CHAPITRE II

Technique.

Vigrion pe Massaotan. — MÉTHODE DE VACCINATION. — Mope D'EMPLOI DE LA TEINTURE D'OPIUM. — MÉTHODES DE FIXATION ET DE COLORATION DES TISSUS. — ANALYSE DU SANG.

a) Nous avons employé constamment dans nos expériences un vibrion isolé en 1891 à Massaouah par le D' A. Pasquale. Ce dernier a fait parvenir en Europe deux cultures d'origines distinctes : l’une provenait des eaux du puits de Ghinda (localité voisine de Massaouah) ; l'autre dérivait des déjections d’un Européen mort du choléra asiatique; entretenue à l’Institut Pasteur et renforcée par M. Metchnikoff au moyen de passages à travers des cobayes vaccinés, cette dernière a servi à toutes nos recherches.

Ce vibrion de Massaouah est un organisme grêle, légèrement incurvé ou sinueux, mesurant de 2 à 4 4 de long dans les cultures sur gélose. Il se présente souvent sous forme de longs spirilles mesurant jusqu’à 15 et 20 & de longueur; son polymorphisme est remarquable. Dans les cultures âgées il revêt l'aspect de bacilles droits, de cocco-bacilles ou de coccus ; il nous est arrivé deux fois de le rencontrer dans des cultures sur gélose vieilles de 6 et 10 jours sous forme de masses sphériques, de 4 à 5 y de diamètre et munies de 2 à 4 longs flagella. Ce pléomorphisme lui est d’ailleurs commun avec d’autres races de vibrions cholériques.

Le vibrion de Massaouah est très mobile ; il est muni ordinairement à chaque extrémité de deux cils ainsi que l'ont démontré Nicolle et Morax. Il est aérobie et pousse facilement sur le bouillon, la gélose, la gélatine. Il liquéfie la gélatine beaucoup plus rapidement qu'aucune autre race de vibrion cholérique. Il donne lieu à un entonnoir de liquéfaction très large; la liquéfaction se produit jusqu'au fond de la

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piqûre; sur les plaques il forme également des entonnoirs d'une grande largeur. Enfin il se développe bien sur pomme de terre, à 15°, tandis que le bacille-virgule de Koch y pousse malaisément et cela à partir de 30° seulement.

Le vibrion de Massaouah produit de l’indol dans un milieu peptonisé. Si on le cultive dans le liquide suivant :

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il suffit d'y ajouter au bout de 12 à 24 heures de l'acide sulfurique concentré pour obtenir la réaction rouge caractéristique. Sa virulence est extrême ; un cobaye adulte succombe en 12 ou 15 heures à une injection péritonéale de 1/40 de culture fraîche sur gélose ; 1/8 de cette culture suflit pour le tuer en injection sous-cutanée ; mais il résiste à une injection intra-stomacale d'une culture entière, après alcalinisation de l'estomac. Ce vibrion est également pathogène pour le pigeon et le lapin ; il conserve longtemps sa virulence dans les cultures.

b) Dans nos expériences entreprises sur le cobaye en vue d'étudier les rapports qui s'établissent entre l'organisme envahisseur et l’organisme envahi, nous nous sommes servi alternativement d'animaux normaux et d'animaux vaccinés.

L'immunité la plus solide est celle qui s'obtient par l'injection de virus vivant. Ce fait connu depuis longtemps a été bien établi par Klemperer. D'autre part, la voie intrapéritonéale est plus sûre et plus rapide que la voie sous-cutanée. Nos cobayes ont donc été vaccinés au moyen d'injections intrapéritonéales de vibrions vivants.

Le vibrion de Massaouah est d'une virulence extraordinaire, En général 1/40 de culture fraiche sur gélose représente la dose mortelle minimale. On trouve cependant parfois des cobayes tellement sensibles qu'ils succombent à des doses encore plus faibles. Il vaut donc mieux faire précéder la première inoeulation de virus vivant, par une injection de cultures chauffées, ce qui confère déjà un certain degré d'immunité. Nous savons aujourd'hui que les cultures du vibrion cholérique peuvent être chauflées à 100° sans que pour cela la toxine soit détruite (Ch. Sluyts).

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Voici donc notre façon de procéder :

1° On chauffe à 100° pendant cinq minutes une émulsion d'une culture fraiche sur gélose dans 15 c.c. de bouillon. On injecte dans le péritoine d'un cobaye 1 c.c. du liquide, ce qui représente 1/15 de culture chauffée. Cette injection est suivie en général d’une légère élévation de la température rectale ; celle-ci tombe ensuite de 1 à 2 degrés au-dessous de la normale, se relève, et cette courte maladie dure de six à douze heures. Jamais nous n'avons vu de cobaye succomber à des doses aussi faibles.

2° Huit jours plus tard on injecte dans le péritoine 1 c.c. d'une émulsion d'une culture fraîche sur gélose dans 30 c.c. de bouillon stérilisé, ce qui représente 1/30 de culture. Puis, successivement, à des intervalles de huit jours, on injecte 1/20, 1/15, 1/10, 1/5 de culture. À ce moment le cobaye est vacciné contre des doses énormes de virus vivant et l'injection de ce virus ne s'accompagne plus d'aucune élévation de température. Il est rare au contraire que la température ne s'abaisse pas de 1 ou 2 degrés pendant 3 à 4 heures. Ce fait indique que, malgré la vaccination, l'animal est resté sensible à la toxine.

Il est nécessaire de laisser huit jours entre deux injections successives, sinon les effets toxiques s'accumulent et l'animal peut succomber. Il est indispensable également de ne pas attendre trop longtemps après la dernière injection vaccinale pour expérimenter sur l'animal immunisé. Au bout de 3 ou 4 mois, en effet, l'immunité

acquise est déjà affaiblie.

c) Pour provoquer chez les cobayes le choléra expérimental, nous nous sommes servi de la méthode indiquée par Koch : Alcalinisation de l'estomac au moyen de 5 c.c. d’une solution à 5 p. 100 de bicarbonate de soude, injection de teinture d'opium dans le péritoine, puis injection dans l'estomac de vibrions cholériques en émulsion dans 5 c.c. de bouillon stérilisé. Koch injecte 1 c.c. de teinture d'opium pour 200 gr. d'animal. Remarquons ici que la teinture du Codex français est plus active que celle de la pharmacopée allemande; 20 gouttes delateinture allemande renfermentles éléments solubles de 0,1 d'opium brut; le même volume de teinture française contient 0,16 d’opium. Il faudrait donc, d'après cela, injecter 1 c c..de teinture française pour 320 gr. d'animal. Des expériences faites sur des cobayes neufs nous