CHAPITRE H Méthodes

L’étude, du métabolisme. des acides aminés dans les tissus végétaux a été faite au moyen des cinq moisissures suivantes, provenant toutes du Centraal Schimmelbureau de Baam: Aspergillus niger F. Tübingen Schober; Ascochyta pisi Lib.; Cylindrocarpon radiciola Wr.; Fusarium conglutmans Wr. var. callistephi Beach et Mucor racemosus Frs.^ - v —- Lrr --

i Toutes présentent la propriété commune dè pouvoir être cultivées dans une solution nutritive synthétique.. Leurs places dans

la classification botanique sont assez éloignées l’une de l’autre, mais surtout leurs manières de vivre sont très différentes.

Aspergillus niger Fungi imperfecti A )

Ascochyta pisi Fungi imperfecti

(Sphaeropsideae)

Cylindrocarpon rad. Fungi imperfecti

(Hyphomyceti) Fusarium conglutinans Fimgi imperfecti

(Hyphomyceti)

Mucor racemosus Phycomyceti

Saprophyte Parasite de la tige, feuille, racine des pois Parasite des racines de lys.

Parasite des vaisseaux des asters.

Saprophyte

Pour se faire une idée du métabolisme des amino-acides par les moisissures, il est préférable de faire choix d’un petit nombre de moisissures fort différentes plutôt que d’étendre l’étude sur un grand nombre de moisissures plus apparentées. Une grande réserve de chaque moisissure a été préparée par ensemencement dans des tubes de culture. L’Aspergillus, le Fusarium et le Mucor ont formé un très grand nombre de spores sur du malt, le Cylindrocarpon prospéra mieux sur le riz et l’Ascochyta a formé des pycnides jaune-orangé sur des cerises. Nous avons reçu d’abord une souche de Cylindrocarpon dont nous n’avons pu obtenir aucune culture convenable; nous avons reçu ensuite, à titre de comparaison, quatre souches différentes, parmi lesquelles la souche van Hell semble très satisfaisante.

Les spores de ces cultures de moisissures croissent pour former de grandes pellicules d’un seul tenant lorsqu’on ensemence la solution nutritive de Richard, dont la composition suit ici.

40 gr. de saccharose \

10 gr. de glucose 1

10 gr. de N0 3 NH 4 '

5 gr. de P0 4 H 2 K {

2,5 gr. de S0 4 Mg et j une trace de Fe Cl 3 /

dans un litre d’eau ordinaire

Nous avons donc employé la composition usuelle légèrement modifiée en ceci, que 10 gr. de saccharose ont été remplacés par 10 gr. de glucose par précaution, pour le cas où des moisissures n’hydrôlyseraient que lentement le saccharose. En outre, nous

4 ) Souvent on trouvera rAspergillus classifié comme Ascomycète (Plectascinées); néanmoins d’après une recherche consciencieuse de M. v. Ltjyk dans toutes les publications sur ce sujet il n’est pas .certain qu’on n’ait jamais trouvé des ascospores.

avons ajouté dans les cultures d’Aspergillus 50 mg. de sulfate de zinc; l’ion zinc exerce un effet favorable sur le développement de cette moisissure mais gêne celui des autres.

Pour l'ensemencement, nous avons suivi la méthode de Wehlburg (1932). Celui-ci avait obtenu des pellicules plus comparables en ensemençant non pas à partir d’une suspension aqueuse de spores dans l’eau stérile, mais en introduisant les spores directement dans la solution stérilisée. On met 50 cc de cette solution ensemencée dans des flacons d’ERLENMEYER de 100 cc. Les ensemencements et les transplantations du Mucor ont toujours été effectués dans des locaux séparés; cette précaution est necessaire parce que les spores de cette moisissure forment de la poussière avec une facilité extrême et infectent tout d’une manière opiniâtre.

La stérilisation de la solution s’est faite pendant une demi-heure à 106° en autoclave. L’Aspergillus et le Fusarium se développent mieux dans l’obscurité, dans un thermostat, à 27°. Le Cylindrocarpon, le Mucor et l’Ascochyta ont été placés en cercle autour d’une lampe, dans une chambre à température constante (24°), de manière à recevoir tous un éclairement égal (700 lux). L’Ascochyta surtout a besoin de lumière pendant sa croissance. Le Fusarium et le Mucor croissent toujours en-dessous de la surface du liquide. Les trois autres forment aussi du mycélium dans l’air. L’Aspergillus niger forme une pellicule d’un seul tenant après deux jours; pour les autres moisissures une semaine ou plus est nécessaire.

Le métabolisme des amino-acides a été étudié au moyen de pellicules par la méthode des „cultures substituées” de Kostytchev; en d’autres termes, on enlève le liquide nutritif dans lequel toutes sortes de modifications se sont produites et on introduit audessous de la pellicule, au moyen d’une pipette, une solution stérile d’un amino-acide à concentration et pH connus.

Avec l’amino-acide, il y avait toujours dans la solution deux sels: du phosphate monopotassique (concentration N/15) et du sulfate de magnésium (concentration N/20). Pour obtenir une solution d’asparagine d’un pH = 4,5 environ, on a stérilisé l’asparagine en même temps que les sels. Lorsque pour l’essai on voulait employer de l’acide aspartique, on a ajouté de la lessive de soude avant la stérilisation, car le pH aurait été trop bas si on avait ajouté cette lessive après la stérilisation. Il n’est pas possible de stériliser en présence des sels une solution d’acide aspartique rendue alcaline, parce qu’en milieu alcalin l’amino-azote serait détaché. On stérilise donc séparément les sels et l’amino-acide.

On réunit alors les deux solutions et on les amène ensuite au volume et au pH désirés, avec les précautions d’usage.

Dans tous les essais des Chapitres III, IV, V le volume de la solution de l’acide aminé était de 37,05 cc. Les pellicules sont restées sur cette solution pendant la durée fixée pour l’essai; on a ensuite déversé la solution et on a rincé la pellicule à l’eau distillée sur un filtre. On a pu employer à cet effet 10 cc d’eau de lavage à chaque fois, sans qu’il fût jamais nécessaire d’évaporer ensuite la solution. C’est précisément pour éviter l’évaporation qu’on a employé une pipette de moins de 40 cc pour la solution d’amino-acide; après lavage on a complété le liquide à 50 cc avec de l’eau. On a exécuté les dosages de l’azote ammoniacal, amidé et aminé sur une partie de cette solution.

On a dosé l’ammoniac par distillation sous le vide suivant Parnas. On a alcalinisé le liquide au moyen de 20 cc d’une solution saturée de borax pour 10 cc de solution à examiner. On a recueilli l’ammoniac dans de l’acide sulfurique (concentration N/20) et on a titré l’excès d’acide au moyen de soude caustique (concentration N/20).

Après évacuation de l’ammoniac, on a dosé l’azote aminé à l’aide du micro-appareil manométrique de van Slijke (à manomètre fermé). Cette méthode est décrite d’une manière très détaillée dans „Quantitative Clinical Chemistry” (1932) II p. 305 et suivantes; nous avons toujours suivi ces prescriptions, de sorte que nous croyons superflu de donner des détails plus précis.

L’azote amidé a été dosé suivant Sachsse par ébullition de 3 heures, sous un condenseur à reflux avec de l’acide sulfurique normal, suivie d’une distillation de l’ammoniac sous le vide. La teneur en azote amidé correspond à la différence entre cette détermination d’ammoniac et la première, qui avait été effectuée sans hydrolyse. Les écarts moyens des dosages d’ammoniac et d’amino-azote ont été de 2% et ceux des dosages de l’aminoazote de 5%. Tous les dosages ont été exécutés deux fois.

Chaque essai a été fait dans deux flacons d’ERLENMEYER différents qui ont subi tous les deux le même traitement. Les chiffres des tableaux et des graphiques se rapportent tous à l’activité moyenne de ces deux pellicules de moisissures. Au début, le contenu de chacun de ces deux flacons a été analysé séparément, mais après avoir constaté que les écarts entre les deux pellicules ne dépassaient que légèrement l’erreur moyenne des dosages, on a rassemblé les deux solutions après les avoir complétées au volume voulu et on a exécuté en double les déterminations dans le mélange.

La consommation d’oxygène pendant l’alimentation à l’aminoacide, dont il est question surtout au Chapitre VI, a été déterminée volumétriquement. Les flacons employés à cet effet avaient une contenance de 100 cc environ et l’anhydride carbonique dégagé par la respiration a été absorbé par 0,9 cc de lessive de soude à 40 pour cent. Les flacons ont été secoués environ 80 fois par minute dans de l’eau à température constante. Lé changement de volume a été mesuré à pression constante. Pour éviter l’erreur due à la variation barométrique, on a toujours agité un flacon vide témoin, en même temps que les flacons en expérience.

Au Chapitre IV § 3 on décrit des expériences de désamination en l’absence d’oxygène. Pour ces expériences, on a chassé préalablement l’oxygène de la solution d’amino-acide, en faisant passer sans arrêt pendant 10 minutes de l’azote provenant d’une bouteille d’azote comprimé. Mais, comme cet azote est obtenu, par distillation fractionnée à partir d’air liquide, le gaz lui-même n’est pas exempt d’oxygène. Toutefois la quantité d’oxygène qui reste dans cette solution est négligeable. Mais l’azote gazeux au-dessus de la solution d’amino-acide pendant l’expérience, devait préalablement être débarrassé d’oxygène. Dans ce but, on a agité le gaz dans une bouteille de 20 litres, pendant 5 minutes avec 30 gr. de S 2 0 4 Na 2 dissous dans 100 cc de NaOH (Concentration 2N). Cette solution absorbe l’oxygène encore mieux que le pyrogallol. En remplissant d’eau la bouteille, on refoule l’azote gazeux, exempt d’oxygène, dans les flacons d’essai. Cette ma-, noeuvre a été répétée trois fois pour chasser l’air qui se trouvait primitivement dans les flacons. Après la quatrième fois, on a bouché les flacons d’ERLENMEYER au moyen d’un bouchon de. caoutchouc.

On a déterminé le pH au moyen du comparateur Heluge; pour des volumes plus petits, on a obtenu aussi de bons résultats au moyen du micro-comparateur Hellige. On s’est toujours servi, pour les déterminations du pH pendant ou après une expérience, d’un flacon distinct.

Dans les expériences d’une durée dépassant 4 heures, il s’est produit un déplacement vers un pH plus élevé, qu’on a combattu par l’addition d’acide phosphorique (N/10), introduit par une microburette. On a stérilisé la solution d’acide phosphorique, lors de la préparation de la solution-mère, en la faisant bouillir; avant l’addition des gouttes de solution on a stérilisé également la pointe de la microburette par du formol à 4 pour cent.

Pour les dosages de sucre, on a suivi la méthode de Schoorl.

Dans les essais où l’influence des sucres sur la désamination a été examinée, on a toujours employé la glucose comme sucre, de manière qu’une hydrolyse préalable fut superflue. On a admis une erreur moyenne de 2 pour cent sur les dosages. Pour les déterminations d’azote amidé et aminé dans les pellicules de moisissures, on a réduit celles-ci à l’état d’une bouillie extrêmement homogène et fine en les broyant avec du sable quartzeux; on a précipité ensuite les matières albuminoïdes solubles au moyen d’acide phosphotungstique, suivant les indications du livre „Quantitative Clinical Chemistry” II (1932) page 65 de Peters et Van Slijke.

L’asparagine employée provenait de la „Amsterdamsche Chininefabriek”. Cette préparation renferme également de l’acide aspartique, de sorte qu’il y avait toujours en solution plus d’amino-azote que d’amido-azote. C’est pourquoi nous avons toujours dosé séparément l’azote amidé et l’azote aminé dans chaque solution d’asparagine. Tous les chiffres que nous donnons pour la concentration de l’asparagine, doivent être compris comme se rapportant à la concentration de l’azote aminé et amidé.

L’acide aspartique a été fourni par les „British Drug Houses”.

Pour les dosages d’azote aminé on a employé du nitrite de sodium et de l’acide acétique de Kahlbaum. Avant les mesures, faites sur le liquide des cultures, l’ensemble lui-même des solutions de nitrite de sodium et d’acide acétique avait été dosé par rapport à l’azote aminé. Avec les produits de la maison Kahlbaum, les quantités trouvées ont toujours été faibles et bien constantes.

On ne trouve pas d’acide oxalo-acétique dans le commerce. Sur la demande de Monsieur le Professeur Th. Weevers, Monsieur le Professeur A. Szent-Gyorgyi a eu l’amabilité de nous céder une certaine quantité de ce corps, et nous tenons à lui en remercier ici très vivement. Nous exprimons ici également notre gratitude respectueuse à Madame le Professeur J. Westerdijk pour les nombreuses indications utiles qu’elle nous a permis de recueillir au sujet du traitement des moisissures et, en même temps, pour les moisissures et les tubes de culture qu’elle a mis généreusement à notre disposition.