup des divergences d'opinions qui existent entre les auteurs peuvent s'expliquer facilement en tenant compte des procédés qu'ils ont employés pour fixer et durcir l'embryon.

Au début de mes recherches, je plaçais les œufs dans une solution d'acide chromique àj^ et je les y laissais pendantquelques jours. La forme extérieure de lembryon était assez bien

4 RECHERCnES SUR LE DEVELOPPEMENT

conservée, du moins pour les premiers stades du développement, mais les cellules étaient déformées et j'ai dû rejeter la plupart des préparations obtenues par ce mode de durcissement. Pour les stades plus avancés, lorsque Tembryon est déjà formé, l'acide chromique amène des déformations considérables de l'embryon qui se trouve comprimé entre la coque inextensible de l'œuf et la masse vitelline solidifiée.

Le procédé suivant m'a donné de meilleurs résultats. Les œufs étaient mis pendant quelques minutes dans de l'eau fortement acidulée par de l'acide acétique, jusqu'à ce que l'embryon devint bien visible, puis dans une solution d'acide chromique à-jlij-- Au bout de trois jours, les œufs étaient retirés de l'acide chromique et j'enlevais leur chorion au moyen de petites pinces fines, en ayant soin d'attaquer Je chorion du côté opposé à l'embryon. Après un séjour de vingt-quatre heures dans l'eau, les œufs étaient mis dans l'alcool à 90°, puis dans l'alcool absolu; les embryons ainsi préparés ne sont pas déformés et leurs éléments histologiques sont beaucoup plus nets qu'avec l'acide chromique seul.

Le durcissement de l'embryon m situ, reposant sur le vitellus et recouvert par la capsule de l'œuf, présente des inconvénients. La masse vitdline dans l'acide chromique acquiert une dureté beaucoup plus grande que celles des tissus embryonnaires, et devient très cassante; il est alors très difficile de pratiquer des coupes à travers la masse totale de l'œuf.

J'ai trouvé deux procédés qui permettent d'extraire des œufs les germes et les embryons avec la plus grande facilité et sans leur faire subir la moindre altération. Le premier consiste à placer l'œuf, pendant quelques minutes, dans une solution d'acide osmique à -^^^ jusqu'à ce qu'il ait acquis une couleur brune claire, puis dans un petit vase renfermant de la liqueur de Millier. On ouvre l'œuf dans ce liquide avec une paire de ciseaux fins. Le vitellus, qui se coagule immédiatement au contact de l'eau, se dissout au contraire dans le liquide de Millier, tandis que la couche corticale et le germe fixés par l'acide osmique peuvent être extraits de la capsule de l'œuf. On laisse le germe ou l'embryon pendant quelques jours dans la liqueur de Millier, puis, après l'avoir lavé soigneusement pour enlever le bichromate de potasse, on le passe par des alcools de plus en plus forts. Ce

procédé, qui réiissiL très bien pour les preuiiers stades du dcvoloppenienl, n'esl pas aussi bon lorsque l'embryon est assez avancé : dans ce cas, en effet, l'acide osmiquc ne le pénètre pas suffisamment. Sa surface seule est bien fixée. L'acide osmique est excellent pour bien mettre en évidence la réflexion des bords du blastoderme et les limites de chaque feuillet.

Le second procédé est celui qui donne les meilleurs résultats et que j'ai presque constamment employé. L'œuf est plongé pendant une dizaine de minutes dans le liquide de Kleinenberg additionné de 10 pour 100 d'acide acétique cristallisable. Puis il est ouvert dans de l'eau renfermant 10 pour 100 d'acide acétique, liquide dans lequel le vitellus est soluble, et on extrait l'embryon. Celui-ci est mis ensuite pendant quelques heures dans le liquide de Kleinenberg pur, puis dans l'alcool à GO*', -75°, 90° et finalement dans l'alcool absolu. Cette méthode conserve aux éléments toute leur intégrité, elle n'amène aucune altération dans la forme de l'embryon. Dans toutes mes préparations j'ai trouvé toutes les figures cytodiérétiques intactes, tandis qu'avec les autres procédés elles sont laplupart du temps -altérées.

L'embryon durci et déshydraté par l'alcool absolu est inclus dans le collodion ou dans la paraffine, d'après les méthodes ordinaires, et coupé soit avec le microtome de Jung, soit avec le microtome à bascule de Cambridge. L'embryon peut être coloré en masse, avant l'inclusion, soit par le carmin borate alcoolique, soit par le carmin aluné acide, soit par l'hématoxyline. On obtient ainsi de très belles préparations en colorant les coupes, préalablement fixées au porte-objet, par les couleurs d'aniline, la safranine, ou le violet de gentiane par la méthode de Bizzozzero.

Pour l'étude des formes extérieures, les œufs durcis par l'acide chromique et dépouillés de leur capsule, sont ceux qui conviennent le mieux. J'ai fait également pour les différents stades des préparations de germes et d'embryons entiers, détachés avec soin du vitellus et montés dans le baume, après coloration au carmin. Ces préparations sont indispensables parce qu'elles montrent des détails qui échappent sur les coupes, et qui sont absolument invisibles lorsqu'on se contente d'examiner à la lumière directe les embryons durcis. J'ajouterai que

j'ai eu soin, pour chaque stade, de varier les modes de préparation de l'embryon, afin de contrôler les résultats obtenus par la méthode qui m'a paru la meilleure.