CHAPITRE III
Désamidation et désamination par l'Aspergillus niger
§ 1. Remarques préliminaires relatives au mode opératoire.
Dans la vie et le développement de tout organisme on peut observer trois espèces principales de métabolisme: les transformations d'hydrates de carbone, de matières albuminoïdes et de matières grasses. Selon les moments, l'un ou l'autre de ces métabolismes, prédomine de beaucoup, mais ils se trouvent toujours ensemble dans des proportions variables de sorte qu’une représentation générale du métabolisme dans un vivant est toujours très complexe.
C'est pourquoi, avant de procéder à un examen quelconque du métabolisme, il est absolument nécessaire de simplifier par des modes opératoires la vie de l’organisme utilisé.
Comme première simplification, nous avons appliqué la méthode des „cultures substituées” qui a déjà été décrite à la page 641.
Pour tous les essais dont il est question dans le présent chapitre, la seule matière organique introduite dans la solution nutritive était l’amino-acide. Guidés par les travaux antérieurs, nous avons employé le plus souvent comme amino-acide l'asparagine et, dans quelques cas, l’acide aspartique, notamment lorsque ce dernier était plus indiqué.
Pour que la représentation du métabolisme de l'amino-acide puisse être simple, il ne suffit pas que l'asparagine soit la source unique du carbone et de l’azote dans le liquide nutritif extérieur „ Le mycélium — s’il est abondamment nourri — a à sa disposition de grandes réserves nutritives intérieures, qui contribuent peutêtre à compliquer les processus. C’est pourquoi nous avons toujours appauvri la pellicule de moisissure avant le commencement des essais. A cet effet, nous avons enlevé le liquide dans lequel la pellicule avait été cultivée et nous avons introduit environ 20 cc d’eau stérile sous cette pellicule. Dans ce qui suit, cette eau sera appelée „eau d'appauvrissement”. L'effet de l’appauvrissement sur le métabolisme des amino-acides est traité dans un paragraphe spécial.
Enfin, en ce qui concerne ce chapitre, nous sommes toujours partis du cas le plus simple de désamination et de désamidation: pour l’Aspergillus niger elle se produit en milieu acide (§ 2). Nous avons examiné ensuite comment divers facteurs tels que la concentration, le pH, l’âge, etc. influencent le métabolisme des amino-acides; nous avons essayé en même temps de nous représenter au point de vue de la physiologie de la cellule, les rela-
tions entre le métabolisme des acides aminés et d’autres fonctions vitales, telles que la respiration, la perméabilité, la croissance, etc. Dans tous ces essais, nous avons toujours veillé à ce que l’Aspergillus niger demeure, pendant toute la durée des expériences, dans le milieu acide qui, pour lui, est le milieu naturel (§§ 3 à 7).
C’est après avoir construit une représentation générale du métabolisme de l’Aspergillus qu’on est à même d’analyser le comportement de ce micro-organisme en milieu alcalin (§ 8). Enfin, dans un dernier paragraphe, nous discuterons les résultats; pour expliquer ces résultats nous serons amenés à formuler une hypothèse (§ 9). Le chapitre III sera donc divisé selon les paragraphes suivants:
§ 2. Décomposition de l’asparagine en milieu acide.
§ 3. Influence de la concentration du substrat sur la vitesse de décomposition.
§ 4. Influence de ,,1’appauvrissement” sur la décomposition.
§ 5. La vitesse de décomposition, en fonction de l’âge et du poids de matière sèche.
§ 6. Le métabolisme basal.
§ 7. Accumulation et consommation de l’asparagine dans la cellule.
§ 8. Décomposition de l’asparagine en milieu alcalin.
§ 9. Hypothèse de la „préférence” pour les sucres.
§ 2. Décomposition de Vasparagine en milieu acide .
On connaît la préférence marquée de l’Aspergillus pour un pH bas; d’ailleurs dans un substrat renfermant du sucre, il se charge toujours lui-même de l’acidification du milieu. Dans notre essai nous avons employé une solution d’asparagine avec un pH de 3,8. Dans ces circonstances, l’asparagine est facilement dissociée par l’Aspergillus. Tant que la teneur en asparagine varie de 40 à 20 millièmes de molécule-grammes par litre, la vitesse de décomposition dans le même volume est de 2 à 1,5 millièmes de molécule-grammes par heure. Le graphique la représente plus clairement le processus.
Après 36 heures l’expérience fut suspendue, parce que la quasi-totalité des substances nutritives avait disparu. D’après l’aspect extérieur, la pellicule était encore entièrement normale. Des taches sombres ne sont apparues sur la face inférieure de la pellicule qu’après 60 heures environ. Pendant les premières heures, la teneur en matières sèches diminue un peu, pour Tester constante pendant le reste de l’expérience (voir graphique
à Graphique 1.
lb). Tout ceci nous porte à croire que les processus vitaux n’ont pas été troublés par notre dispositif opératoire.
La désamidation et la désamination semblent marcher de pair. Pour les deux premières durées de 6 heures, elles sont respectivement de 41 et 30% et de 33 et 30% des valeurs initiales. Il est bien entendu qu’à cette transformation d’azote correspond une formation appréciable d’ammoniac. La quantité totale calculée d’après l’azote aminé et amidé qui ont disparu, est inférieure à celle qui a été constatée; le mycélium a donc aussi dégagé de l’ammoniac (voir plus loin § 6).
Puisque l’ammoniac ne peut pas s’échapper de la solution acide, le pH du liquide nutritif s’élève rapidement; il est donc nécessaire de rectifier le pH. Au cours de cette expérience on a effectué cette rectification trois fois par jour au moyen d’une solution de P0 4 H 3 (concentration N/10), grâce à quoi les variations sont restées réduites entre pH 3,8 et pH 5,8.
Nous signalons avec insistance la très courte durée de l’expérience, car le temps consacré aux expériences avec l’asparagine est généralement beaucoup plus long.
BLANCHETièRE a poursuivi ses cultures du Bactérium fluorescens de 40 à 83 jours, tandis que Iwanoff aussi bien que Schmalfusz et Mothes font continuer la culture de l’Aspergillus pendant deux semaines en moyenne.
Cet écart provient de notre application de la méthode des cultures substituées.
La grande vitesse de décomposition que nous constatons dans cet essai, est très importante pour notre étude. En effet, elle permet d’introduire dans les essais suivants la méthode des vitesses initiales, que l’on va décrire dans le prochain paragraphe.
§ 3. Influence de la concentration du substrat sur la vitesse de décomposition .
Nous avons vu que dans l’expérience, correspondant au graphique 1, l’Aspergillus se trouve placé dans un liquide dont la concentration varie successivement de la teneur initiale à zéro, à mesure que se poursuit la décomposition. La mesure de la vitesse que nous cherchons, ne peut donc pas se faire à concentration constante par ce mode opératoire. Non seulement la concentration varie, mais la pellicule elle-même passe par des états différents. En effet, à mesure que se prolonge son séjour sur l’asparagine, le nombre et l’influence des facteurs limitateurs augmentent, ce qui se manifeste sur le graphique par le fait que la tangente à la courbe tend vers l’horizontal. Pour pouvoir
vitesse de décomposition
mesurer la vitesse de décomposition à concentration constante, nous serons amenés à rendre constants d’une part la concentration, d’autre part les facteurs limitateurs.
On pourra considérer comme constante une concentration qui variera très peu au cours des essais. La condition sera réalisée si les essais sont très courts. Nous prendrons alors comme concentration à laquelle nous rapporterons la vitesse mesurée, la concentration initiale. Ceci revient à considérer la courbe comme une droite sur une petite partie de son parcours. Nous nous appuyons sur Haldane-Stern (p. 7): „Glücklicherweise bleibt in vielen Fâllen die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion über eine relativ lange Période hinweg konstant.”
D’autre part, les facteurs limitateurs, eux aussi, auront une variation négligeable pendant la très courte durée de nos essais
Graphique 2.
Rapport entre la vitesse de réaction et la concentration pour les pellicules appauvries. pH = 4,8; durée de l’essai: 4 heures.
Courbe A: les flacons d’essai ont été secoués pendant les expériences. Courbe B et C: les flacons d’essai n’ont pas été secoués.
A et C: azote aminé,
B: azote amidé,
La vitesse est exprimée en millièmes de molécule-grammes d’azote par litre par heure; la concentration en milligrammes par 37 ce.
(4 heures). En effet, toutes les pellicules à employer dans un essai, ont eu le même passé.
Si on veut appliquer cette méthode, on doit veiller à ce que le commencement de la réaction soit bien net, et ne présente ni retard ni mélange à d’autres réactions.
A cet effet nous avons pris deux précautions: application de la méthode d’appauvrissement (voir § 4), homogénéisation de la solution par des secousses répétées des flacons. Cette seconde recommandation vient de Fürth et Lieben (1922). Les flacons ont été agités à la main environ toutes les dix minutes. Le graphique 2 montre l’utilité des secousses. ' '
Les trois courbes de ce graphique montrent que la vitesse de réaction augmente avec la concentration. Dans les flacons agités (courbe A) la vitesse est plus grande, à même concentration, que dans les flacons non agités (courbes B et C). En outre, l’accroissement de la vitesse est, à concentration élevée, plus considérable pour les flacons secoués que pour les flacons nonsecoués.
On remarquera que la courbe A du graphique 2 estime droite. Ceci signifierait que la vitesse de réaction fût directement proportionnelle à la concentration. Ceci n'est pas exact car c’est fortuitement que la courbe est réduite à une droite. Lorsqu’on relève un plus grand nombre de points, il apparaît toujours une courbe.
Par cette même méthode des vitesses initiales, nous pourrons examiner différents facteurs qui jouent un rôle dans le métabolisme étudié. Souvent c’est la seule méthode correcte et c’est toujours la plus expéditive.
§ 4. Influence de „Vappauvrissement” sur la décomposition.
C’est d’une publication remarquable de Wieland et Claren (1932) que nous avons tiré la méthode de ,,1’appauvrissement” qui est d’application générale à notre étude.
L’importance de cette méthode, d’après ces auteurs, vient de ce qu’elle tient le milieu entre les études in vivo et in vitro.
Wieland et Claben partent de la constatation que des préparations macérées et des produits d’autolyse se sont montrés d’une grande utilité pour l’étude de certains processus .biochimiques, mais on pourrait citer cependant un certain nombre de réactions pour t lesquelles ces préparations sont à la fois trop peu actives et trop peu stables; Par contré, lorsque l’agent de réaction est un tissu vivant, il produit non seulement la réaction étudiée, mais en même temps des réactions dues aux . substances emmagasinées dans le protoplasme, ^ ^ •
Ces réactions secondaires contrarient et compliquent la réacr tion principale. Pour ce motif, Wieland laisse d’abord la levure digérer son contenu cellulaire, ensuite, avec cette levure appauvrie mais encore vivante, il obtient les réactions chimiques simples qu’il recherche. ‘
Dans le présent paragraphe, on étudiera l’activité de, pellicules appauvries à différents pH.
a) Activité en milieu acide de pellicules appauvries. "
Après que les pellicules de moisissures ont séjourné pendant 12 heures sur l’eau distillée, on les a placées pendant 4 heures sur une solution d’asparagine amenée à un pH de 4,5. Le résultat est indiqué dans le tableau 1: le signe 4* indique une augmentation de teneur en azote et le signe — une diminution. Les chiffres se rapportent à une même série de pellicules provenant du même ensemencement. Le poids de matière sèche a été déterminé sur deux pellicules de moisissure.
Caractéristique de la pellicule de moisissure
Age
de la pellicule de moisissure
Poids de la matière sèche en G.
Azote
ammoniacal
mg.
Azote
amidé
mg.
Azote
aminé
mg.
appauvrie
67 heures
non appauvrie
- 67 heures v
appauvrie
105 heures.
non appauvrie
118 heures
appauvrie
248 heures
non appauvrie
260 heures
D’après le tableau 1 on voit que dans le cas des pellicules plus âgées~ l'appauvrissement a légèrement majoré la production d’ammoniac; d’autre part, il semble que l’appauvrissement agisse d’une manière défavorable sur la désamidation et d’une manière favorable sur l’utilisation de l’azote aminé, mais l’influence est en tout cas très faible.
H est évident que les circonstances dans ce milieu acide sont tellement favorables à l’activité de la cellule que l’appauvrissement ou le gavage du mycélium n’a que peu ou pas de conséquences sur la vitesse de décomposition. On peut?,, en se basant sur ces chiffres, déclarer non fondée la crahité que' le séjour pendant 12 heures sur l’eau distillée serait nuisible à l’Aspefgillus. Il n’est pas sans intérêt ; de ; constater J que lès pellicules
appauvries ne réagissent pratiquement jamais avec une activité moindre vis-à-vis de l’asparagine que les non-appauvries. b) Activité de pellicules appauvries en milieu alcalin .
On a employé pour cet essai une solution d’asparagine à 0,4%. Au moyen de la lessive de soude cette solution a été amenée préalablement à un pH 7,6. Le pH n’a pas encore changé après deux heures, mais après six heures il s’est élevé au pH 8,0. Cette variation de pH est due à l’ammoniac qui se produit toujours
Graphique 3.
Influence de l’appauvrissement sur la décomposition en milieu alcalin (pH 7,6—8). Les lignes fortes renvoient aux pellicules appauvries; les lignes faibles aux pellicules non appauvries.
abondamment dans nos expériences.
On conclut du graphique 3 qu’en milieu alcalin l’appauvrissement influe favorablement sur l’activité des pellicules alors qu’en milieu acide le même appauvrissement ne cause qu’une variation négligeable dans la réaction.
La différence n’est pas considérable, mais elle est néanmoins réelle; il nous suffit ici de constater l’influence de l’appauvrissement. Nous serons amenés plus tard (voir § 8) à examiner la question de la valeur maxima de cette influence retardatrice qui se produit sur le métabolisme des acides aminés dans des pellicules non appauvries.
§ 5. La vitesse de décomposition en fonction de l’âge et du poids de matière sèche .
Nous avons déterminé le rapport entre l’âge et la vitesse de réaction, afin de connaître quel serait le moment le plus propice, pour suspendre la culture sur sucre et pour entreprendre l’expérience sur les acides aminés.
Du graphique 4a on conclut, que la vitesse de décomposition passe par un maximum. Le point optimum indique le moment le plus favorable pour suspendre la culture. Il s’ensuit que l’Aspergillus exerce une activité maxima sur l’asparagine dans des pellicules de 3 à 4 jours.
Du graphique 4b on conclut que pour des âges donnés, l’âge est fonction du poids de matière sèche. Or, la vitesse est fonction de l’âge.
Donc, le poids de matière sèche passe également par un optimum. C’est pourquoi on pourrait se faire guider dans le choix des pellicules par leur poids de matière sèche.
§ 6. Le métabolisme basal .
Au cours du premier essai de notre étude (voir graphique 1) nous avons retrouvé dans le liquide extérieur plus d’ammoniac que celui qui correspond à l’azote détaché de l’asparagine. Dans la suite de notre étude, nous avons constaté que c’est là le cas le plus fréquent pour les essais prolongés. Quelques fois néanmoins une partie de l’azote de la solution extérieure semblait rester dans la moisissure. Il en sera question au paragraphe suivant. Le présent paragraphe a trait uniquement au cas le plus fréquent où tout l’azote de l’asparagine se retrouve dans le liquide extérieur à l’état d’ammoniac, où il vient s’ajouter en plus de l’ammoniac provenant de la pellicule.
Le fait est singulier. Les pellicules appauvries sont dans tin
zzo
durée (en heures)
Activité de pellicules d’âges différents sur une solution de 0,5% d’asparagine; durée de l’essai: 4 heures; pH 4,7. Les pellicules ont été appauvries durant 12 heures.
Graphique 4 a.
Rapport entre l’âge et la vitesse de décomposition.
Graphique 4 b.
Rapport entre l’âge et le poids de matière sèche. La vitesse est exprimée en millièmes de molécule-grammes d’azote, décomposés par litre par heure.
état de sous-nutrition non seulement en carbone, mais aussi en azote. On leur administre de l'asparagine; on couvre ainsi autant que possible leur besoin de carbone. Tout en assimilant le car-
bone, la moisissure transforme l’azote de l’asparagine sous la forme la plus assimilable: l’ammoniac; mais c’est précisément l’ammoniac qui retourne alors à la solution. * *
Le fait que l’azote de l’asparagine reste inutilisé décèle un arrêt momentané de la synthèse de l’albumine.
Bien plus, la production d’un excès d’ammoniac trahit une prédominance momentanée de la consommation sur la formation d’albumine. En effet, la formation d’ammoniac supplémentaire décèle que l’albumine a été consommée, non par hydrolyse, mais par respiration.
Par ailleurs, dans des conditions bien déterminées, l’hydrolyse de l’albumine peut apparaître également. Celle-ci se manifeste par une augmentation de la teneur de la solution extérieure en amino-azote. C’est là une exception, mais néanmoins, elle se rencontre. , .
Comment interpréter ces phénomènes?
Tout d’abord nous insisterons sur le point que la prédominance de la dissociation sur la synthèse n’est que momentanée . Si on ajoute par exemple du sucre à la solution extérieure, l’ammoniac disparaît très rapidement, indice d’une régénération de l’albumine; en outre cette nutrition par le sucre amène très vite la pellicule appauvrie à doubler son poids de matière sèche, signe de prolifération et de croissance des cellules.
La prédominance que peut acquérir la consommation de l’albumine, soit par respiration, soit par hydrolyse, n’est donc que passagère, et ne trouble pas le dynamisme vital de la pellicule. On doit tenir compte aussi de ce que ces processus de respiration et d’hydrolyse ne sont pas spéciaux aux pellicules appauvries. L’appauvrissement les amène au premier plan et les fait mieux apparaître, mais pendant l’alimentation au sucre, ces processus existent également. Nous avons affaire simplement à des composantes, momentanément prédominantes, d’un échange fondamental de matières, entretenu par la moisissure au cours de son existence toute entière.
Cet échange fondamental qui, nous l’avons vu au paragraphe 1, comprend le métabolisme d’hydrates de carbones, d’albumines et de matières grasses, a été très bien étudié dans l’alimentation humaine et animale; on lui a appliqué l’expression consacrée de „métabolisme basal”. Nous avons pensé que mutatis mutandis, cette expression pouvait s’appliquer également aux végétaux. Notre méthode de travail par les pellicules appauvries nous amène nécessairement à rencontrer ce métabolisme basal. C’est précisément par la présence de ce métabolisme que nos études
diffèrent des études in vitro.
Tout d’abord, qu’entendons-nous par le métabolisme basal dans les moisissures?
Dans l’ensemble de la pellicule de moisissure il meurt continuellement du vieux mycélium et il se régénère sans cesse du nouveau. Dans chaque cellule vivante distincte, il y a toujours, côte à côte une dissociation et une synthèse d’albumine. Si les circonstances sont favorables (par exemple lorsque des matières nutritives organiques sont disponibles), la synthèse peut prévaloir sur la dissociation, tandis que dans le cas de la sousnutrition la dissociation prédomine. Par matières nutritives nous entendons non seulement celles de l’extérieur, mais aussi les réserves accumulées à l’intérieur du mycélium, par exemple le glycogène (voir Bennett-Clark et La Touche 1935).
Pour certains états des cellules, il y a presque équilibre entre dissociation et synthèse. Cet équilibre se produit lorsque aucune matière n’est absorbée de l’extérieur et que la provision intérieure des réserves est encore suffisante. S’il n’y a plus de matière disponible ni à l’extérieur ni à l’intérieur, l’équilibre ne peut plus exister, car le maintien de cet équilibre vital absorbe de l’énergie.
Cette énergie est précisément l’énergie minima qui suffit pour satisfaire aux besoins vitaux élémentaires du moment présent. Sous ces conditions, il ne se produit ni croissance ni alimentation par l’extérieur, ni fructification ni élévation appréciable de température, par contre il n’y a pas non plus de dépérissement. C’est ce minimum d’énergie nécessaire pour garantir la continuation de l’existence que représente le métabolisme basal.
Du fait que le métabolisme basal représente une énergie, on peut l’exprimer en calories. On peut aussi l’exprimer en consommation de matières” ou en absorption d’oxygène, parce que ces quantités déterminent aussi la combustion qui a lieu dans la cellule..
Le graphique 5 démontre comment le métabolisme basal, mesuré par l’absorption d’oxygène, décroît dans diverses pellicules d’une même série à mesure qu’elles vieillissent; et il indique également comment l’énergie minima décroît en fonction du temps, dans une pellicule déterminée.
Il importe de remarquer que ces courbes ont toutes un trajet très régulier et qu’il n’y a donc pas d’incidents brusques lors de la décroissance du métabolisme en fonction du temps. La diminution en fonction de l’âge a lieu, elle aussi, régulièrement. L’appauvrissement qu’avaient subi les pellicules avant l’essai,
durée en minutes
Absorption d’oxygène par des pellicules d’Aspergillus niger de 2 à 6 jours, au cours d’un séjour d’environ 24 heures sur de l’eau distillée; pH = 4,0. Pellicules préalablement appauvries pendant 12 heures. Température 25°.
était donc suffisant pour isoler le métabolisme basal, tout en étant assez modéré pour ne pas nuire à la vie.
Il est évident que le métabolisme basal n’est pas une grandeur constante; il peut varier par l’intervention d’un très grand nombre de facteurs tels que par exemple le pH, la température, la teneur en réserves nutritives et la durée de l’appauvrissement. Nous verrons au chapitre VI § 2, si le métabolisme basal est
modifié par l'alimentation. :
Dans nos recherches le métabolisme basal se manifeste par l’absorption d’oxygène et par une élimination de corps azotés. Nous avons rassemblé quelques données quantitatives au sujet de cette dernière manifestation. Elles indiquent toutes une dissociation d’albumine et il fallait s’y attendre, car dans nos essais les processus de dissociation prennent partout une légère prédominance sur la synthèse. Mais nous insistons particulièrement sur le fait que la consommation d’albumine par hydrolyse ou par respiration n’est pas la seule manifestation du métabolisme basal. Quant à la dissociation, il n’est même pas vrai que dans les pellicules appauvries elle prime dans tous les cas sur la synthèse. Weeland et Wille (1932) l’ont démontré pour la levure appauvrie. Ils ont constaté pendant l’appauvrissement une diminution de 10% des composants insolubles du protoplasme et de 50% des hydrates de carbone solubles, mais une augmentation de 100% des lipoïdes. Pendant l’appauvrissement il se produit donc une synthèse de matières grasses. Les auteurs admettent que, dans le cas de la levure, 60% de la diminution totale portent sur la dissociation de l’albumine.
Nous avons, dans le cas de l’Aspergillus, trouvé le plus souvent assez peu d’amino-azote dans l’eau d’appauvrissement; 0,5 mg est un maximum. L’hydrolyse de l’albumine est quantitivement la dissociation la moins importante et le fait que souvent on ne peut constater d’augmentation d’amino-azote dans le liquide extérieur, indique que cette hydrolyse est une manifestation de dissociations locales dans certains filaments du mycélium.
La production d’ammoniac, retrouvé dans l’eau d’appauvrissement, a varié entre 1,5 et 4 milligrammes. Nous n’avons jamais trouvé moins que 1,5 milligrammes. La consommation de l’albumine par respiration est donc une manifestation générale du métabolisme basal pendant l’appauvrissement. Plusieurs facteurs extérieurs tels que l’âge, le milieu alcalin, etc., favorisent la production d’ammoniac. ^ - •
Au cours de l’alimentation aux acides aminés, à condition que la concentration soit élevée, et que les conditions d’existence soient favorables, les quantités d’azote aminé et ammoniacal résultant du métabolisme basal, peuvent être négligées. Mais le métabolisme basal a une grande importance pour l’interprétation des chiffres se rapportant à l’azote, lorsque les concentrations sont faibles comme le montre le tableau 2. On a dans le tableau 7 un exemple de l’influence des conditions d’existence défavorables (manque d’oxygène).
■ ■■- - TABLEAU 2. ; * - x
Influence du métabolisme basal sur la teneur d’ammoniac exprimée en milligrammes. Teneur initiale en acide aspartique 0,4%; volume 37 cc, pH = 5,0; durée de l’expérience 4 heures. Les pellicules de moisissure ont été appauvries pendant 12 heures.
'• ^zote aminé ^ ^ - - Azote ammoniacàl.
Le milieu acide est favorable à l’Aspergillus et, en ce milieu, nous ne trouvons nulle part, ni même aux concentrations les plus faibles, de libération d’amino-azote; d’autre part, aux concentrations les plus faibles (C, D et E), l’ammoniac résulte presque exclusivement du métabolisme basal, tandis qu’aux concentrations élevées le métabolisme basal fournit toujours de l’ammoniac, mais la partie de beaucoup la plus importante provièrit de l’azote aminé.
Du tableau 2 on conclut, que pour le cas des concentrations faibles, la mesure du métabolisme des acides aminés se fait' exclusivement sur les chiffres trouvés pour l’azote aminé; les chiffres trouvés pour l’azote ammoniacal ne sont d’intérêt que pour le seul cas des concentrations élevées.
§ 7. Accumulation et consommation de Vasparagine dans la cellule . • *■ ’* • ■
Le métabolisme basal explique pourquoi on trouve dans le liquide plus d’ammoniac que la quantité correspondant à l’asparagine transformée du liquide. »
Mais il a déjà été dit que nous constatons parfois le contraire; la fraction d’azote qui provient de l’asparagine et' qui est absorbée par le mycélium, bien qu’elle soit faible est nettement supérieure aux limites d’erreurs des méthodes de dosage.
Le tableau 1 illustre ce que nous venons de dire. ” .
Dans quelles conditions le mycélium retient-il de l’azote sous forme organique?
Nous avions tout d’abord cru que ce phénomène ne pouvait se constater que pour les expériences de courte durée, mais lorsque nous eûmes à notre disposition un plus grand nombre
de données expérimentales, nous avons constaté que cette absorption d’azote était fonction, en premier lieu de la concentration.
Azote de l’asparagine retenu par le mycélium dans diverses séries d’expériences. Une expérience „courte” se rapporte à une durée de 4 bernes au plus. Une concentration „élevée” est celle d’une solution d’asparagine à ± 0,5% (35 millièmes de molécule-grammes par litre); pH < 7.
Choix de l’essai
Courte durée
Concentration
élevée
Permanence de l’azote sous forme d’asparagine dans le mycélium
On ne s’attendra guère à ce que la durée, pendant laquelle la moisissure peut retenir de l’azote dans le cas des solutions concentrées, soit très longue. Après 8 à 12 heures nous avons toujours retrouvé, sous forme d’ammoniac, la totalité de cet azote, mais pour les expériences de 4 heures on constate régulièrement une absorption d’azote.
Comment expliquer cela?
Une diminution du métabolisme basal est peu probable; nous y reviendrons au chapitre VI. On peut encore considérer la possibilité de l’assimilation de l’asparagine par le mycélium, ou supposer une simple absorption.
A priori, la synthèse de l’albumine à partir de l’asparagine comme seule source de carbone et d’azote n’est pas probable, car l’Aspergillus alimenté de la sorte prospère très peu, et a toujours besoin de sucre pour son développement. L’hypothèse de l’absorption par perméabilité est plus vraisemblable, car on constate souvent que la perméabilité augmente avec la concentration. Seules des données expérimentales pourront résoudre ce problème.
C’est pourquoi nous avons analysé la pellicule elle-même quant à sa teneur en azote amidé et aminé, et nous avons constaté dans les expériences de 4 heures que, régulièrement, 15 à 20% de l’azote qui avait disparu, a pu être retrouvé dans la pellicule
azote (en mgr.)
sous forme d’azote amidé et aminé. Il est donc clair que l’absorption d’azote par le mycélium résulte d’une accumulation à laquelle ne correspond aucune consommation.
Il importe en outre de savoir si l’accumulation de l’asparagine est de nature permanente, si elle contribue à de réserves nutritives dans le mycélium, ou si elle est temporaire et provoquée par un apport trop brusque et trop considérable.
Cette question peut être résolue en prolongeant la durée de l’action du mycélium sur l’asparagine (voir graphique 6).
Graphique 6.
Teneur en azote de pellicules appauvries après un séjour de 2 à 12 heures sur une solution d’asparagine à 0,5%; pH = 4,7.
Le graphique 6 montre qu’une assimilation complète de l'asparagine qui a pénétré dans les cellules grâce à leur perméabilité n’est pas dès le début possible parce que la capacité maxima de consommation est temporairement dépassée; en effet après 12 heures, les pellicules sont revenues à leurs teneurs originelles, en azote amidé et aminé.
En nous reportant au graphique 6, nous pouvons examiner maintenant aussi si l’accumulation d’asparagine par le mycélium correspond quantitativement à la quantité d’azote qui était disparue de notre solution.
Nos chiffres semblent montrer qu’il n’en est pas ainsi. Nous n’avons jamais trouvé plus de 1 mg. d’azote accumulé et nonconsommé dans le mycélium; la quantité d’azote qui n’est pas retournée dans la solution peut, par contre, atteindre 2 à 3 milligrammes. Une petite quantité d’azote pourrait donc être engagée dans la synthèse de l’albumine. En faveur de cette interprétation plaide également le fait que dans la pellicule l’ammoniac a diminué après 2 heures. On pourrait à ce propos penser que la faible teneur en hydrates de carbone agisse pour limiter la synthèse et y trouver une explication du temps très | court, durant lequel l’ammoniac diminue.
Le graphique 6 nous montre encore qu’il suffit de laisser agir le mycélium durant quatre heures; bien qu’à la fin de cette durée on n’obtienne que 80 à 85% d’azote libéré, ceci ne nous empêche pourtant pas de comparer les vitesses de réaction, effectuées par les mycéliums. On ne dispose jamais de mesures absolues pour les vitesses de réaction dans les matières biologiques.
Les préparations de moisissures ont, outre, l’inconvénient que leurs vitesses — même celles des plus actives — restent encore sensiblement inférieures aux vitesses de réaction in vivo, encore celui d’avoir une vitesse de réaction qui est souvent la vitesse de diffusion et non pas la vitesse de la réaction enzymatique.
Résumons comment nous comprenons les diverses phases du métabolisme: d’abord absorption par perméabilité; l’asparagine qui a pénétré dans la cellule est désamidée et désaminée immédiatement en très grande partie, pour être renvoyée ensuite immédiatement dans la solution sous forme d’ammoniac. Le métabolisme basal y ajoute encore le plus souvent son action. L’hydrolyse de l’albumine n’a lieu qu’incidemment, et cela dans le seul cas de vieilles pellicules. Dans les pellicules jeunes, on observe plutôt des réactions de synthèse que des réactions d’hydrolyse. La synthèse ne pourra devenir importante qu’en présence de sucres dans la solution extérieure.
§ 8. Décomposition de Vasparagine en milieu alcalin .
Au paragraphe 3 nous avons dit que, pour assurer une répartition homogène des matières, le liquide tout entier était secoué à la main à plusieurs reprises. Cette mesure est toujours efficace
pour un essai en milieu acide. Mais il n’est pas exclu que TAspergillus niger placé dans un liquide alcalin rende le milieu localement acide.
L’idée qu’une acidification locale du milieu peut déformer la représentation de la désamination en milieu alcalin, nous l’avons empruntée à une publication de Kluyver et Perquin (1933),; dans laquelle se trouve longuement exposée une critique dé l’emploi courant de pellicules de moisissures pour l’examen du métabolisme. Comme objection principale ces auteurs citent la différence entre le mycélium émergeant et le mycélium immergé et l’irrégularité de la face inférieure de la pellicule de moisis- 1 sure; Cette dernière circonstance donne très facilement lieu à ; des modifications locales de la concentration et du pH de l’as-‘ paragine. ; -
Les auteurs écartent tous les inconvénients signalés par eux en agitant constamment la moisissure dès le début de la culture. Cette méthode rend comparables les résultats de différentes séries de culture, et ils le montrent par le dosage de l’acide kojique.
Nous laissons en suspens la question si cette méthode doit être étendue à toute étude du métabolisme. Il est à remarquer que le mycélium agité acquiert une nature spongieuse et perd le caractère d’une moisissure normale en échange d’une plus grande homogénéité de la pellicule.
Nous croyons pouvoir écarter ces inconvénients en appliquant la méthode des „cultures substituées”. Dans la culture dans le thermostat nous obtenons ainsi nne pellicule normale et pendant l’expérience sur l’amino-acide toutes les variations locales du pH sont évitées par l’agitation.
Pour éviter l’acidification locale, nous avons examiné la désamination en milieu alcalin, au moyen du dispositif opératoire qui permet de déterminer l’absorption d’oxygène pendant le cours d’une réaction. . \.r , . > .
Admettons provisoirement que la consommation d’oxygène constitue une mesure de la désamination. C’est au chapitre VI que nous reviendrons sur cette hypothèse pour la discuter en détail.
La détermination de l’absorption d’oxygène a déjà été décrite au chapitre II. Nous ajouterons quelques détails qui se rap-. portent à l’essai dont il s’agit ici.
Les moisissures ont été cultivées d’abord dans 20 cc de liquide nutritif dans un thermostat, puis appauvries dans une solution-: tampon de phosphate à pH .= 8,8. Une certaine quantité d’acides,.
formés dans la pellicule pendant la culture, est éliminée de cette façon. Après 2 heures le pH de cette „eau d’appauvrissement” a descendu à 8,3. On ajoute ensuite à trois ballons une solution d’acide aspartique à pH = 8,8; à titre de contrôle on a agité deux ballons dans lesquels il n’y avait qu’une solution-tampon de phosphate à pH = 8,8. Le tableau 4 et le graphique 7 indiquent le résultat de cet essai.
Consommation d’oxygène (en cc) en présence et en l’absence de l’acide aspartique (47 mg) dans 10 cc d’une solution-tampon de phosphate à pH = 8,8- Température 22^5°. Pression barométrique: 762 millimètres. Les pellicules sont appauvries pendant 2 heures. Le pH a été rectifié deux fois par de la soude (N/10). Durée de l’essai: 22 heures.
Durée
(minutes)
Essais sur l’amino-acide
Essais-témoins
Moyenne
Moyenne
Total
Quand on compare le total des mesures, effectuées sur les essais contenant l’amino-acide, et le total des mesures, faites sur les témoins, on remarque pour les premiers une différence de 1%, et pour les seconds une différence de 2%. Les différences d’activité des pellicules d’une même série étaient donc très faibles.
A partir des données, contenues dans le tableau 4 et le graphique 7, nous pouvons déduire trois conclusions.
La première conclusion complète ce que nous avons dit de l’effet de l’appauvrissement sur la désamination en milieu alcalin. On se rappellera qu’au paragraphe 4b nous avons laissé sans réponse la question de savoir si l’effet que nous y avons décrit doit être considéré comme un effet maximum. Il ne semble pas en être ainsi.
Dans l’essai représenté par le graphique 7 la pellicule n’a été appauvrie préalablement que pendant 2 heures. Il s’en est suivi que la désamination a été différée encore pendant 9 heures, au
