LE TOB

ayant montré que 1 c.c. pour 300 gr. d'animal, détermine une narcose qui dure de 1 heure et demie à 2 heures et demie, la proportion 1/300 est celle que nous avons adoptée.

d) Nous nous sommes servi le plus souvent, pour fixer les pièces anatomiques destinées à être coupées, de la solution suivante :

ISBichlorute de MeLCULC AE PRSMRR PT PR PRE CTnPE is) Chlorure de sodium......... SC SN A 7

La solution saturée de sublimé additionnée d’acide acétique donne des fixations nucléaires encore plus précises ; mais elle est inférieure à la première au point de vue de la coloration ultérieure des vibrions.

Nous nous sommes également servi souvent du mélange recommandé par Nikiforoff pour la coloration des spirilles de la fièvre récurrente :

II. Solution saturée de bichlorure de mercure dans le sérum artificiel. } . Solution de bichromate de potasse à 5 p. 100 .................. )

Cette seconde solution donne des fixations nucléaires moins bonnes que I, mais elle a l'avantage de moins mordancer les tissus et de permettre une différenciation plus grande après l'emploi des couleurs d’aniline basiques.

Au bout de 2 à 3 heures, les fragments d’intestin, de foie, de rate ou de rein traités par cette méthode sont complètement pénétrés. Il est nécessaire cependant de les laisser séjourner plus longtemps dans le liquide fixateur (de 12 à 24 heures); nous verrons en effet plus loin combien le vibrion cholérique est difficile à bien colorer dans les coupes; or, nous avons toujours observé que la coloration obtenue après un séjour prolongé dans la solution de sublimé était infiniment plus intense que danse le cas contraire.

Le bichlorure de mercure est un fixateur de premier ordre pour les tissus; il est de plus le fixateur de choix pour les pièces contenant des bacilles virgules : ceux-ci se colorent toujours avec beaucoup moins d'intensité lorsque les morceaux d'organes ont été fixés dans l'alcool à 90°, dans le liquide d'Altmann (solution à 3 p. 100 d'acide nitrique) ou dans le liquide de Kleinenberg. L'alcool dont on se sert couramment dans les services hospitaliers, pour fixer les pièces provenant

des cadavres cholériques, est le plus mauvais des fixateurs connus et ce traitement rend bien dificile souvent l'étude des rapports qui s’établissent entre les cellules et les vibrions.

Les pièces, en sortant du sublimé, doivent être immédiatement plongées dans l'alcool à 70°; il est tout à fait inutile de les laver auparavant à l'eau, pratique cependant bien répandue : les dépôts d'albuminates mercuriques qui peuvent s'être formés dans les tissus, sont infiniment plus solubles dans l'alcool que dans l’eau. Si l'on a employé le mélange de Nikiforoff, il convient de renouveler fréquemment l'alcool qui rapidement se teinte en jaune.

Après un séjour de 24 heures dans l'alcool à 700, les pièces sont portées successivement dans l'alcool à 90° (24 heures), puis dans l'alcool absolu que l’on renouvelle 2 fois (24 heures). Il ne faut pas que l’ensemble du séjour dans l’alcool dépasse trois fois 24 heures ; sinon les pièces deviennent cassantes. De l'alcool absolu on les plonge directement dans le xylol que l’on renouvelle deux fois (24 heures) ; puis dans un mélange à parties égales de paraffine et de xylol (24 heures) : enfin dans la parafline (24 heures). Le point de fusibilité de la parafline employée doit dépasser d'environ 28°, la température du laboratoire au moment où l’on fait les coupes.

Il est indispensable que les coupes soient aussi minces que possible si l’on veut bien saisir les rapports qui existent entre les vibrions et les tissus. Leur épaisseur ne doit pas être supérieure à 1/200e de millimètre.

Ces coupes sont collées sur le porte-objet au moyen de l'albumine glycérinée de Mayer ; la parafline est dissoute au moyen du xylol ; celui-ci enlevé par l'alcool absolu. La préparation est ainsi prûte à être colorée.

e) Le vibrion cholérique est difficile à bien colorer dans les coupes. Cet organisme, en effet, se décolore avec une grande rapidité après l’action de l'alcool. Aussi toutes les méthodes employées jusqu'ici ontelles consisté à surcolorer les préparations. De cette façon, on arrive, il est vrai, à bien mettre les vibrions en évidence et à déterminer grossièrement leur répartition dans la paroi intestinale ; mais il est impossible, vu l’état de surcoloration des tissus, d'établir les rapports intimes existant entre les microbes pathogènes et les cellules. Cela

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est surtout vrai pour l'intestin où l'abondance des éléments cellulaires qui infiltrent la paroi rend toute étude précise impossible.

Si, par exemple, on colore avec une solution de violet 6B une préparation sur lamelle de liquide intestinal, puis que l’on déshydrate à l'alcool, les vibrions cholériques seuls se décolorent, tandis que les autres microbes restent fortement teintés. Ce fait prouve combien il est difficile de conserver aux bacilles virgules leur coloration sur des coupes déshydratées.

Voici les principales méthodes anciennementemployées dans ce but:

Koch laissait les coupes dans une solution aqueuse forte de bleu de méthylène, pendant 24 heures à froid, pendant un temps beaucoup plus court à chaud. Il lavait à l'eau, déshydratait à l'alcool, éclaircissait par l'essence de girofle et montait dans le baume de Canada.

Babès : Les coupes séjournent 24 heures dans une solution aqueuse de fuchsine anilinée et faiblement alcalinisée ; lavage à l’eau légèrement acidulée ou dans la solution à 1/1000 de bichlorure de mercure. Alcool absolu, essence de girofle, baume de Canada. ;

Doyen: Colorer une demi-heure à 45° avec une solution concentrée de violet 6 B. De là, porter les coupes dans une solution à 1/100 de sublimé pendant une minute; alcool absolu, essence de girofle, baume.

Kühne : Colorer pendant trois minutes avec la solution suivante :

Bléusde: MméL VIONn AE ER re 1,50 gr.

ANCOO A DSOIURE AREA EE TE A CRAN ARE RARE ATOTIC:Ce Eau phéniquée à 5 0/0.....,..... PACE ET A QE 100 c.c.

Laver à l'eau ; puis passer dans une solution très légèrement acidulée jusqu’à ce que la coupe soit transparente ; plonger ensuite dans un bain de carbonate de lithine et déshydrater au moyen d'alcool absolu coloré par le bleu de méthylène ; éclaircir dans de l'huile d'aniline également colorée en bleu ; passer très rapidement dans l’aniline pure et monter au baume.

Lôffler : Colorer pendant quelques minutes dans la solution suivante :

Solution alcoolique saturée de bleu de méthylène. .... 390.0. Solution de potasse à 1/1000....... AO TN PES D RER 100 c.c.

Déshydrater à l'alcool absolu, éclaircir à l'essence de cèdre, monter au baume.

Nous avons indiqué plus haut les inconvénients inhérents à ces méthodes. Il s'agissait donc de trouver un procédé qui permit de colorer énergiquement les vibrions, tout en ne surcolorant pas les tissus.

La méthode imaginée par M. Nicolle, pour les micro-organismes ne prenant pas le Gram, constitue un progrès considérable dans ce sens. On colore les coupes pendant deux minutes dans le mélange suivant :

ECS CC ARE NRA NE PER A ee 57 O gr. 5 RUN NO NT ARRET SP ANR EEE CS 10 gr.

Faire dissoudre, puis ajouter peu à peu :

ATTAQUE RE AREA Re PE d Man P es, Mens QUE FE ENS 1 EIRE ER SP DER EP RE TS 100 gr.

On lave à l’eau, puis on laisse la coupe colorée en contact pendant vingt secondes avec la solution suivante :

Mannin atléthers 1,7. ST CL à ARTE A DE ARS 1 gr. RATES AUD EMRR TERRE NT RE me NUE à 00) 10 gr.

On lave à l’eau ; puis on déshydrate à l'alcool absolu, on fait agir le xylol et l’on monte dans le baume.

Le tannin possède, en effet, la propriété d' ERA NET le bleu de méthylène fixé sur les tissus et l’on peut alors laver à l'alcool sans crainte de voir la préparation se décolorer.

Certains auteurs ont prétendu que la solution tannique décolorait les coupes. C’est là une erreur qui provient de ce que la solution employée. était impure ou vieille. En effet, le tannin se transforme peu à peu en acide gallique, grâce à une lente hydratation provoquée par une moississure (aspergillus niger). Cet aspergillus, sous forme de mycélium, préexiste dans les galles de Chine (les plus employées dans la fabrication du tannin) en sorte que les tannins frais contiennent toujours une faible proportion d'acide gallique ; la formation de cet acide devient rapide et abondante dans la solution aqueuse de tannin qui alors décolore en effet les préparations. Il suffit, pour éviter cet inconvénient, de détruire le ferment acidifiant soit en faisant bouillir la solution, soit en y ajoutant un cristal de camphre ou de naphtol.

Il faut se garder, après l'alcool absolu, d'employer l'essence de girofle, agent réducteur puissant, dont quelques traces se mélangent toujours au baume et finissent par faire pälir les coupes.