CHAPITRE II

Le ‘Phénomène de Zone” dans la Précipitation

La notion du rôle joué par l’élément quantitatif dans les résultats de la réaction de précipitation est ancienne. Et bien avant de songer à la qualité même du phénomène et à sa signification, il fallut introduire dans son étude les notions de poids et de mesure.

Déjà, BorpEr (2) avait trouvé que la rapidité et l'importance de la réaction dépendent beaucoup des proportions des deux sérums que l’on met en présence; en général, il faut plus de sérum précipitant que de sérum précipitable. Aïnsi pour le sérum qu’il étudiait en 1899 (sérum de lapin immunisé contre le sang de poule), BORDET trouve que les doses optimales étaient de 1 à 2 parties de sérum de poule pour 8 à 10 parties d’immunsérum. C'était là un ‘premier pas dans le domaine de l’appréciation des doses de com-

Le plexes qui entrent en jeu, et un résultat approximatif peu rigoureux évidemment, mais dont l'indication est définitive quant au sens général de la réaction, ainsi que nous le verrons par la suite. ê

En 1901, L. Camus (5) dans un travail sur la production de la fibrinolyse et la démonstration de l’existence de la solubilisation de la fibrine, entrevoit le même phénomène. Pour résoudre la question complexe de l’histolyse, il recherche une substance simple et définie du plasma et le sérum sysant cette substance. Pour cela, il se servait de la fibrine d’une espèce animale qu’il injectait à une autre et déterminait chez le récepteur immunisé la formation d’un antisé- rum pour la substance qui avait servi à l'expérience. Ce n’est pas l’expérience elle-même qui nous apparait intéressante, mais les remarques très précises qu’elle comporte.

« Je crois important, dit CAMUS, dans une note adjacente au rapport, d'attirer l’attention sur la façon de faire la réaction, car on pourrait, dans certaines conditions, méconnaître complètement une réaction positive. Il est toujours avantageux de mettre en contact une grande quantité de sérum de l’animal immunisé (précipitine de notre terminologie) avec une petite quantité du liquide à étudier (précipitogène). J'emploie habituellement un centimètre cube de sérum de l’animal immunisé pour 0 cm3 05 de solution de fibrine ou de sérum normal », et plus loin: « Si au lieu d'opérer comme je viens de l'indiquer, on renverse les proportions, c’est-à-dire si on prend 1 cm3 de sérum de chien et 0 cm3 05 de sérum d’immunisé

on n’observe pas le plus léger louche même après 24 heures ».

Les remarques de Camus, ses indications sur la marche à suivre pour obtenir une bonne réaction de précipitation, nette, précise par le mélange d’un sérum et de son anti-sérum sont fondamentales. Pour la première fois, un auteur écrit sans ambiguité aucune qu’un excès de sérum à précipiter (précipitogène) entrave, gêne l’action du sérum précipitant (précipitine) et s'oppose à la précipitation. E

Mais ce n’est pas assez. Le principe est posé, nettement établi, l’ordre des faits est irrémédiablement déterminé. Il manque cependant une estimation plus exacte des proportions à mettre en jeu des deux sérums antagonistes. Le mérite de montrer jusqu’à quelles valeurs extraordniairement réduites on pouvait pousser la quantité de sérum à précipiter sans faire disparaître son rôle évidemment essentiel pour l'obtention du phénomène, revient à LINOSSIER et LE- MOINE (19). Avec ces auteurs, nous approchons la rigueur mathématique et l'énoncé sous une forme de rapports volumétriques des résultats qu’ils ont pu obtenir nous fait pleinement percevoir la sensibilité de leurs expériences à coup sûr définitives.

Dans une première note (25 janvier 1902), ces auteurs s’expriment ainsi : « Si on étudie les proportions des deux.sérums qui entrent en réaction on constate qu’il est impossible de réaliser un mélange tel que les deux constituants du précipité albumineux disparaissent du liquide en se combinant : si dans une série de tubes on ajoute à un volume déterminé de sé-

rum précipitable dilué des quantités progressives de sérum actif et si après précipitation on étudie les propriétés du liquide décanté, on constate que dans les premiers tubes il existe un excès de substance précipitable; le liquide est troublé par une goutte de sérum actif et non par une goutte de sérum précipitable. Dans les tubes suivants qui ont reçu plus de sérum actif le liquide clair surnageant le précipité renferme à la fois un excès de précipitine et un excès de substance précipitable, si bien qu’il peut être également troublé par une goutte de sérum précipitable ou une goutte de sérum actif. Ce n’est que dans les derniers tubes où le sérum actif est en très grand excès que toute la substance précipitable paraît précipitée.

En d’autres termes, quand on met en contact de la précipitine et de la substance précipitable en proportions à peu près équivalentes, une partie seulement se sépare à l’état de combinaison insoluble. Entre les proportions des deux substances qui restent en dissolution dans le liquide, il s’établit un état d'équilibre qui peut être rompu par addition d’un excès soit de l’un soit de l’autre des corps réagissant. Une nouvelle précipitation est le résultat de cette rupture d’équilibre », et plus loin :

« I résulte de cette constatation une conclusion pratique importante : c’est que, pour rechercher des traces d’albumine, il faut employer un grand excès de précipitine et réciproquement. Reste à apprécier quel doit être cet excès : sur ce point, nos appréciations ne sauraient avoir qu'un caractère contingent. En effet, les sérums actifs sont d'activité variable, et l’on ne

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peut conclure légitimement de l’un à l’autre. Toutefois, nous pouvons dire que les sérums les plus riches en précipitine que nous ayons obtenus sont bien loin de séparer la substance précipitable du volume égal du sérumi correspondant.

Pour donner par un chiffre une idée de leur pouvoir précipitant, 25 parties d’un sérum de lapin très actif vis-à-vis du sérum humain étaient tout à fait dépouillés de leur précipitine par une partie de sérum humain, tandis que 200 à 300 volumes de ce sérum actif étaient nécessaires pour insolubiliser complètement la substance précipitable d’un volume de sérum humain.

Pour transporter ces chiffres dans la pratique et en supposant que l’albumine à rechercher soit celle du sérum, il faudra pour être sûr de précipiter entièrement cette albumine ajouter au liquide dans lequel on la recherche une quantité de sérum actif égale à 3.000 à 4.000 fosi le poids présumé de l’albumine. Pour rechercher la précipitine, il suffira au contraire d'ajouter au sérum actif, 1/25° de son poids de sérum précipitable, ou 1/300° d’albumine. »

Ce rappel est évidemment très long, mais nécessaire en raison de l'intérêt de ce travail et de sa priorité. Nous y voyons étudié points par points et développé avec une abondance de détails qui en rend la lecture excessivement aisée le phénomène de la précipitation avec la part respective prise par l’un et par l’autre constituants. Pour la première fois, en termes nets parce que définis en volumes et proportions numériques de telle sorte que notre esprit indécis puisse éta-

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blir un raisonnement clair sur des données solides, nous avons l'interprétation du phénomène de la précipitation. Il serait dangereux d’oublier le texte sans fausser les résultats de ces deux auteurs : toujours nous aurons à nous souvenir que ces « appréciations

ne sauraient avoir qu’un caractère contingent ».

- Sur le terrain extraordinairement incertain et mouvant des réactions entre sérums, c’est évidemment là

une rigueur suffisante.

A la suite de cette étude très poussée des interréactions dans les sérums précipitants, se dégage une notion définitive : un excès de sérum à précipiter — précipitogène — gêne la réaction et s’oppose à la formation du précipité. Le précipité est d’autant plus rapidement formé que le sérum précipitable est plus dilué et que le sérum précipitant est plus abondant. Il est à peu près exclusivement donné par le sérum précipitant. Cette action empêchante de l’antigène dont la connaissance et l’étude approximative sont donc de date ancienne a été rencontrée surtout au cours de recherches sur le phénomène de la précipitation et nommé ici « phénomène de zone », ailleurs « phénomène paradoxal », tantôt dans l’étude systématique de l’action du sérum précipitant sur le sérum à précipiter; tantôt, au contraire, sans recherche précise — et ce phénomène d'inhibition de la précipitation venait se greffer sur une expérience en cours troublant paradoxalement des résultats prévus et qu’on estimait devoir se faire dans un sens déterminé,

BALTHAZARD (1), dans sa thèse : Toxine et antitoxine typhiques (Paris 1903), étudiant les produits développés dans l’organisme du lapin à la suite d’injections intrapéritonéales de bouillon filtré de bacilles d’Eberth conclut à la formation d’une précipitine spécifique — et il ajoute: « C’est par le mélange de 10 gouttes de sérum et de 1 goutte de bouillon que le précipité est le plus abondant ».

Léonord MicHaELis (21) (1903) note que Paction sur un sérum d’une précipitine spécifique peut être empêchée par divers agents. Toute solution d’albumine un peu concentrée ralentit la formation du précipité et en empêche même le dépôt si la masse qu’il devait former est un peu importante. Et surtout un excès de substance précipitable est capable d'empêcher la formation du précipité. Un excès de précipitine, au contraire, n’a aucune action sur la réaction.

OBERMAYER et E.-P. Pick (25) (1903) étudient la formation d’anticorps dans l’organisme du lapin par l’injection de sérum de bœuf. Ils rééditent en somme une expérience banale de précipitation et constatent eux aussi que le sérum de bœuf doit être convenablement dilué pour que la réaction soit nette et complète : trop concentré le sérum de bœuf est précipité incomplètement ou même pas du tout par l’immunsérum.

H. VALLÉE (Alfort) et Nicoras (Toulouse) (34) (1903), au cours de recherches sur les séro-précipitines et sur les musculo-précipitines chez le bœuf remarquent que la réaction précipitante est d'autant plus nette que la dose de sérum employée se rapproche de la dose mi-

nima titrée à l’avance,

Roper (30) (1906), cherchant à vérifier les travaux de Moll sur la constitution du floculat dans la réaction de précipitation, a établi les faits suivants : « Pour de grandes quantités d’antisérum (20-200) ajoutées à une même quantité de sérum, le précipité croît avec la quantité d’antisérum. Pour des quantités de sérum (5-1) ajoutées à une même quantité d’antisérum (10), le précipité augmente quand la quantité de sérum décroît », et plus loin : « En abaïissant encore la dose de sérum ajoutée à la même quantité d’antisérum, on voit que la masse du précipité passe par un maximum puis diminue mais seulement avec une grande lenteur. On a, par exemple, maximum de précipité dans une expérience pour antisérum 10+sérum 0,5, le poids du précipité pour antisérum 10+sérum 0,01 n’est qu'environ 2,7 fois plus petit ».

BALTHAZARD (1 bis) (1906), dans son Précis de médecine légale, tient compte également des proportions respectives de sérum et d’antisérum et recommande d’ « ajouter à une grande quantité d’antisérum, 5 cm$ par exemple, quelques gouttes de sérum dont on veut déterminer la nature ».

FLEISCHMANN et MicHAELIS (12) (1907) énoncent un certain nombre de lois qui régissent la formation des précipités par action d’une précipitine sur un précipitogène. Ces lois ont une importance considérable. Nous les rapportons plus loin. Leur exactitude semble bien établie.

D. A. WELsa et H. G. CHAPMAN (36) (1907) déclarent eux aussi Comme suite à leurs expériences que, dans

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la réaction de précipitation, la source principale de la substance précipitable est non pas dans le protoïde « précipité » mais dans le sérum « précipitant » l’optimum de précipitation est obtenu pour un certain rapport des poids de protoïde et d’antisérum (1 de sérum sec+200 d’antisérum sec de lapin). Si on laisse constante la quantité d’antisérum, on diminue le précipité si on augmente la quantité de sérum. — Ces résultats ne nous étaient pas tout à fait inconnus.

Les remarques d’Oscar DEMEES (8) (1907) sur les réactions entre antiglobulines et globulines, antisérums et sérums nous conduisent aux mêmes conclusions. |

Un an après (1908), WELsH et CHAPMAN (36 bis) complètent leurs premières observations en introduisant plus de rigueur encore dans leurs résultats. Ils trouvaient que 2 mmgr. 5 d’albumine d’œuf peuvent, par addition de 19 cm3 d’antisérum, donner 18 mmgr. de précipiét (bien lavé et séché), et 1 mmgr. seulement de la même albumine additionné trois fois d’une quantité totale de 52 cm3 du même antisérum peut fournir en tout 25 mmgr. 9 de précipité, soit 26 fois son propre poids.

JOUSSET (17), en 1910, note lui aussi dans un travail

sur le sérum antituberculeux et le précipito-diagnostic de la tuberculose les variations que doivent subir les doses en présence pour changer la quantité du précipité obtenu. « Si à partir d’un certain moment la proportion de sérum croît, le volume du précipité diminue comme s’il y avait redissolution secondaire. »

Plus récemment, M. NicoLe, CESARI et DEBAINS (24)

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(1920) publient une étude sur la précipitation mutuelle des anticorps et des antigènes. « Pour titrer un anticorps il faut en faire agir des doses décroissantes sur une quantité fixe d’antigène; pour titrer un antigène, on se comporte inversement. Rien de plus évident. Mais dans les réactions de précipitines, tout se passe, disent les auteurs, comme si l’antigène précipitait l’anticorps; aussi, pour titrer l’anticorps font-ils agir sur une quantité fixe de celui-ci des quantités croissantes d’antigène.

L'existence du phénomène de zone semble se manifester au cours des réactions de floculation de la syphilis. VERNES (37) a cherché avec le plus grand soin ces variations de floculation des sérums normaux et syphilitiques en fonction des quantités relatives de réactifs en présence. En présence d’une suspension colloïdale ou organique, la floculation du sérum normal est représentée par une courbe passant par un minimum pour une concentration maxima de la suspension, par un maximum pour une concentration intermédiaire puis décroissant pour revenir à zéro au fur et à mesure qu'on diminue la quantité de suspension introduite dans la réaction. Même aspect de la courbe syphilitique qui apparaît simplement décalée par rapport à la courbe du sérum normal.

Eugène-L. OPtE (26) (1923) rapporte à son tour l’action empêchante d’un excès d’antigène, Pour un volume donné d’antigène, le précipité est abondant au maximum pour des volumes de sérum plusieurs centaines de fois plus grands — la valeur de chaque antigène déterminant la valeur de la réaction,

R. BRUYNOGKE (3) (1924), étudiant un sérum chauffé à 100° ou 120°, constate qu’il n’est plus précipité par la précipitine spécifique du sérum non chauffé, bien que cette précipitine puisse encore servir à le caractériser, car il conserve la propriété d'empêcher, lorsqu'il est ajouté en excès à du sérum frais, la précipitation de ce dernier. |

La même année, R. Douris et RiICARDONI (9), dans un travail d'ordre général sur le titrage des sérums précipitants, recherchent la limite de la sensibilité de la réaction. Sur une quantité fixe d’antisérum, ils font agir des quantités décroissantes d’antigène et constatent que la précipitation n’est nullement en rapport avec la quantité d’antigène. Un graphique très explicite montre que la quantité de précipité tend vers zéro lorsque l’antigène croît.

Monpant, Douris et BECK (22) (1927), traitant des phénomènes de précipitation au sujet du sérodiagnostic du cancer, notent eux aussi le phénomène paradoxal et l’action empêchante d’un excès de substance albuminoïde. Douris énonce la loi suivante : « Lorsqu’au cours d’une réaction biologique nous avons production d’un précipité dans la composition duquel entrent des matières albuminoïdes, le précipité formé ou le floculat disparaît sous l’action d’un des constituants qui lui ont donné naissance. »

Ajoutons encore que MM. LE BouRDELLES et LIÉGEOIS (18) ont signalé le phénomène de zone dans une note récente consacrée à la sérofloculation du paludisme.

Enfin, WELLS (35), dans son ouvrage « Les aspects

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chimiques de l’immunité », traite lui aussi de cette question éminemment complexe de la précipitation. C’est par cet auteur qu’il était nécessaire de terminer l’énumération évidemment succincte de tous ceux qui ont étudié ou simplement relaté le phénomène de zone. WELLS l’aborde de front et son étude, quoique incomplète, pose nettement le problème. Avec lui, il nous est permis de conclure : on entend par phénomène de zone, ou précipitation paradoxale, une réaction qui, mettant en présence une substance précipitante (précipitine) d’une autre à précipiter (précipitogène), aboutit à la production d’un précipité dont les caractères varient avec les doses des substances employées. Dans tous les cas où le précipitogène est en excès, il gêne et s’oppose à la formation du précipité. La précipitine, au contraire, favorise sa production et semble même prendre une part extraordinairement active quant à la quantité de précipité obtenue.

Avec ces deux éléments variables il est aisé de réaliser un système de combinaisons qui illustreront ces données élémentaires :

a) Dans une série de tubes à essais renfermant une quantité constante d’antisérum, on ajoute des quantités progressivement croissantes de sérum: le précipité faible au début disparaît peu à peu, puis tend vers Zéro.

b) Dans une deuxième série de tubes, on place des quantités constantes de sérum. On fait croître les quantités d’antisérum, ajoutées régulièrement. Le précipité obtenu est de plus en plus abondant. Il suit une progression croissante, rigoureusement uniforme et

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la courbe représentative de sa masse est une droite comme dans un titrage.

Enfin, si dans une troisième expérience, à des doses progressivement croissantes d’antisérum, on ajoute des quantités progressivement décroissantes de sérum de telle sorte qu'aux extrêmes une dose maxima de sérum soit portée au contact d’une dose minima d’antisérum, tandis qu’'inversement une quantité maxima d’antisérum agit sur une autre minima de sérum, le précipité obtenu, nul à l’origine, naît, puis croit peu à peu jusqu’à atteindre un volume maximum pour les derniers tubes de l’expérience.

FLEISCHMANN et MicHAELIS ont énoncé sur ce phénomène les trois lois suivantes :

1° Pour une quantité donnée de précipitogène la masse de précipité est proportionnelle à la quantité de précipitine.

2° Si on ajoute à une quantité donnée de précipitine des quantités progressives de précipitogène, la masse de précipité obtenue croît d’abord proportionnellement puis décroit et tend vers zéro pour un certain excès de précipitogène. Ce phénomène est connu sous le nom de « phénomène de zone ».

3° Pour des quantités constantes des deux réactifs, la quantité de précipité obtenue est inversement proportionnelle au volume de liquide utilisé dans la réaction.