CHAPITRE V
Désamidation et désamination par d’autres moisissures
Ce chapitre a pour sujet l’examen de la question si les résultats obtenus au moyen de l’Aspergillus peuvent être étendus à d’autres moisissures. Ce n’est pas notre but d’inventorier systématiquement les différences qui vraisemblablement apparaîtront. Même un examen se limitant à la recherche de la meilleure méthode de culture pour nos moisissures exigerait certainement de nombreuses années. Nous n’avons qu’à renvoyer à l’exemple frappant, apporté par RENé Vallery-Radot *) où il décrit comment la culture de l’Aspergillus niger a pu constituer le chefd’œuvre de la vie scientifique de Raulin, élève aussi consciencieux que fidèle de Pasteur.
Nous avons donc fait un choix: on n’a étudié que l’influence des seuls facteurs: pH, sucre et appauvrissement. Une comparaison plus générale précède. Nous recueillons ensuite des données plus détaillées au sujet de chaque moisissure, prise à part.
§ 1. Comparaison des vitesses de réaction.
§ 2. Ascochyta pisi.
§ 3. Mucor racemosus.
§ 4. Fusarium conglutinans.
§ 5. Cylindrocarpon radicicola.
§ 6. Conclusions.
Décomposition d’asparagine par diverses moisissures pendant 4 à 6,5 heures. Pas d’appauvrissement. Le pH = 5,0. Les concentrations sont indiquées en millièmes de molécule-grammes d’azote par litre et les vitesses en millimolécule-grammes d’azote disparu par heure et par gramme de matière sèche.
Age de la pellicule (heures)
Dureé de la réaction (heures)
Poids de matière
sèche
| Azote aminé
Azoto amidé
Déb. Fin concentr..
Vi¬
tes¬
se
Déb. Fin
concentr.
Vi¬
tes¬
se
Aspergillus
Cylindrocarpon
Fusarium
Mucor
Ascochyta
*) La vie de Pasteur. Paris, Flammarion. 1900; p. 270 et suivantes.
§ 1. Comparaison des vitesses de réaction.
Nous partons ici encore du point de vue que la désamination et la désamidation se caractérisent le mieux par la vitesse initiale de la réaction. Comme base de comparaison, nous avons pris la vitesse de décomposition par heure et par gramme de matière «sèche pour une même concentration initiale (voir tableau 10).
Le tableau 10 montre une différence nette entre le comportement de diverses moisissures en ce qui concerne la désamination et la désamidation. Tous les agents examinés sont capables d’hydrolyser le radical amide de l'asparagine. L’Ascochyta le fait environ deux fois plus rapidement que l’Aspergillus et celui-ci à son tour deux fois plus rapidement que le Mucor et le Fusarium, mais dans une comparaison d’ensemble telle que la présente le tableau 10, il n’y a pas lieu d’attribuer une importance capitale à ces différences.
La constatation que les deux dernières moisissures laissent intact le radical amine est toutefois importante. Si une décomposition quelconque a eu lieu, l’activité en tout cas a été tellement faible, qu’une diminution éventuelle est demeurée cachée par une augmentation simultanée. Nous rappelons ici que le même cas s’est présenté pour l’Aspergillus, mais dans des circonstances entièrement différentes, à savoir en présence du sucre et à un pH > 7. La question se pose maintenant si l’on peut considérer l’inhibition de la désamination comme une qualité propre au Mucor et à l’Ascochyta.
Dans l’examen plus détaillé qui suit, nous nous bornons à des déterminations d’ammoniac et d’azote aminé; c’est que seule la désamination nous inspire de l’intérêt du moment qu’il a été établi par notre comparaison générale, que la désamidation n’offre pas de différences sensibles.
% 2. Ascochyta pisi .
Cette moisissure forme après 160 heures environ, une pellicule d’un seul tenant à couleur verte foncé. Son poids à sec n’a jamais dépassé les 140 milligrammes.
Cette pellicule est extrêmement sensible à l’appauvrissement, car après un séjour de 12 heures sur l’eau le pigment vert foncé a passé au brun jaunâtre. Wehlburg (1932) décrit le même phénomène qui s’est produit lentement et progressivement dans ses cultures, qui avaient été poursuivies beaucoup plus longtemps que les nôtres. Comme le changement de couleur peut se produire dans les 12 heures, il faut peut-être l’attribuer à la consommation des matières nutritives mobiles du mycélium.
Au moyen de ces pellicules appauvries et décolorées, nous avons pu constater une diminution de l’azote aminé (Tableau 11).
On ne peut pas conclure du tableau 11 que l’Ascochyta appauvrie pourrait, contrairement à la non-appauvrie être.capable de désaminer l’asparagine à une vitesse mesurable.
Certes, l’azote aminé diminue dans la solution, mais à cette
Diminution de l’azote aminé (en mg.) dans une solution d’asparagine a trois concentrations différentes, et augmentation de l’azote ammoniacal (en mg.). Volume total 37 cc; pH = 4,0; durée de l’essai 10 heures; appauvrissement des pellicules pendant 12 heures.
Poids de matière sèche
Azote aminé
Azote ammoniacal
Début
Fin
Dimi¬
nution
Début
Fin
Augmen¬
tation
diminution ne correspond pas une augmentation de l’ammoniac. L’augmentation de la perméabilité pour l’asparagine, comme suite de l’élévation de la concentration, constitue déjà une explication satisfaisante de la disparition d’amino-azote dans la solution.
Mais pour pouvoir conclure à une augmentation de la perméabilité, il faudrait établir que le changement de couleur par appauvrissement ne soit pas une manifestation pathologique du protoplasme en train de périr. Nous pouvons écarter cette dernière supposition eu égard 'aux chiffres se rapportant à l’ammoniac. Si le contenu des cellules en train de se décomposer était passé dans le liquide, on aurait dû trouver beaucoup plus d’ammoniac. Cet argument paraît d’autant plus probant lorsqu’on songe qu’une grande quantité d’ammoniac aurait aussi dû être libérée aux dépens du radical amide de l’asparagine. Car nous avons déjà constaté que l’Ascochyta non-appauvrie est tout à fait capable de produire une désamidation en milieu acide. La faible teneur en ammoniac démontre donc que l’azote de l’asparagine est resté intact dans le cas de l’Ascochyta appauvrie. Elle démontre en outre que les cellules sont restées intactes dans le milieu acide.
La teneur en ammoniac n’est pas seulement remarquablement faible, mais elle est aussi remarquablement constante, malgré les teneurs initiales différentes en asparagine. Elle ne peut être
constante que si l'ammoniac provient (Tune source commune et, ici également, nous admettons une décomposition par respiration de l'albumine, comme composante temporairement prédominante du métabolisme basal. Mais comme il se dégage peu d'ammoniac au cours du métabolisme basal, on doit admettre qu'au cours de ce métabolisme, d'autres matières, par exemple des graisses, sont oxydées ou bien, — au cas où il s’agit des mêmes substances que chez l'Aspergillus — que l'activité de cette moisissure est en général très faible. Dans le premier cas, l’Ascochyta est impropre à des essais ultérieurs, parce qu’une nouvelle complication se manifeste pour cette moisissure. Dans le deuxième cas, il est impropre à nos fins parce qu'un métabolisme basal faible traduit une activité faible à tout point de vue.
Il semble plus probable que cette dernière hypothèse soit fondée; le développement lent bien connu de l'Ascochyta cadre assez bien avec l'activité faible que nous avons présumée. A la
Action du Mucor racemosus sur l'acide aspartique à différentes concentrations, à un pH = 5,0; durée de l'essai 9 heures; pellicules appauvries pendant 12 heures.
Poids de matière sèche
. , . , (en mdlimolecule-
Azote amine .
grammes par litre)
Augmentation et diminution en mg. par flacon (37 cc) calculé sur le même poids de matière sèche
Teneur
initiale
Teneur
finale
Vitesse par heure
diminution de l’azote aminé
Augmentation de l’azote ammoniacal
suite de ces considérations, nous avons passé à l'examen du Mucor racemosus.
§ 3. Mucor racemosus .
Pour cette moisissure, on a examiné d'abord l’influence de la concentration du substrat en milieu acide (Tableau 12), Dans la partie droite du tableau 12, on trouve indiquées les quantitités absolues de l’azote aminé disparu et de l'azote ammoniacal formé. Il en ressort que, dans le cas du Mucor nous
devons tenir compte d’une véritable consommation de l’acide aminé, car on retrouve toujours l’azote aminé disparu à l’état d’ammoniac, augmenté d’un supplément variable.
Comment devons-nous interpréter le fait que la vitesse de réaction est égale pour quatre concentrations différentes?
Pour le Mucor doit entrer en jeu un facteur limitateur spécial, par l’action duquel la capacité maxima de consommation est dépassée, même à la concentration la plus faible.
A priori, il est possible que la manifestation de ce facteur limitateur soit déterminée génotypiquement pour le Mucor. Nous pouvons songer soit à une perméabilité très faible pour l’acide aspartique, soit aux processus de synthèse limitant la consommation de l’acide aminé (par exemple par la formation d’une quantité trop faible d’enzymes).
Il n’est pas vraisemblable que la perméabilité constitue le facteur limitateur car la concentration augmentant, la perméabilité augmente avec elle; or, les concentrations auxquelles nous travaillons, s’écartent si fortement l’xme de l’autre qu’un dépassement de la limite maxima, déjà à la concentration la plus basse, n’est guère probable.
Si les processus de synthèse sont d’une façon ou d’une autre le facteur limitateur, nous pourrons rechercher — en examinant la désamination dans des conditions variables du milieu — si la manifestation de ce facteur est fixée héréditairement. Si la vitesse de réaction reste encore constante, le Mucor ne peut pas nous servir dans notre examen, pour le même motif que chez l’Ascochyta: un niveau trop bas du métabolisme.
Mais ce que nous pouvons constater à propos du Mucor en ce qui concerne le métabolisme des hydrates de carbone, semble indiquer le contraire. Après une semaine, il reste encore, dans le cas de l’Ascochyta plus de 1 g. des 5 g. de sucre contenus dans le liquide nutritif; après la même période, il ne reste que 80 mg. dans le cas du Mucor. En tout cas, il y a donc là un métabolisme intense des hydrates de carbone.
En passant nous faisons remarquer que, de la grande quantité de sucre qui a passé par la cellule, très peu a été employé pour former du protoplasme (faible poids de matière sèche). Le Mucor gaspille donc en grande partie le sucre et n’utilise pas beaucoup de sucres pour sa croissance.
Des expériences préliminaires ont montré que le Mucor se développe mieux lorsqu’on ajoute de la craie au fond du flacon. Ceci fait d’abord monter le pH du liquide à 8,0 mais lorsque la -durée se prolonge, il peut se manifester un déplacement vers
l’acidité, vers pH = 6,0; mais l’essai sur l’amino-acide est de trop courte durée pour pouvoir faire descendre le pH au dessous de 7,0. Dans le milieu alcalin, les hydrates de carbone sont décomposés en passant par d’autres stades intermédiaires car tous les flacons avaient une odeur pénétrante d’acide butyrique.
Les mêmes expériences préliminaires ont montré que les pellicules non-appauvries étaient plus actives que les pellicules appauvries. Mais comme le sucre dans le mycélium agit favorablement sur la décomposition, il en est probablement de même, lorsque le sucre est présent dans le liquide extérieur. Ceci est confirmé par le tableau 13.
Influence du sucre sur la désamination à pH > 7; pellicules de moisissures non-appauvries.
Drée d e l'essai (heures)
Sucre
ajouté
Azote aminé |
Diminution et augmentation en mg. par flacon (37 ccj
Début
con-
centr.
Fin
con-
centr.
Vitesse
(par
heure)
Diminution
P azote aminé
Augmentation de l'azote ammoniacal
Ici également il se constate une désamination, car tout l’azote aminé disparu se retrouve à l’état d’ammoniac. Du tableau 13 nous tirons, au sujet de l’intensité du métabolisme des acides aminés, les deux conclusions suivantes:
1° Il se décompose par heure une quantité d’acide aminé deux fois plus grande que celle que nous avions constatée d ans l’essai en milieu acide (tableau 12). Ce résultat favorable est dû en partie à ce que les pellicules n’étaient pas appauvries et en partie à un effet favorable du milieu alcalin;
2° En présence du sucre, à un pH élevé et sans appauvrissement, il se décompose trois fois plus d’acide aminé par heure qu’en l’absence du sucre à pH bas et avec appauvrissement des pellicules.
Le résultat principal qui ressort de ce paragraphe est que, pour le Mucor, la décomposition se produit le mieux dans des conditions qui réalisent exactement lé contraire pour l’Aspex*» gillus niger. .
§ 4. Fusarium conglutinans var . callistephi .
Outre les données mentionnées au § 1, nous n’avons pas pu
obtenir avec cette moisissure des résultats constamment reproduisibles qui permettent de continuer notre étude. Van der Veen (1930) a constaté que le Fusarium prospère le mieux à pH = 6,0. Suivant le tableau 10 la comparaison de la désamidation et de la désamination de l'Aspergillus et du Fusarium ne présente dans ce milieu aucune différence essentielle, mais seules des différences graduelles. Mais après quelques mois lorsque nous voulûmes poursuivre l'essai avec le Fusarium, celui-ci ne sembla plus capable comme auparavant de décomposer 20%, mais 4% seulement et au maximum 9% de l'acide aminé. Les causes nous en paraissent obscures *)•
§ 5. Cylindrocarpon radicicola.
Cette moisissure est équivalente à l'Aspergillus niger en ce qui concerne toutes les propriétés soumises à l'examen. Elle se développe le mieux dans un milieu acide; l'appauvrissement exerce un effet faible sur l’activité dans ce milieu. La désamination débute toujours vigoureusement et s’accentue fortement en fonction de la concentration du substrat, comme le montre le graphique 10.
En l'absence du sucre, la production d'ammoniac correspond toujours à la désamination (voir graphique 10). Pour le Cylindrocarpon il y a, aux concentrations faibles, un excès d'ammoniac plus considérable que pour l'Aspergillus; mais lorsqu’ on élève la concentration, la quantité d’ammoniac se rapproche davantage de l'azote aminé total enlevé.
L’inhibition exercée par le sucre à un pH déterminé, a été également éxaminée: en milieu acide la désamination est entravée à peu près dans les mêmes proportions que pour l’Aspergillus. Si, à une concentration donnée de l’acide aminé, en l'absence du sucre, il y a décomposition de 27%, ce pourcentage s’abaisse à 17% par la présence du sucre. En présence du sucre la production d'ammoniac diminue de 50%, ce qui nous ramène à l'idée de la synthèse de l'albumine et de la croissance de cellules. La consommation des hydrates de carbone est moins active dans le cas du Cylindrocarpon que dans celui de l’Aspergillus, car après 240 heures il reste encore environ 1% de la solution de sucre, dans laquelle on a cultivé les pellicules, tandis qu’avec l'Aspergillus tout est généralement consommé après 100 heures environ. Les comparaisons faites ici entre l'Aspergillus et le Cylindro-
4 ) Le professeur Westerduk nous signale que l’activité du Fusarium diminue généralement lorsqu’on cultive cette moisissure toujours dans le 'même milieu nutritif. Cela semble avoir été le cas ici.
Graphique 10.
concentration (en mgr./37 cc)
Influence de la concentration de l’acide aspartique sur la quantité (en mg) décomposée en 5 heures. pH = 5,5. Les moisissures ont été appauvries pendant 12 heures.
carpon se rapportent à des pellicules dont le poids de matière sèche est à peu près égal (voir par exemple le tableau 10).
§ 6. Conclusions.
Le problème que nous avions laissé sans solution à la fin du chapitre précédent, nous l’abordons ici dans les termes suivants: quel est le rapport entre la consommation de l'acide aminé et celle des hydrates de carbone?
Cette question sera traitée expérimentalement avec plus de détails au chapitre VI. Mais avant d'aborder ces expériences, nous tenons à tirer du chapitre V certaines conclusions, nous permettant de déduire des indices et des arguments qui pourront servir de fil conducteur à l'examen expérimental plus appro-
fondi en ce qui concerne l’Aspergillus.
Pour la comparaison du métabolisme de l’Aspergillus et celui du Cylindrocarpon et du Mucor notre point de départ a été le suivant: le génotype de ces moisissures détermine le niveau de l’intensité du métabolisme des acides aminés, mais le milieu peut déterminer l’arrêt ou le déclenchement de la désamination. De ce dernier point de vue, les moisissures sont donc comparables.
Au sujet de l’influence du milieu, nous avons maintenant la donnée expérimentale suivante: le Cylindrocarpon réagit sur le sucre de la même façon que l’Aspergillus, tandis que la présence du sucre produit sur le Mucor l’effet contraire à celui qui se produit sur l’Aspergillus. De même le Mucor réagit sur une élévation du pH d’une manière qui est exactement l’opposé du comportement commun à l’Aspergillus et au Cylindrocarpon.
Lorsque, dans des conditions contraires, les même phénomènes se produisent, et lorsque dans des conditions égales il se produit des phénomènes opposés, on peut conclure que ces conditions ne régissent pas directement ni par elles-mêmes les phénomènes. Nous arrivons donc aux mêmes conclusions qu’au chapitre précédent, mais par une voie toute différente.
Nous pouvons même faire un pas plus en avant: l’Aspergillus est sensible à une combinaison déterminée du sucre et du pH et le Mucor ne l’est pas.
Appliquons maintenant à la combinaison elle-même, le raisonnement que nous avions appliqué au sucre et au pH en tant que les deux éléments de la combinaison. Car ici également, il est de nouveau question de conditions égales provoquant des phénomènes différents et vice versà. Ceci signifierait donc qu’une combinaison déterminée du milieu est décisive pour la désamination par l’Aspergillus, mais que cette combinaison ne décide pas directement, comme agent direct de la désamination.
En effet, si le pH n’intervient pas du fait seul de la présence d’un substrat assimilable, on suppose qu’il intervienne à un stade plus éloigné, dans une phase subséquent à la présence du substrat, c-à-d dans sa transformation même.
Deux possibilités se présentent:
1° le pH influence la décomposition de l’acide aminé par l’intermédiaire de la décomposition des hydrates de carbone;
2° le pH influence directement la décomposition de l’acide aminé. * - f
Quant à cette dernière hypothèse, nous savons déjà que pour l’Aspergillus, le pH n’empêche pas la désamination proprement dite. Dès lors le choix se limite entre une influence directe du
pH, soit sur la décomposition de la chaîne carbonique des acides aminés, soit sur la décomposition des sucres. Les deux hypothèses sont plausibles. On a constaté déjà plusieurs fois que, dans la décomposition des sucres, une modification de pH conduit la décomposition en la faisant passer par d’autres produits intermédiaires. Il pourrait se produire ainsi un corps qui arrête la dissociation de l’amino-acide. Il se pourrait aussi que le pH modifie les produits intermédiaires de la chaîne carbonique de l’amino-acide et engendre un produit qui, régulièrement, est déjà engendré à partir du sucre. Une accumulation éventuelle de ce produit aurait pour résultat que se trouve entravé ce mode de transformation, d’où résulte la libération de moins d’énergie; par suite de cette concurrence, la décomposition de l’acide aminé est supprimée. .
Pour aborder ce problème, il importe avant tout de savoir jusqu’ à quel point la molécule d’acide aspartique est dissociée par l’Aspergillus à des pH différents. C’est là le sujet du chapitre VI.
